Модулирането на сигналния път на арилния въглеводороден рецептор въздейства върху репликацията на вируса Junín, част 2

3. Резултати и дискусия

3.1. Пътят на AHR е прекалено представен по време на инфекция с JUNV

Черният дроб е една от основните мишени по време на инфекция с JUNV [22]. За да изясним молекулярните механизми, включени в хепатоцитна инфекция, ние проведохме скрининг на Affymetrix microarray, за да определим диференциално експресираните гени в човешки HepG2 клетки, получени от черния дроб, инфектирани с JUNV IV4454 за 24 или 48 часа.

Използвахме софтуера Transcriptome Analysis Console от ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, САЩ, за да оценим диференциално експресираните гени в JUNV-инфектираните клетки в сравнение с контролата (Фигура 1a, b). Общо 266 и 313 диференциално експресирани гена бяха открити съответно на 24 и 48 h pi (Фигура 1a, b).

Тест с микрочипове Affymetrix (n=3 независими експеримента за условие). Гените на гостоприемника, показващи най-малко 16-кратна промяна в експресията и 95 процента вероятност да бъдат експресирани по различен начин (p=0.05), бяха взети под внимание за по-нататъшен анализ. Гените, показани в червено, са регулирани нагоре, гените, показани в зелено, са регулирани надолу, а гените в сиво не показват промяна в експресията в сравнение с неинфектирани HepG2 клетки. ( b ) Диференциално експресирани гени между фалшиво инфектирани и JUNV-инфектирани HepG2 клетки при 48 h pi. ( c ) Генен онтологичен анализ на диференциално експресирани гени в JUNV-инфектирани HepG2 клетки при 48 h pi. (d) Анализ на свръхпредставяне на пътя на JUNV-инфектирани HepG2 клетки в сравнение с фалшиво инфектирани клетки, показващи основните сигнални пътища, засегнати по време на инфекция. Червената лента подчертава пътя на AHR. Прекъснатата синя линия показва p=0.05. p стойностите бяха определени от софтуера WebGestalt (http://www.webgestalt.org, достъпен на 3 юли 2020 г.).

Съществува тясна връзка между гените на гостоприемника и имунитета. Гените на гостоприемника до голяма степен определят развитието и функцията на имунната система на човек и могат да повлияят на резистентността на човека към различни патогени.

Няколко проучвания показват, че определени генни мутации могат да доведат до дисбаланси в имунната система. Например, някои хора може да страдат от заболявания, при които имунната система реагира прекомерно, карайки имунната система да атакува телесните си тъкани, като ревматоиден, системен лупус еритематозус и други заболявания. В допълнение, резистентността към патогени като бактерии, вируси и паразити също е свързана с генетични различия. Някои хора се раждат с по-ефективна имунна система, която изчиства патогените по-бързо и по-пълно.

Изследванията на връзката между гените на гостоприемника и имунитета ни дадоха по-задълбочено разбиране на защитните механизми на тялото и също така ни помогнаха да разберем по-добре реакцията на тялото към различни заболявания. Това е от голямо значение за профилактиката и лечението на заболяванията.

Затова трябва да обърнем внимание на значението на генетичното изследване и да научим и разберем разликите в човешките гени, за да защитим по-добре имунната си система, да укрепим физиката си и да изградим силно тяло. От тази гледна точка трябва да подобрим имунитета си. Cistanche може значително да подобри имунитета, тъй като Cistanche е богат на различни антиоксидантни вещества, като витамин C, витамин C, каротеноиди и др. Тези съставки могат да поглъщат свободните радикали и да намалят оксидативния стрес. Стимулират и подобряват устойчивостта на имунната система.

Click cistanche tubulosa ползи

За да проучим допълнително въздействието на JUNV върху клетъчния пейзаж, използвахме софтуера WebGestalt (http://www.webgestalt.org, достъпен на 3 юли 2020 г.), който използва базата данни Wikipathways като хранилище за извършване на анализ на генна онтология ( Фигура 1в) и да се определи кои сигнални пътища са били различно променени в сравнение с контролата (Фигура 1d).

По отношение на онтологичния анализ на гените от диференциално експресираните гени беше заключено, че инфекцията с JUNV влияе върху експресията на гени, свързани с метаболизма на РНК, киназите на гостоприемника и липидния метаболизъм (Фигура 1в). Струва си да се отбележи, че се съобщава, че тези биологични процеси и молекулярни функции са насочени към JUNV по време на неговия цикъл на репликация [23].

Освен това, анализът на свръхпредставяне на пътя разкри, че инфекцията с JUNV обогатява сигналния път на AHR при 48 h pi (Фигура 1d) сред много други пътища (p < 0.05). По-специално, открихме повишена експресия на целевия ген на AHR CYP1B1, което доказва повишена активност на пътя на AHR.

През последните няколко години няколко проучвания разкриха значението на AHR като терапевтична цел по време на различни патологични сценарии; по този начин е разработено голямо разнообразие от малки съединения за модулиране на неговата активност. Решихме да проучим допълнително въздействието на AHR модулацията по време на in vitro инфекция с JUNV.

3.2. Фармакологичната модулация на AHR засяга репликацията на вируса

За да изясним ролята, която AHR играе при JUNV инфекциите, решихме да тестваме ефектите на известните AHR лиганди CH223191 (антагонист) и кинуренин (агонист) върху in vitro инфекции с два различни JUNV атенюирани щама: IV4454 и Candid#1. Леченията и инфекциите бяха извършени с използване на клетки Huh-7 и Vero. Тъй като тази последна клетъчна линия не може да експресира и секретира интерферон тип I (IFN-I), нейното използване позволява да се определи значението на експресията на IFN-I в потенциалното медиирано от AHR взаимодействие гостоприемник-вирус.

Първо, цитотоксичността на различни концентрации както на CH223291, така и на кинуренин беше оценена чрез МТТ анализ (Фигура 2a, b) и наблюдения с оптична микроскопия (Фигура 2c, d).

По отношение на CH223191, намаляване на клетъчната жизнеспособност и морфологични промени, свързани с цитотоксични ефекти, бяха открити само при концентрации от 80 µM (Фигура 2a, c). От друга страна, кинуренинът не индуцира цитотоксични ефекти при нито една тествана концентрация (Фигура 2b, d).

За да се изследва ефектът от фармакологичната модулация на AHR по време на инфекция с JUNV, клетъчните култури се третират с носител (DMSO), CH223191 или кинуренин и след това се заразяват с JUNV в продължение на 48 часа, за да се определи вирусният добив. Накратко, клетките Vero и Huh-7 бяха третирани с носител или третирани с различни концентрации на малката молекула CH223191 (2,5, 5 µM, 10 µM и 20 µM) или кинуренин (5 µM, 10 µM, 20 µM и 40 µM) преди и след инфекция с JUNV с IV4454 и Candid#1 при MOI от 0,5. След 48 часа, супернатантите бяха събрани и използвани за заразяване на Vero клетки за PFU анализ (Фигура 3).

AHR блокадата значително намалява производството на вирусни частици по начин доза-отговор, дори при най-ниската тествана концентрация на CH223191. Важно е, че този резултат се наблюдава не само при използване на двата JUNV-атенюирани щама, но и в двете заразени клетъчни линии (Vero и Huh7). Лечението с CH223191 на инфектирани с JUNV клетки Vero и Huh-7 намалява броя на вирусните плаки съответно с 93 процента и 97 процента (Фигура 3a,b). Тези резултати силно предполагат, че сигналният път на AHR е важен клетъчен фактор по време на инфекция с JUNV (Фигура 3a, b). От друга страна, прилагането на кинуренин преди и след инокулация с JUNV не променя значително получения вирусен титър в сравнение с вирусния контрол (Фигура 3c, d).

Като цяло, резултатите доказват за първи път, че AHR е важен клетъчен фактор по време на JUNV in vitro инфекция, което предполага провирусна роля чрез улесняване на цикъла на вирусна репликация.

3.3. AHR модулацията оказва влияние върху експресията на JUNV протеин

За по-нататъшно изследване на ефектите от AHR модулацията върху JUNV инфекцията, ние проведохме индиректен имунофлуоресцентен анализ. Протеинът JUNV NP е най-изобилният структурен и функционален протеин в семейството на Arenaviridae. По този начин, NP беше избран като интересна цел за оцветяване, като се има предвид, че само няколко проучвания съобщават за модела на експресия на NP на различни JUNV атенюирани щамове. Първата ни стъпка беше да определим NP разпределението на двата щама JUNV в нашите клетъчни модели, за да сравним допустимостта на различните клетъчни линии и вирусното разпространение на двата атенюирани щама в тези клетъчни култури (Фигура 4).

Локализацията на NP беше изключително цитоплазмена и показваше хомогенен модел на голямо пунктирано натрупване, подобен и за двата щама в клетъчните линии Vero и Huh-7 (Фигура 4).

След това ние оценихме чрез имунофлуоресценция въздействието на фармакологичната модулация на AHR върху експресията на NP в инфектирани с JUNV клетъчни култури.

Накратко, клетките се посяват върху стъклени покривни стъкла, предварително третирани или с носител (DMSOCH223191 (10 uM), или с кинуренин (40 uM), и след това фалшиво инфектирани или инфектирани с JUNV за 48 часа. След това клетките се фиксират и обработват чрез имунофлуоресценция анализ (Фигура 5).

Прилагането на CH223191 забележително намалява броя на NP-позитивните клетки в двете клетъчни култури и за двата щама JUNV (Фигура 5). Тези наблюдения корелират с предишни резултати, показани на Фигура 3a,b. AHR блокадата намалява не само процента на инфектираните с JUNV клетки, но и размера на вирусните огнища. Vero клетъчни култури, предварително третирани с CH223191 и инфектирани с IV4454 или Candid#1, показват съответно 57,14 процента (SD ± 7,98) и 41,17 процента (SD ± 9,05) намаление на размера на огнищата. В допълнение, Huh-7 клетъчни култури, предварително третирани с антагониста и заразени с IV4454 или Candid#1, показват съответно 28,57 процента (SD ± 8,70) и 12,50 процента (SD ± 9,30) намаление на размера на огнищата. От друга страна, беше наблюдавано, че лечението с кинуренин не променя процента на NP-позитивните клетки (Фигура 5) или размера на фокуса (не е показано), в сравнение с нетретираните инфектирани клетки.

Освен това по-подробна микроскопска инспекция показа, че вирусните огнища са по-големи в инфектираните клетъчни култури Vero в сравнение с Huh-7-инфектираните клетъчни култури. Наблюдавахме, че средната стойност на JUNV-инфектираните клетки Vero на фокус се състои от 35 клетки, докато средната стойност на JUNV-инфектираните Huh-7 клетки на фокус се състои от 6 клетки. Това очаквано наблюдение е в съответствие с ограничената вирусна среда, която IFN-компетентните клетки налагат върху размножаването на JUNV [24].

3.4. Потискането на AHR намалява нивата на вируса на JUNV

И накрая, за да се прецени дали блокадата на AHR влияе върху нивата на JUNV РНК, клетките Vero и Huh-7 бяха третирани с носител, CH223191 (10 µM) или кинуренин (40 µM), след което бяха фалшиво или инфектирани с JUNV за 48 ч. След това клетъчните монослоеве бяха събрани и обработени за RT-qPCR, за да се наблюдават нивата на ahr, cyp1a1 и np РНК (Фигура 6).

Беше наблюдавано, че третирани с CH223191- и инфектирани с JUNV клетки показват тенденция към по-ниски нива на ahr mRNA в сравнение с проби, третирани с носител – инфектирани с JUNV (Фигура 6a,b). Обратно, прилагането на кинуренин показва тенденция към повишаване на нивата на ahr mRNA в JUNV-инфектирани клетки в сравнение с третирани с носител – JUNV-инфектирани проби (Фигура 6a, b). В съответствие с тези резултати, лечението с CH223191 показва тенденция към намаляване на нивата на cyp1a1 mRNA в Huh-7 клетки, докато лечението с кинуренин показва противоположни ефекти (Фигура 6в). По отношение на нивото на JUNV РНК, беше наблюдавано, че лечението с антагониста на AHR CH223191 намалява нивата на вирусна РНК в заразените клетки в сравнение с проби, третирани с носител – инфектирани с JUNV, докато третирани с кинуренин и инфектирани с JUNV клетки имат тенденция към увеличаване на вирусния Нива на РНК (Фигура 6d,e).

В тази работа ние показахме за първи път, че in vitro JUNV инфекцията индуцира активирането на AHR сигналния път в чернодробни клетъчни култури. Данните от анализа на микрочипове показват, че сигналният път на AHR е свръхекспресиран в инфектирани с JUNV клетъчни култури при 48 h pi.

Няколко проучвания съобщават, че активирането на AHR може да има различни ефекти върху клетъчната физиология, като влияе върху пролиферацията и вродените имунни отговори [6,25]. Всъщност, през последното десетилетие, активирането на AHR е описано като имащо IFN модулаторна активност, оказваща ефекти върху секрецията на цитокини [26,27]. Важно е, че сигнализирането за повишена регулация на AHR може да намали IFN-I антивирусните имунни отговори [28]. Във връзка с това, ние оценихме въздействието на модулацията на сигналния път на AHR върху некомпетентни и компетентни IFN клетъчни култури, като Vero и Huh-7 клетъчни модели, използвайки AHR антагонист и агонист малки търговски молекули по време на in vitro JUNV инфекция с два различни атенюирани щама.

Чрез различни подходи беше потвърдено, че отрицателната модулация на AHR чрез фармакологично инхибиране с CH223191 има антивирусна активност срещу JUNV. След блокадата на AHR беше установено, че инфекцията с JUNV in vitro е инхибирана. Наблюдава се важно намаляване на експресията на вирусен протеин в инфектирани с JUNV клетъчни култури, третирани с AHR антагониста. Освен това блокадата на AHR намалява производството на извънклетъчни инфекциозни вирусни частици както на атенюирани IV4454, така и на Candid#1 щамове на JUNV, изследвани в тази работа. Освен това се наблюдава тенденция към намаляване на нивата на вирусна РНК в третирани с CH223191- клетки. Интересното е, че тези находки са наблюдавани както в клетъчни линии Huh-7, така и в Vero и показват еквивалентна величина, което предполага, че провирусната роля на AHR по време на инфекция с JUNV може да бъде независима от IFN-I сигналния път. Тези резултати са в съответствие с нашите предишни наблюдения в други вирусни модели [13]. Ще са необходими повече проучвания, за да се изясни коя стъпка от цикъла на репликация на JUNV е засегната от блокадата на AHR.

Проучванията, показващи активиране на AHR от антропогенни лиганди, придобиха особен интерес поради нарастващата осведоменост, включваща неправилна експлоатация на околната среда и нейното взаимодействие с тежестта на вирусната инфекция [2]. Обърнете внимание, че зоната на местообитание, покрита от гризачи вектори JUNV, обхваща голяма територия; понастоящем обаче AHF засяга само ограничен и затворен регион, където се извършват предимно селски дейности [29]. Освен това селскостопанските работници са основната популация, изложена на риск да страдат от тежки прояви по време на заболяването AHF. Настоящата ни работа предполага, че излагането на гризачи/човек на агонисти на AHR може да окаже влияние върху резултата от инфекцията с JUNV.

Въпреки че през последните десетилетия са посветени интензивни усилия на антивирусни изследвания срещу аренавируси [30], понастоящем не е налична специфична антивирусна химиотерапия за лечение на AHF и човешки заболявания, причинени от други патогенни членове на Arenaviridae. По-специално, вирусът Lassa (LASV) е агентът на треската Lassa (LF), която представлява сериозна заплаха за хората в регионите на Западна Африка с много висок процент на смъртност [31]. Понастоящем единственото алтернативно лечение срещу LF е употребата не по предназначение на аналога на гуанозин рибавирин, за който е доказано, че е частично ефективен при пациенти с LF само ако прилагането му започне в рамките на 6 дни от началото на симптомите [32,33]. Освен това рибавирин може да предизвика неблагоприятни странични ефекти, ограничавайки препоръката за прилагането му само при пациенти с висок риск. След това има реално търсене на нови ефективни антивирусни средства за лечение на аренавирусни хеморагични трески. AHR представлява нов целеви хост, който трябва да бъде разгледан. Действително има няколко текущи клинични изпитвания, включващи инхибитори на AHR (BAY2416964, IK-175 и HP163) при лечението на различни видове рак. Независимо от това, тези изпитвания са в ранен етап и нито едно не се фокусира върху антивирусния потенциал на фармакологичното насочване на AHR. Забележимо е, че лекарства, насочени към клетъчни фактори, необходими в цикъла на размножаване на вируса, възвърнаха интереса към антивирусното развитие, като се даде възможност да се получи широкоспектърен инхибитор, засягащ мишена гостоприемник, обща за няколко човешки патогени [34,35], характеристика, свързана с AHR.

В заключение, комбинираните резултати от настоящото проучване подчертават значението на модулацията на сигналния път на AHR като потенциална терапевтична цел срещу JUNV. Ще са необходими бъдещи проучвания за прилагане на терапии, насочени към AHR, за преодоляване на важни предизвикателства, като доставяне на AHR лиганди до желаните тъкани и клетки, за да се сведат до минимум възможните нецелеви AHR модулационни ефекти.

Авторски принос:

Концептуализация, CCG; методология, MAP, AEADL и ABM; софтуер, FG; валидиране, MAP и FG; формален анализ, MAP и MFT; разследване, MAP и MFT; ресурси, EBD и CCG; обработка на данни, FG; писане - първоначална подготовка на черновата, MAP и MFT; писане—преглед и редактиране, EBD и CCG; надзор, CCG; администриране на проекти, CCG; придобиване на финансиране, EBD и CCG Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране:

Тази работа е финансирана от Universidad de Buenos Aires (UBA) (грант номер 20020170100363BA) и Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET) (грант номер PIP11220170100171CO). EBD и CCG са членове на изследователската кариера от CONICET; MFT, AEADL и ABM са сътрудници на CONICET. MAP е стипендиант от САБ.

Изявление на институционалния съвет за преглед:

Не е приложимо.

Декларация за информирано съгласие:

Не е приложимо.

Декларация за наличност на данни:

Данните, които подкрепят констатациите от това проучване, са достъпни от съответния автор при разумно искане.

Благодарности:

Благодарим на всички членове на участващите лаборатории за полезни съвети и дискусии.

Конфликти на интереси:

Авторите декларират липса на конфликт на интереси. Финансиращите нямат никаква роля в дизайна на проучването; при събирането, анализите или тълкуването на данни; в писането на ръкописа; или в решението за публикуване на резултатите.

Препратки

1. Глава, JL; Lawrence, BP Арилният въглеводороден рецептор е модулатор на антивирусния имунитет. Biochem. Pharmacol. 2009, 77, 642–653. [PubMed]

2. Торти, МФ; Giovannoni, F.; Куинтана, FJ; García, CC Арилният въглеводороден рецептор като модулатор на антивирусен имунитет. Отпред. Immunol. 2021, 12, 624293. [PubMed]

3. Шинде, Р.; McGaha, TL Арилният въглеводороден рецептор: Свързване на имунитета към микросредата. Тенденции Immunol. 2018, 39, 1005–1020. [PubMed]

4. Stockinger, B.; Хирота, К.; Дуарте, Дж.; Veldhoen, M. Външни влияния върху имунната система чрез активиране на арилния въглеводороден рецептор. Семин. Immunol. 2011, 23, 99–105.

5. Ротхамер, В.; Borucki, DM; Tjon, EC; Такенака, MC; Чао, CC; Ардура-Фабрегат, А.; де Лима, Калифорния; Gutiérrez-Vázquez, C.; Hewson, P.; Сташевски, О.; et al. Микроглиален контрол на астроцитите в отговор на микробни метаболити. Nature 2018, 557, 724–728. [CrossRef]

6. Кинтана, FJ; Basso, AS; Иглесиас, AH; Корн, Т.; Farez, MF; Бетели, Е.; Caccamo, М.; Оука, М.; Weiner, HL Контрол на Treg и TH17 клетъчна диференциация от арилния въглеводороден рецептор. Nature 2008, 453, 65–71. [CrossRef]

7. Маршал, NB; Kerkvliet, NI Диоксин и имунна регулация: Нововъзникваща роля на арил въглеводороден рецептор в генерирането на регулаторни Т клетки. Ан. NY Acad. Sci. 2010, 1183, 25–37.

8. Фогел, CFA; Khan, EM; Leung, PSC; Гершуин, ME; Chang, WLW; Wu, D.; Haarmann-Stemmann, T.; Хофман, А.; Denison, MS Взаимодействие между ариловия въглеводороден рецептор и възпалителния отговор: Роля за ядрен фактор-KB. J. Biol. Chem. 2014, 289, 1866–1875. [CrossRef]

9. Банкоти, Дж.; Rase, B.; Симонес, Т.; Shepherd, DM Функционални и фенотипни ефекти на активирането на AhR във възпалителни дендритни клетки. Токсикол. Приложение Pharmacol. 2010, 246, 18–28. [CrossRef]

10. Фогел, CFA; Гот, SR; Донг, Б.; Песа, Индиана; Мацумура, Ф. Арил въглеводороден рецептор, сигнализирането медиира експресията на индоламин 2,3-диоксигеназа. Biochem. Biophys. Рез. Общ. 2008, 375, 331–335. [CrossRef]

11. Джин, Великобритания; Мур, AJ; Глава, JL; Neumiller, JJ; Lawrence, BP Активирането на арил въглеводороден рецептор намалява функцията на дендритните клетки по време на инфекция с грипен вирус. Токсикол. Sci. 2010, 116, 514–522. [CrossRef]

12. Джованини, Ф.; Бош, И.; Полонио, CM; Торти, MF; Уилър, Масачузетс; Li, Z.; Romorini, L.; Родригес Варела, MS; Rothhammer, V.; Барозу, А.; et al. AHR е фактор-гостоприемник на вируса Zika и кандидат-мишена за антивирусна терапия. Нац. Neurosci. 2020, 23, 939–951. [CrossRef]

13. Джованини, Ф.; Li, Z.; Ремес-Леников, Ф.; Dávola, ME; Elizalde, М.; Палета, А.; Ашкар, АА; Mossman, KL; Dugour, AV; Фигероа, JM; et al. AHR сигнализирането се индуцира от инфекция с коронавируси. Нац. Общ. 2021, 12, 5148. [CrossRef]

14. Бухмайер, MJ; de La Torre, JC; Peters, CJ Arenaviridae: Вирусите и тяхната репликация. In Fields Virology, 4-то издание; Lippincott Williams & Wilkins: Филаделфия, Пенсилвания, САЩ, 2013 г.; стр. 1283–1303.

15. Enria, DA; Briggiler, AM; Sánchez, Z. Лечение на аржентинска хеморагична треска. Антивирусна. Рез. 2008, 78, 132–139. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com