MiR‑214 облекчава предизвиканото от сепсис остро бъбречно увреждане чрез PTEN/AKT/mTOR-регулирана аутофагия
Feb 28, 2022
Резюме. Предишни проучвания предполагат, че оксидативният стрес и автофагията водят до остърувреждане на бъбреците (AKI) по време на сепсис и микроРНК (miR)-214 играе жизненоважна роля в защитата набъбрециподложени на оксидативен стрес. Настоящото проучване имаше за цел да провери дали повторната защита на miR-214 е свързана с аутофагията при сепсис. Ролята на аутофагията е изследвана в миши модел на лигиране и пункция на цекума (CLP). Количествената полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (RT-qPCR) беше използвана за анализиране на експресията на miR-214. Структурата и функцията набъбрецисъбрани от мишките бяха оценени.БъбрекНивата на автофагия бяха открити с имунохистохимично, имунофлуоресцентно и Western blotting. Установено е, че miR-214 може да облекчи AKI при септични мишки чрез инхибиране на нивото набъбрекавтофагия. Освен това miR-214 инхибира аутофагията чрез заглушаване на експресията на PTEN вбъбректъкани на септични мишки. Тези констатации показват, че miR-214 подобрява CLP-индуцираната AKI чрез намаляване на оксидативния стрес и инхибиране на автофагията чрез регулиране на пътя PTEN/AKT/mTOR.
Ключови думи:микроРНК-214, сепсис, остро бъбречно увреждане, автофагия, бъбречна
Въведение остърувреждане на бъбреците(AKI) е едно от най-честите усложнения на сепсиса и се среща при 40-50 процента от септичните пациенти, като смъртността достига до 60 процента (1). Патогенезата на индуцираната от сепсис AKI обаче остава неясна. Съобщава се, че автофагията играе ключова роля в индуцираната от сепсис ОПП и инхибирането на аутофагията води до развитие на ОПП по време на сепсис (2,3). Предишни проучвания (4, 5) потвърдиха, че сепсисът предизвиква автофагия в множество органи, включителнобъбрек(6) и автофагичните процеси участват в отстраняването на увредените митохондрии и оксидативния стрес (7). Въпреки това, прекомерната автофагия може да причини нежелана и вредна клетъчна смърт (8). Следователно, умереното ниво на аутофагия е ключът към намаляване на предизвиканата от сепсис AKI. Предишни проучвания съобщават, че miR-214 подобрява индуцираната от исхемия-реперфузия AKI чрез инхибиране на апоптозата (9) и miR-214 потиска оксидативния стрес при диабетна нефропатия чрез сигналния път на реактивните кислородни видове (ROS)/AKT/mTOR (10). Настоящото проучване установи, че miR-214 може да смекчи индуцираната от сепсис миокардна дисфункция при мишки чрез инхибиране на автофагията (11). Въпреки това остава да бъде изяснено дали miR-214 може да подобри индуцираната от сепсис AKI. В настоящото проучване се предполага, че miR-214 отслабва CLP-индуцираната AKI чрез намаляване на оксидативния стрес и инхибиране на аутофагията чрез регулиране на пътя PTEN/AKT/mTOR.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНО/БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ
Материали и методи
Животни.Общо 100 мъжки мишки Kunming (тегло, 20, 40 ± 2, 92 g; възраст, 6-8 седмици), доставени от Центъра за медицински лабораторни животни на Медицинския университет в Хъбей (Шидзяджуан, Китай), бяха използвани в настоящото изследване. Всички мишки бяха аклиматизирани към 12-часов цикъл светлина/тъмнина при 24˚C с 50 процента влажност и им беше даден свободен достъп до храна и вода на повече от или равна на 1 седмица преди експериментите. Всички експериментални процедури бяха извършени в строго съответствие с насоките на Националния институт по здравеопазване (публикация на NIH № 85-23, ревизирана 1996 г.) и одобрение от институционалните комисии за грижа и използване на животните на централната болница Cangzhou (одобрение № 2017-020-20 01). Всички операции бяха извършени под анестезия и бяха положени всички усилия да се сведе до минимум страданието.
Лигиране и пункция на цекума (CLP).CLP се извършва върху мишки, за да се създаде модел на миши сепсис, както е описано по-рано (12). След анестезиране чрез инхалация на изофлуран (индуциран при 3 процента и поддържан при 0.5 процента), беше изрязан 1 cm разрез по средната линия. Изложеното цекум (1 cm разстояние от края) се лигира с две пункции с помощта на игла 23-калибър. Цекумът внимателно екструдира малко количество изпражнения и се поставя обратно в анатомичното му положение. Коремната стена беше зашита на слоеве с 3-0 копринена плитка. След процедурата беше инжектиран подкожно 1 ml 0.9% физиологичен разтвор. На мишките е осигурен свободен достъп само до вода. Фиктивните моделни мишки бяха оперирани по същия начин като CLP модела без CLP.
Експериментален дизайн. Мишки (n=6 за фиктивна хирургия и CLP) бяха разпределени на случаен принцип в седем групи: фиктивна група, CLP група, аденовирус (Ad)-зелен флуоресцентен протеин (GFP) плюс CLP група, Ad-miR-214 плюс CLP група , anti-miR-214 плюс CLP група, PTEN инхибитор плюс CLP група и Ad-miR-214 плюс PTEN инхибитор плюс CLP група. Мишките от групата Sham бяха изложени на същата процедура, но без лигиране и пункция на цекума. Мишките в другите групи получават лигиране и перфорация на цекума. Всички мишки бяха бързо анестезирани чрез вдишване на изофлуран за събиране на кръв, урина ибъбрекпроби 24 часа след последното третиране.
Медииран от аденовирус Ad‑miR‑214, anti-miR‑214 или Ad-GFPгенен трансфер in vivo и инжектиране на PTEN инхибитор. Ad-miR-214, anti-miR-214 или Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) се доставят в коремната кухина на мишки 4 дни преди CLP. Накратко, мишките бяха анестезирани чрез вдишване на изофлуран. Катетър, съдържащ 200 µl аденовирус (2x1011 pfu, експресиращ miR-214, anti-miR-214 или Ad-GFP) се прилага на нормални мишки чрез интраперитонеална инжекция. PTEN инхибиторът (VO-OHpic, интраперитонеален, Sigma-Aldrich; Merck KGaA) се прилага на CLP мишки, които са получили анти-miR-214 чрез интраперитонеална инжекция в единична доза от 10 µg/kg 30 минути преди прилагането на аденовирус .
Оценка на бъбречната функция. Бяха събрани кръвни проби от сърцето на мишка, последвано от центрофугиране (при стайна температура за 15 минути при 3,000 xg) за събиране на серум. Серумните нива на уреен азот в кръвта (BUN) и серумен креатинин (Cr) се определят с помощта на автоматичен анализатор Hitachi 7600 (Hitachi, Ltd.). ELISA беше използван за анализ на нивата наувреждане на бъбрецитемолекула-1 (KIM-1; кат. № RKM100; R&D Systems, Inc.) и липокалин, свързан с неутрофилна желатиназа (NGAL; кат. № DY3508; R&D Systems, Inc.) в проби от урина.
Тест за серумен възпалителен цитокин.Серумният TNF‑ (кат. № H052) и IL-6 (кат. № H007) бяха изследвани с помощта на търговски комплекти ELISA (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) съгласно инструкциите на производителя.Измерване на маркери за оксидативен стрес. Съответният комплект за анализ (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Китай) беше използван за измерване на нивата на малондиалдехид (MDA) и тестване на активността на супероксид дисмутаза (SOD) в съответствие с инструкциите на производителя.
Хистология и резултат от тубулно увреждане. Всички мишки бяха подложени набъбрекперфузия под анестезия 24 часа след CLP. Theбъбрекпробите се фиксират в 4 процента параформалдехид за 72 часа при 4˚C. След това тъканните проби се дехидратират в градуирана серия от етанолови разтвори, вградени в парафин и нарязани на 4-µm срезове. Срезове (4 µm) се изрязват с помощта на микротом и тъканните срезове се оцветяват с хематоксилин (5 min) и еозин (1 min) при стайна температура за хистологично изследване. Слайдовете бяха оценени и класифицирани с помощта на микроскоп (BX51, Olympus Corporation).Бъбречнаtissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 процента (13).
Трансмисионна електронна микроскопия (ТЕМ).Свежобъбрецисе промиват във фосфатно буфериран физиологичен разтвор и се нарязват на 1 mm кубчета и последователно се фиксират в 2,5 процента глутаралдехид за 24 часа при 4˚C. Срезовете се потапят в 1% осмиев тетроксид за 2 часа при 4˚C, дехидратират се в градуиран етанол и се поставят в епоксидна смола. Накрая, ултратънките срезове (60 nm) се оцветяват двойно с уранил ацетат и оловен цитрат при 20˚C за 60 минути. Наблюдението беше извършено на трансмисионен електронен микроскоп (Tecnai; Hitachi, Ltd.) при 80 kV, използвайки филм за електронна микроскопия 4489 (ESTAR дебела основа; Kodak).
Имунохистохимия (IHC).Свежобъбректъканите се фиксират в 4 процента параформалдехид (за 72 часа при 4˚C) и се поставят в парафин. Пробите се нарязват на срезове с дебелина 4 µm и се депарафинизират в ксилен. След като тъканните срезове бяха промити с PBS, те бяха сварени в 10 mM цитратен буфер (рН 6.0) за 4 минути за извличане на антиген и след това блокирани с 10 процента кози серум в PBS при стайна температура за 1 час. Първичното антитяло (анти-LC3B; 1:400; кат. № 4412; Cell Signaling Technology, Inc.) се добавя в съответствие с инструкциите и се инкубира при 4°C в продължение на 12 часа. Вторичното антитяло (козе антизаешко HRP; 1:2, 000; кат. № BS13278; Bioworld Technology, Inc.) се добавя и се инкубира при стайна температура за 10 минути. Добавя се DAB (100 ul) и се оцветява обратно за 5 минути, като оцветяването се наблюдава под светлинен микроскоп (модел CX31-P; Olympus Corporation). Интензитетът на положителното оцветяване, което изглеждаше кафяво, беше определено с помощта на софтуер за анализ на изображения Image‑Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.). Интегралната оптична плътност (IOD) беше изчислена, за да представи интензитета. Стойностите на IOD се увеличават с увеличаване на протеиновата експресия.
Количествена обратна транскрипция(RT-q) PCR. Общата РНК беше извлечена отбъбречна тъканслед индукция на модела с помощта на TRIzol реагент (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Съгласно инструкциите на комплекта за обратна транскрипция TaqMan (кат. № N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), РНК се транскрибира обратно в сДНК. Използвани са следните условия на термоциклиране (miR-214): Първоначална денатурация при 95˚C за 5 минути; последвано от 40 цикъла на денатурация при 95°C за 30 sec, отгряване при 60°C за 30 sec и удължаване при 72°C за 30 sec. RT‑qPCR се извършва с помощта на ABI Prism 7500 система за откриване на последователности (PerkinElmer, Inc.) и стандартен SYBR Green PCR комплект (Toyobo Life Science). U6 беше използван като вътрешен контрол за miR-214. Праймерните последователности бяха както следва: miR-214, напред, 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3' и обратен, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'; U6, напред, 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' и назад, 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'. Тези експерименти бяха повторени шест пъти. Резултатите бяха анализирани с помощта на метода 2‑ΔΔCq (14). Нивата на експресия на mRNA на LC3, p62, PTEN, AKT и mTOR бяха оценени чрез RT-qPCR. С ‑актин като вътрешна референция на тези гени, 2‑ΔΔCq се използва за измерване на относителната експресия на целевите гени. Праймерните последователности, показани в таблица I, са синтезирани от Sangon Biotech Co., Ltd.
Western blotting. Бъбректъкан се смесва с RIPA лизат (Beyotime Institute of Biotechnology), за да се получи хомогенат и лизисът се спира, когато не се наблюдава видима тъкан. Пробите бяха центрофугирани при 13,000 xg за 10 минути при -4˚C и супернатантата беше възстановена за Western blot анализ. Накратко, протеиновите концентрации се определят с помощта на комплекта за микро BCA протеинов анализ (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Протеиновите проби (80 µg на проба) се подлагат на разделяне чрез електрофореза с редуциращ 12 процента натриев додецилсулфат-полиакриламидегел и след това се прехвърлят върху мембрани от поливинилиден дифлуорид при 4˚C за една нощ. Разделените протеини се прехвърлят към PVDF мембрани. След блокиране в 5 процента обезмаслено мляко при стайна температура в продължение на 2 часа, мембраните се инкубират за една нощ (при 4˚C) с първични антитела. Използвани са следните първични антитела (всички Cell Signaling Technology, Inc.): Лека верига 3B (1:1, 000; кат. № 4412), p62 (1:1, 000; кат. . № 4412), анти-PTEN (1:1, 000; кат. № 9188), анти-фосфорилиран (p)-AKT (Ser473) (1:1, 000; кат. . № 4060), анти-AKT (1:1, 000; кат. № 9272), анти-p-mTOR (Ser 2448) (1:1, 000; кат. № 5536), анти-mTOR (1:1, 000; кат. № 2972) и ‑актин (1:2, 000; кат. № 4970). След промиване, мембраните се инкубират (при стайна температура за 2 часа) с HRP-конюгирани анти-заешки вторични антитела (1:3, 000; кат. № A0208; Beyotime Institute of Biotechnology). Протеиновите ленти бяха открити с Immobilon Western (MilliporeSigma) и анализирани с помощта на софтуера Total‑Lab TL120 (Nonlinear Dynamics, 2.01). Експресията на протеин се нормализира до -актин.
Статистически анализ. Статистическият анализ беше извършен с помощта на GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). Всички данни бяха представени като средни стойности ± стандартно отклонение или медиани (интерквартилни диапазони) за непрекъснати променливи, в зависимост от техните разпределения. Базовите характеристики и резултати бяха сравнени с помощта на еднопосочен ANOVA, последван от posthoc теста на Tukey или теста на Kruskal-Wallis, последван от теста на Dunn, според случая. П<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Резултати
Времева точка 24 часа след CLP. Предишни проучвания съобщават (6, 15, 16), че биохимичният (т.е. LC3 и p62) анализ разкрива, че автофагичният поток се потиска с прогресия на сепсиса след 6-8 часа от CLP. В настоящото изследване броят на автолизозомите вбъбрекна мишки, третирани с CLP, се увеличава в рамките на 24 часа след операцията. Освен това анализът на маркерите наувреждане на бъбрецитепоказа товабъбречна функциябеше най-сериозно увреден 24 часа след CLP. Следователно, времевата точка 24 часа след CLP беше избрана за следващите експерименти.
Регулаторен ефект върху miR-214 в бъбречните тъкани. RT-qPCR анализът беше използван за откриване на експресия на miR-214 в мишки, третирани с CLP. Установено е, че експресията на miR-214 е леко повишена вбъбректъкани след CLP операция 24 часа, в сравнение с фиктивната група (1,47 пъти, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">бъбректъкан, в сравнение с фиктивната група (и двете P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА НЕДОСТАТЪЧНОСТ
Ефект на miR-214 върху бъбречна дисфункция при септични мишки.Всички мишки бяха умъртвени за събиране на кръв, урина ибъбрекпроби 24 часа след CLP операцията. BUN и Cr са важни показатели за тежестта набъбречнаувреждане (17). Освен това NGAL и KIM-1 са идентифицирани като специфични биомаркери наувреждане на бъбрецитеа повишената им експресия се свързва с раннитебъбречнатубулно увреждане при AKI (17). Както е показано на Фиг. 2A-D, нивата на BUN, Cr, KIM-1 и NGAL са значително повишени след CLP операция в сравнение с фиктивната група. Въпреки това, Ad‑miR‑214 значително намалява нивата на BUN, Cr, KIM‑1 и NGAL в сравнение с групата на CLP (всички P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">бъбречна функцияпараметри. Въпреки това, след предварително третиране с инхибитор на PTEN, защитните ефекти на Ad‑miR‑214 бяха подобрени. Резултатите показват, че miR-214 отслабва бъбречната дисфункция при септични мишки.
Ефект на miR-214 върху бъбречно възпаление и оксидативен стрес.Както е показано на Фиг. 3A и B, CLP значително повишава нивата на TNF- и IL-6, докато Ad-miR-214 значително намалява нивата на тези маркери. В сравнение с
Ефект на miR-214 върху бъбречна аутофагия при септични мишки.Настоящото проучване изследва промените в LC3 вбъбректъкани чрез IHC оцветяване. Както е показано на Фиг. 6, LC3 интензитетът на положително оцветяване се повишава значително в CLP групата в сравнение с фиктивната група (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR‑214 активира пътя AKT/mTOR за инхибиранеавтофагия чрез заглушаване на PTEN в бъбречните тъкани.Ефектът на CLP върху аутофагията прибъбректъкани е изследван чрез оценка на нивата на LC3-II/I и p62. Сигналната пътека PTEN/AKT/mTOR играе важна роля в автофагията (18). За да се изследва ефектът на miR-214 върху пътя PTEN-AKT/mTOR, протеиновите нива на LC3-II/I, p62, AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR и PTEN бяха анализирани чрез Western blotting и RT- qPCR анализ. Както е показано на Фиг. 7A-C, модификацията на тези протеини настъпва бързо, с увеличаване на скоростта на LC3-II/LC3-I и намаляване на нивата на p62 (и двата P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">бъбрек tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Тези резултати показват, че автофагията е индуцирана от CLP и свръхекспресията на miR-214 може частично да я инхибира.
Както е показано на Фиг. 7A и D-F, нивото на експресия на PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">бъбрек tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Тези открития предполагат, че CLP индуцирабъбректъканна аутофагия чрез инхибиране на AKT/mTOR пътя. Ad‑miR‑214 активира AKT/mTOR пътя чрез заглушаване на PTEN вбъбрекносни кърпи. Въпреки това, в сравнение с групата на CLP, анти-miR-214 не инхибира значително експресията на mTOR. Следователно, RT-qPCR беше допълнително използван за определяне на експресията на иРНК на гени, свързани с PTEN/AKT/mTOR сигналния път. Според резултатите от RT‑qPCR (фиг. 8), в сравнение с групата Sham, нивата на експресия на mRNA на p62, LC3 и PTEN са значително повишени, докато експресията на mRNA на AKT и mTOR е намалена в групата на CLP. В сравнение с групата CLP, Ad‑miR‑214, PTEN
инхибитори и Ad-miR-214 плюс групите инхибитори на PTEN показват намалена експресия на mRNA на LC3 и PTEN, но повишена експресия на mRNA на p62, AKT и mTOR (всички P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). По този начин ефектът на p62 върху аутофагията може да възникне на транскрипционно ниво, а не на пост-транскрипционно ниво. Настоящите резултати показват, че miR-214 регулира надолу експресията на PTEN и активира AKT/mTOR сигналния път.
Дискусия
Настоящото проучване установи, че прекомерната автофагия е вредна забъбречна функцияпри септични мишки. Предишни проучвания показват, че miR-214 е свързан с повишена пролиферация, метастази, инвазия и функционира като онкоген за клетки и тъкани (19-22). Проучванията съобщават, че miR-214 служи като защитна роля срещу AKI чрез отслабване на апоптозата, оксидативния стрес и понижаване на възпалителните фактори (21, 23). Настоящото проучване допълнително изследва механизмите, лежащи в основата на защитния ефект на miR-214 върху индуцирана от сепсис AKI, като се фокусира върху потенциалното участие на miR-214 в модулирането на аутофагията. Резултатите показват, че вбъбрекслед прилагане на CLP операция. Междувременно активирането на автофагията се случва вбъбрек.Повишен LC3 II/I и намаляването на p62 вбъбреке наблюдавано след лечение с CLP хирургия. Както се очакваше, свръхекспресията на miR-214 значително отслабнабъбрекпатологични наранявания ибъбрекдисфункция, причинена от сепсис. Въпреки това, инхибирането на miR-214 показва обратна тенденция към повторна защита. В допълнение, защитният ефект на Ad‑miR‑214 беше подобрен от PTEN инхибитор.
В септичнабъбрекпрекомерното възпаление е придружено от масивни увеличения в производството на ROS и голям брой ROS предизвикват промени в структурата на митохондриите и увреждат митохондриалната функция, което кара тялото да влезе в порочен кръг, който влошавабъбрекщети (24,25). Следователно оксидативният стрес може да бъде един от основните патологични механизми на предизвиканата от сепсис AKI. Настоящото проучване предостави допълнителни доказателства, демонстриращи прекомерен оксидативен стрес, което беше показано от увеличеното производство на MDA и намалената активност на SOD вбъбректъкани след CLP операция. Освен това беше установено, че свръхекспресията на miR-214 може да защитибъбрексрещу CLP-индуцирано оксидативно увреждане, което участва в автофагичното инхибиране. Това е в съответствие с предишни проучвания, че miR-214 защитава различни клетки и тъкани срещу оксидативен стрес (26, 27).
Автофагията служи като „нож с две остриета“ при развитието на сепсис: Базалната аутофагия може да упражни защитни ефекти чрез премахване на токсични окислителни протеини, но прекомерната автофагия може да доведе до автофагична клетъчна смърт при силен стрес, като изригване на ROS (28, 29) . Доказано е, че автофагията се активира първоначално при сепсис, последвана от последваща фаза на дисфункция, дължаща се на автофагична клетъчна смърт (30), която влошава предизвиканото от сепсис оксидативно увреждане. В настоящото проучване инхибиторът на PTEN или свръхекспресията на miR-214 показва антиоксидантна ренопротекция при мишки, третирани с CLP. Въпреки това, инхибирането на miR-214 показва противоположна тенденция към антиоксидантна ренопротекция. Така че прекомерната или неадекватна автофагия може да причиниувреждане на бъбреците; и двете са неадаптивни и в крайна сметка провокират клетъчна смърт. Следователно поддържането на умерени нива на аутофагия е ключът към смекчаване на оксидативното увреждане при септично състояние.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА БОЛКА
Натрупаните доказателства сочат, че miR-214 инхибира автофагията в различни клетки и тъкани (31-33). В настоящото проучване беше установено, че свръхекспресията на miR-214 инхибира CLP-индуцираната аутофагия вбъбречни тъкани,както е показано от промените в протеиновите маркери, като LC3-II/I и p62. Освен това, резултатите показват, че свръхекспресията на miR-214 отслабва CLP-индуцираното оксидативно увреждане чрез инхибиране на прекомерната автофагия. Настоящото проучване също изследва молекулярните механизми, чрез които miR-214 модулирабъбрекаутофагия при предизвикана от сепсис ОПП. PTEN/AKT/mTOR е важен сигнален път, който регулирабъбрекаутофагия (34, 35) и която играе ключова роля в индуцираната от сепсис ОПП, а PTEN е отрицателен инхибитор на сигналния път на PI3K/AKT/mTOR. Предишни проучвания съобщават, че miR-214 може да регулира автофагията чрез сигналния път PI3K/AKT/mTOR в различни модели (36-38). Ma et al (39) откриха, че miR-214 може да регулира надолу автофагията в бъбреците с диабет. Поради това се предполага, че ефектите на miR-214 върху CLP-индуцираната AKI могат да бъдат включени в регулирането на пътя PTEN/AKT/mTOR. Трябва да се отбележи, че резултатите от настоящото проучване показват, че CLP хирургията значително повишава нивата на PTEN, но намалява нивата на p-AKT и p-mTOR, което показва, че CLP хирургията инактивира AKT/mTOR пътя. В допълнение, свръхекспресията на miR-214 активира AKT/mTOR пътя чрез заглушаване на PTEN при CLP-индуцирана автофагия вбъбрекносни кърпи. Въпреки това, анти-miR-214 не инхибира значително експресията на mTOR в Western blot анализи. По този начин RT-qPCR беше допълнително използван за определяне на експресията на иРНК на гени, свързани с PTEN/AKT/mTOR сигналния път. Настоящото проучване установи, че miR-214 регулира надолу експресията на PTEN и активира AKT/mTOR сигналния път за инхибиране на автофагията. Трябва обаче да се проведат допълнителни изчерпателни проучвания, за да се получат допълнителни подробности, свързани с механизма набъбрекавтофагия при септично състояние.
В заключение, резултатите от настоящото проучване предполагат, че miR-214 играе защитна роля срещу предизвикан от сепсисувреждане на бъбрецитечрез намаляване на оксидативния стрес и инхибиране на автофагията чрез регулиране на пътя PTEN/AKT/mTOR. Настоящите открития предполагат, че miR-214 може да бъде потенциална терапевтична цел за предизвикана от сепсис AKI. Въпреки това, настоящото проучване използва мишки на възраст 6-8 седмици, така че са необходими допълнителни изследвания на механизма на miR-214 при възрастни мишки.
