Асоциацията на редкия генен полиморфизъм Rs35667974 IFIH1 с автоимунни заболявания случай ли е на РНК епигенетика?

визуализация—AA, AP и EEE, надзор—EEE и придобиване на финансиране—EEE. Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа. Резюме

Интерферонът, индуциран с хеликаза C домейн-съдържащ протеин 1 (IFIH1) ген, кодира цитоплазмена РНК хеликаза, иначе известна като свързана с диференциация на меланома 5 (MDA5), RIG-1-подобна РНК хеликаза, която разпознава вирусна РНК и участва във вродени имунитет чрез разпознаване на вирусна РНК. При свързване с двойноверижна (ds) РНК, MDA5 образува нишковиден комплект по дължината на dsRNA и използва молекулярни сигнатури, за да разграничи себе си спрямо не-самостоятелни въз основа на дължината на dsRNA и метилирането. Неговият миссенс вариант rs35667974 предпазва от диабет тип 1, псориазис и псориатичен артрит, но също така е установено, че е свързан с повишен риск от анкилозиращ спондилит, болест на Crohn и улцерозен колит. За да разберем сложната роля на този вариант, ние извършихме структурен анализ на MDA5 в комплекс с dsRNA, използвайки симулации на молекулярната динамика.

Нашите данни предполагат, че докато мутацията на Ile923Val на варианта rs35667974 не засяга значително свързването към нативната dsRNA, тя показва дестабилизиращ ефект в присъствието на 2'-O метилиране на уридин. По този начин, наличието на 2'-O-метилиране в dsRNA въвежда сензорна сигнатура, която води до селективно намаляване на цялостната MDA каталитична активност. Това проучване представлява оценка на ролята на споделения rs35667974 вариант на автоимунен локус IFIH1, за който се съобщава, че води до селективно намалена каталитична активност на модифицирания MDA5 фенотип и, като следствие, намалена отрицателна обратна връзка върху сигнализирането на цитокини и хемокини и селективна защита срещу автоимунитет .

Домейнът хеликаза С е важен ензимен протеин, който може да развие структурата на двойната спирала на ДНК. Може да помогне на ДНК да завърши правилната репликация, редактиране и доставка в процеса на клетъчна репликация, възстановяване и транскрипция и е един от ключовете за нормалната функция на клетките. В същото време имунитетът е много важен защитен механизъм в човешкото тяло, който може ефективно да ни предпази от патогени като бактерии и вируси.

Проучванията показват, че доменът хеликаза С играе важна роля в имунитета. На първо място, хеликазният С домейн може да осигури стабилността и ефективността на кодирането на гените, като подпомага нормалната репликация, възстановяване и транскрипция на клетъчна ДНК, като по този начин подобрява имунитета на човешкото тяло. Второ, хеликазният C домен може да насърчи разпознаването на протеинови хетерогенни молекули от клетките и да регулира сигналната трансдукция на имунната система, като по този начин поддържа защитната функция на тялото. И двата горни метода са изиграли положителна роля за насърчаване на поддържането и повишаването на имунитета.

В допълнение, задълбоченото проучване на връзката между хеликаза С домейна и имунитета също ни дава важно вдъхновение за откриване на нови лекарства за лечение на рак и имунно-свързани заболявания. Разработването на лекарства и генната терапия, насочена към домена на хеликаза С, може да подобри устойчивостта на организма към рак и други свързани с имунитета заболявания и да помогне на пациентите да се справят по-добре с лечението и възстановяването на свързаните с тях заболявания.

За да обобщим, връзката между домейна на хеликаза С и имунитета е много тясна и играе жизненоважна роля в осигуряването на генна стабилност, насърчаване на клетъчния имунитет и поддържане на защитата на тялото. Надяваме се, че чрез подходящи изследвания и методи на лечение можем по-добре да поддържаме и подобряваме човешкия имунитет и да създадем по-здравословен и по-добър живот за нас. От тази гледна точка трябва да засилим личния имунитет. Cistanche има значителен ефект върху подобряването на имунитета, тъй като месната паста е богата на различни антиоксидантни вещества, като витамин С, витамин С, каротеноиди и др. Тези съставки могат да поглъщат свободните радикали и да намалят оксидативния стрес. Стимулират и подобряват устойчивостта на имунната система.

Click cistanche tubulosa ползи

Ключови думи

Еднонуклеотиден полиморфизъм (SNP) · Молекулен модел · Интерферон, индуциран с хеликаза С домен 1 (IFIH1) · Меланомна диференциация-свързана 5 (MDA5) · РНК метилиране.

Въведение

Гените и механизмите, участващи в автоимунните заболявания, които засягат приблизително 5 процента от населението, остават все още неуловими, но натрупващите се данни силно предполагат, че различните автоимунни заболявания могат да споделят общ генетичен произход, като по този начин посочва съществуването на варианти, които се споделят от различни автоимунни заболявания (Жернакова и др. 2009). Опитът да се разкрие тази генетична информация в биологично значими механизми, водещи до заболявания, се отнася до идентифицирането на причинни гени. Идентифицирането на варианти, причиняващи заболяване, е трудна, но необходима задача в опита да се установят ефективни методи за прогнозиране, превенция и интервенция на заболяването (Biros et al. 2005).

Различни видове РНК молекули участват в регулирането на няколко биологични процеса, включително информационна РНК (mRNA), трансферна РНК (tRNA), рибозомна РНК (rRNA), микроРНК (miRNA) и дълга некодираща РНК (lncRNA). РНК молекулите съдържат множество (повече от 150) химически модификации (Machnicka et al. 2013; Boccaletto et al. 2018). Тези модификации са функционално свързани с всички етапи на метаболизма на РНК, като структура, стабилност и взаимодействия, и играят критична роля в няколко биологични процеса, като модулиране на репликацията на вируси и антивирусни имунни отговори (Machnicka et al. 2013). Сред тях метилирането на рибоза е сред най-разпространените модификации, открити в РНК. 2′-O-метилуридин се намира в rRNA, snRNA, snoRNA и tRNA на Archaea, Bacteria и Eukaryota (Aučynaitė et al. 2018). Рибозо-2′-Ометилирането повишава хидрофобността на нуклеотидите и ги предпазва от действието на нуклеазите (Yildirim et al. 2014).
Натрупаните доказателства показват, че 2′-O-метилирането на вирусна РНК (2′OMe-РНК) играе важна роля в избягването на клетъчните вродени имунни отговори в клетките гостоприемници (Димитрова и др. 2019). Züst и колеги са показали, че 2′ OMe на вирусна РНК допринася за избягването на интерферон (IFN)-медиирания антивирусен отговор, като по този начин насърчава вирусната репликация (Züst et al. 2011). Освен това Vitali и Scadden предполагат, че IU-dsDNA потиска пътя на стимулиране на MDA5 IFN (Vitali and Scadden 2010).

Интерферонът, индуциран с хеликаза С домен 1 (IFIH1) ген, кодира цитоплазмена РНК хеликаза, известна също като MDA5 (протеин 5, свързан с диференциация на меланома), и е RIG-I-подобен рецептор (RLR), който изпълнява антивирусна функция във вродения имунитет чрез откриване на вирусни РНК. MDA5 разпознава 0.5–1 kb РНК дуплексна стволова структура, която обикновено се образува по време на пикорнавирусна репликация и медиира имунен отговор към вирусна инфекция (Nejentsev et al. 2009; Crow 2011). MDA5, при откриване на дълги вирусни двойноверижни РНК (dsRNA), генерирани по време на репликация на пикорнавируси, активира сигналния път на интерферон тип I. Проучванията показват, че MDA5 образува нишка по дължината на dsRNA и използва ATP-зависима динамика на нишките, за да прави разлика между себе си и не-себе си въз основа на дължината на dsRNA (Toro et al. 2015). Показано е, че MDA5 участва в модулирането на кръстосаното взаимодействие между клетките и вродената/адаптивна имунна система чрез локалното производство на цитокини и хемокини.

Промените в експресията и/или активността на MDA5 могат да предизвикат клетъчни отговори към dsRNA, страничен продукт от репликацията на вируса (Colli et al. 2010). Доказано е също, че мутацията на остатъци, свързани с образуването на влакна, води до загуба на образуване на влакна и MDA5-зависима сигнализация, с изключение на двойка мутации, които умерено усилват сигнализацията. Тези резултати предполагат, че ATP-независими механизми, т.е. по-здраво свързване на РНК и/или по-стабилно взаимодействие протеин-протеин, вероятно са отговорни за наблюдаваната стабилност на образуването на MDA5 филамент in vitro и за по-висока сигнална активност в клетките (Sohn и Хур 2016).

Smyth и др. (2006) и Nejentsev et al. (2009) описват рядък алел на гена IFIH1, който осигурява защита от диабет тип 1 (T1D). Този rs35667974 IFIH1 еднонуклеотиден полиморфизъм (SNP), където запазеният изолевцин (кодон [ATT]) на позиция #923 се променя на валин (кодон [GTT]), е рядък вариант, тъй като честотата на второстепенния алел (MAF) е C {{ 9}}.010031 (2655 индивида в обща извадка от 264690) въз основа на TOPMED (Taliun et al. 2021) и C = 0.016267 (3343 индивида в обща извадка от 205514) въз основа на ALFA (Phan et др., 2020 г.; Шери и др., 2001 г.). В таблица 1 е представена човешката биогеография на честотата на полиморфизма в различни континентални региони въз основа на данните от проекта ALFA (Phan et al. 2020; Sherry et al. 2001). Последващите проучвания потвърдиха, че този рядък алел има същия ефект върху T1D, псориазис (PS) (Li et al. 2010) и псориатичен артрит (PsA) (Budu-Aggrey et al. 2017). Напротив, този SNP се свързва като рисков фактор за чувствителността към развитие на анкилозиращ спондилит (AS) (Ellinghaus et al. 2016), болест на Crohn (CD) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017 ) и улцерозен колит (UC) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017).

Чистяков и др. (2010) показват, че мутациите на загуба на функция E627X и I923V на MDA5 са свързани с по-ниска поли(I:C)-индуцирана продукция на интерферон в мононуклеарни клетки на периферната кръв на пациенти с диабет тип 1 и следователно са защитни за T1D. Също така се посочва, че в молекулата на MDA5 аминокиселинното заместване I923V се намира в близост до остатък H927, което допринася за свързването на dsRNA (Yoneyama и Fujita 2008). Показано е обаче, че MDA вариантът I923V има нормална способност за свързване на dsRNA, но 25-кратно намалена каталитична активност (Shigemoto et al. 2009). Следователно, изглежда, че този полиморфизъм не засяга по съществен начин свойствата за свързване на нуклеотидна киселина на тази цитоплазмена РНК-чувствителна хеликаза, но променя нейната функция чрез все още неизвестен механизъм.

Установена е връзката между полиморфизма на IFHI1 и честотата на ентеровирусна инфекция при T1D и връзката между варианта MDA5 I923V и честотата на ентеровирусна РНК при пациенти с T1D (Looney et al. 2015). Освен това, скорошни проучвания върху MDA5- и MAVSknockout мишки показаха критична роля на тези протеини в медиирането на отговорите на интерферон тип 1 срещу Coxsackie B вирус (Wang et al. 2010). Показано е, че водещ протеин на менговирус предотвратява експресията на IFN- чрез блокиране на димеризацията на IRF3, необходима за активирането на този фактор (Hato et al. 2007). Това наблюдение предполага, че варианти, които нарушават функцията на IFIH1 в антивирусния отговор на гостоприемника, са били отрицателно избрани, а не позитивно избрани, защото осигуряват защита от T1D (Crow 2011).

Чоу и др. (2018) са анализирали обстойно, между другото, подобните на RIG-I рецептори, докато Brisse и Ly (2019) са прегледали обстойно еволюцията и спецификацията на MDA5 и свързания с него RIG-I. Местоположението на променените остатъци в или близо до РНК-свързващите и АТФ-свързващите места или интерфейса на нишката ни накара да предположим, че наблюдаваните мутации могат да подобрят стабилността на IFIH1 нишката чрез увеличаване на вътрешния афинитет между IFIH1 и dsRNA или между IFIH1 молекули в нишката или чрез намаляване на ефективността на хидролизата на АТФ и по този начин скоростта на разглобяване на нишката (Rice et al. 2014).

Тази работа представлява структурно изследване на потенциалната роля на споделения rs35667974 вариант на автоимунен локус IFIH1, за който се съобщава, че води до инхибиран функционален фенотип, кодиращ аминокиселинно заместване на Ile923Val в IFIH1 генния протеинов продукт MDA5. Последният е биологично правдоподобен каузален кандидат-ген, споделен между няколко заболявания, влияещ върху контрола на локалната експресия на цитокини и хемокини, които предпазват от автоимунитет (Colli et al. 2010). Тази работа има за цел да изследва неизвестния все още механизъм, чрез който заместването на Ile923Val намалява каталитичната активност на човешкия MDA5. В това проучване ние изследвахме разликите във взаимодействието на MDA5 с dsRNA между нативния и редкия вариант Ile923Val при инициирането на механизма на възпаление. Съответно, ние имахме за цел да изследваме динамичното поведение на човешкия MDA5/dsRNA комплекс във водна среда в присъствието на Ile923 или Val923, когато урацил 2'-O е метилиран или не. Този структурен анализ на редки споделени локуси на генетична чувствителност или защита може да даде представа за нашето разбиране за патофизиологията на автоимунните заболявания и резултатите от изследването могат да повлияят на по-доброто управление на изследваните заболявания.

Материали и методи

Извличане на последователности, изграждане на филогенетично дърво и анализ на положителна селекция

Протеиновата последователност на Homo sapiens (ID на последователността: NP_071451.2) беше извлечена от базата данни UniProt (The UniProt Consortium 2021). За да се намерят хомолози между видовете, бяха извършени BLAST търсения с Mega BLAST (Национален център за биотехнологична информация, NCBI, Bethesda, MD, САЩ) в базата данни RefSeq и NR протеин (и PDB и UniProt), използвайки Blastp (протеин-протеин BLAST) с параметри по подразбиране (Altschul et al. 1997). Първоначално бяха избрани 1000 хомолози на човешки MDA5 протеини и междувидова селекция, фокусирана върху С-терминалния домен, съдържащ последователността около човешката I923V субституция, беше използвана за идентифициране на тази вариация в други видове. Clustal Omega, програмата за подравняване на множество последователности (Clustal-O) (Sievers et al. 2011) и сървърът за подравняване на множество последователности на T-Cofee (Notredame et al. 2000; Di Tommaso et al. 2011) бяха използвани за извършване на подравнявания на протеинови последователности и софтуер за биоинформатика на платформата Unipro UGENE (Okonechnikov et al. 2012) за селективно визуализиране на множество подравнявания.

Еволюционният анализ се използва за идентифициране на позиции върху протеиновите последователности, които са силно запазени при видовете, което показва структурно значение (Andreou et al. 2018). Филогенетичното дърво е конструирано с помощта на метода на максималната вероятност (Nei и Kumar 2000) и модела Tamura-Nei (Tamura и Nei 1993) с 500 първоначални реплики (Felsenstein 1985). Първоначалните дървета за евристичното търсене бяха получени автоматично чрез прилагане на Neighbor-Join и BioNJ алгоритми към матрица от разстояния по двойки, оценени с помощта на модела Tamura–Nei и след това избиране на топология с превъзходна стойност на логаритмична вероятност. Филогенетичният анализ включва 52 хомоложни нуклеотидни последователности (39 ортолога и 13 паралога) на човешкия IFIH1 ген. Включените кодонови позиции бяха 1-ви плюс 2-ри плюс 3-ти плюс некодиращи. Имаше общо 3729 позиции в крайния набор от данни. Еволюционните анализи бяха проведени с помощта на софтуерния пакет MEGA11 (Tamura et al. 2021).

За да открием дали генът IFIH1 е еволюирал адаптивно, използвахме програмата codeml в софтуерния пакет PAML v4.9j (Yang 2007). Нуклеотидната последователност и съответният файл за подравняване на протеинова последователност бяха изпратени на PAL2NAL (Suyama et al. 2006), за да се формират съответните входни CODEML файлове за подравняване на нуклеотиди. Анализите на положителната селекция за ортологичните MDA5 гени бяха извършени с помощта на модели на място и разклонение (Yang et al. 2005; Yang и Bielawski 2000). Съотношението на степента на несинонимно/синонимно заместване (ω=dN/dS) осигурява мярка за селективно налягане на ниво аминокиселина. Големината на стойността на dN/dS (ω) представлява типовете селекция: ω<1 for negative selection, ω=1 for neutral selection, and ω>1 за положителна селекция (Yang et al. 2005). В CODEML моделите на сайтове (M0, M1, M2, M3, M7 и M8) и моделите на сайтове на клонове (Clades A и C) бяха избрани за извършване на анализ на положителна селекция (Bielawski и Yang 2004; Yang и Nielsen 2002). В моделите на сайта тестът за съотношение на вероятност (LRT) беше използван за тестване на положителна селекция чрез сравняване на трите двойки модели (M0/M3, M2/M1 и M7/M8). Анализът беше извършен както за последователността с пълна дължина, така и за последователността на С-терминалния домейн (CTD).

Структурен анализ и симулации на молекулярна динамика

Структурата на криоелектронна микроскопия (cryo-EM) на нишка hMDA5–dsRNA в присъствието на ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018) (Berman et al. 2000) беше използвана като моделна система за молекулярната динамика ( MD) симулации. Всички протеинови остатъци бяха разделени (307–1020), 14-те базови двойки на двойноверижна РНК (dsRNA) и координираният цинк бяха запазени, докато липсващите остатъци бяха моделирани с помощта на сървъра SWISS-MODEL (Waterhouse et al. 2018). Параметрите на силовото поле и водородните атоми бяха добавени с помощта на XLEaP модула на AMBER 18 (Case et al. 2005). Силовите полета AMBER f14SB (Maier et al. 2015) и f99OL3 (Zgarbová et al. 2011) бяха използвани съответно за протеина и РНК с параметрите modrna08 (Aduri et al. 2007) за модифицирани нуклеозиди. Мутацията I923V е въведена в MDA5 чрез ръчно отстраняване на Cδ метиловата група на I923, докато модифицираната рибоза на U12 е метилирана при 2'-O, като се използва MRU остатък от библиотека modrna08. Цинковият йон се свързва с 4-те цистеинови остатъка 907, 910, 962 и 964, като се използват подходящи параметри на силовото поле за запазване на тетраедрична координационна сфера (дължини на връзката Zn–S от 2,35 Å с 50 kcal·mol–1·Å–2 силови константи и ъгли S–Zn–S от 109,5 градуса с 25 kcal·mol–1·rad–2).

По този начин подготвихме 4 системи за MD симулации: (i) нативната MDA5–dsRNA, (ii) MDA5(V923)–dsRNA, (iii) MDA5–dsRNA(2'OMe) и (iv) MDA5( V923)–dsRNA(2′OMe). Всички системи бяха солватирани в пресечени октаедрични кутии с разтворители от предварително уравновесени TIP3P водни молекули, с минимален буфер от 1 0 Å около комплекса и след това беше добавен необходимия брой противойони, за да се получи неутрализация на заряда на системите. MD симулациите бяха извършени с GPU-ускорената версия на PMEMD (Salomon-Ferrer et al. 2013) модул в AMBER 18 и времева стъпка от 2 fs. Температурата се регулира с помощта на термостат Langevin с честота на сблъсък от 1.0 ps–1, докато налягането се регулира с помощта на баростат Berendsen с време за релаксация на налягането от 1.0 ps. SHAKE беше използван за ограничаване на връзки, включващи водородни атоми с толеранс от 10–6 Å, докато несвързаните взаимодействия бяха изчислени с директна пространствена граница от 10 Å.

Минимизирането на енергията беше извършено първоначално за 1{{20}},000 стъпки с позиционни ограничения от 100 kcal·mol–1·Å–2 силова константа върху неводородните атоми на MDA5–dsRNA. След това разтворителят беше уравновесен при 300 K и 1 atm чрез кратки кръгове от симулации в NVT и NPT ансамблите, съответно 100 ps и 400 ps, ​​като същевременно се запазиха ограниченията върху неводородните атоми на разтвореното вещество. Впоследствие беше извършено минимизиране на енергията за 10, 000 стъпки, но с позиционни ограничения от 10 kcal·mol–1·Å–2 само върху С атомите на MDA5 и фосфатния скелет на dsRNA. В 3 суб бяха постепенно отпуснати (10.0, 1.0, 0.1 kcal·mol–1·Å–2) в продължение на 1 ns, последвани от 9 ns неограничено равновесие при постоянно налягане. След тези първоначални 10 ns балансиране (неизползвани в анализа), 100 ns производствени симулации в NPT ансамбъла бяха извършени за всяка система при 300 K и 1 atm, като същевременно се съхраняваха моментни снимки на системата на всеки 5,0 ps за анализ с помощта на CPPTRAJ модул на AMBER 18 (Roe and Cheatham 2013). Всички фигури, изобразяващи 3D модели, бяха генерирани с помощта на системата за молекулярна графика PyMOL (версия 2.3 с отворен код).

Резултати

Филогенетичен анализ на Ile923Val заместването на MDA5

Еволюцията и спецификацията на MDA5 и свързания с него RIG-I са прегледани обстойно от (Brisse and Ly 2019). Тук еволюцията на IFIH1 беше използвана за дефиниране на консервационни елементи в последователността на MDA5 относно конкретния полиморфизъм. Еволюционният анализ разкри тежка консервация на последователности сред MDA5 от различни видове (984 от 1000 изследвани последователности имат изолевцин в еквивалентната позиция на hMDA #923) в RD/CTD домейна, което показва структурно/функционално значение. Полиморфизмът rs35667974 в екзон 14 на човешкия ген причинява запазена аминокиселинна мутация на позиция 923 от Ile до Val в hMDA5. Въпреки това, има други шестнадесет отдалечени вида, които имат същата позиция, заета от валин (фиг. 1), което показва жизнеспособността на тази промяна между видовете в RD/CTD домейна на MDA5 и близко хомоложния RS/GY домейн на изоформи X1, X3 и DHX58 хеликази (фиг. 2). В допълнение, подравняването на последователността на региона около позицията на hMDA #923 (взаимодействащата верига на MDAs CTD) разкрива умерена до силно запазена последователност сред отдалечени видове, което показва функционалното значение на региона между видовете.

Откриване на положителна селекция

За да се установи дали генът IFIH1 е еволюирал адаптивно, бяха използвани модели на място и модели на място на разклоняване за извършване на анализ на положителна селекция на ортолози на целия ген и CTD домейна. В моделите на сайтове не са идентифицирани сайтове за положителна селекция за CTD домейна (Таблица 2). M0 предполага постоянна скорост на еволюция (ω=dN/dS=0.2) (Таблица 2). Някои сайтове, които са били подложени на положителна селекция, бяха идентифицирани с помощта на метода на моделите на M2- и M8-сайта за целия ген (Допълнение към таблица 1), въпреки че не в РНК взаимодействащите региони и CTD домейна. В моделите на сайта ω (dN/ dS) е<1 which indicates a highly conserved gene (Table 2, Suppl. Table 1). In the branch-site model, the human branch (as well as the primate's branch) was used as the foreground clade, the ω value was low, and no sites with posterior probability greater than 0.85 were identified (Suppl. Table 2).

По-специално, за модела C на сайта на клона за домейна CTD (Допълнение към таблица 3), 33 процента от сайтовете се развиват в категория ω0=0. 036. Тъй като сайтовете, развиващи се в тази категория, не правят разлика между типовете клонове, и двата типа клонове имат една и съща стойност на ω за сайтове в тази категория. Освен това 55 процента от сайтовете се развиват в категория ω2. И все пак те имат ω стойности, които зависят от типа на разклонението (ω20=0.25 и ω21=0). Също така, за модела на разклонение C за 39 ортологични MDA5 гени (Допълнение към таблица 4), 33 процента от сайтовете се развиват в категория ω0=0. 027. От друга страна, 41 процента от сайтовете се развиват в категория ω2. И все пак те имат ω стойности, които зависят от типа на разклонението (ω20=0.25 и ω21=15.32).

Структурен анализ

Проведеният еволюционен анализ показва, че заместването на Ile923Val не е уникален вариант в човешкия вид, тъй като Val съществува в позицията на последователността MDA5 и в други видове. MDA5 е вирусен двойноверижен РНК (dsRNA) рецептор, който играе ключова роля в антивирусния имунитет чрез своята отчетлива специфичност за вирусна РНК (Wu et al. 2013). Показано е, че 2'-O-метилирането на вирусна иРНК е важно за вродените имунни отговори, поради което се предполага, че 2'-O-метилирането е молекулярен подпис за разграничаване на собствената спрямо несобствената иРНК. (Zust et al. 2011). За да изследваме потенциалната роля на заместването на Ile923Val в миссенс IFIH1 варианта rs35667974, ние анализирахме структурата на криоелектронна микроскопия (cryo-EM) на нишка MDA5–dsRNA в присъствието на ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018). Позиция 923 е разположена на бримката 921–927, която взаимодейства директно с dsRNA (фиг. 3A). По-специално, Ile923 се намира на 4.8 Å от 2′-ΟΗ на уридин U12 и тяхното взаимодействие се стабилизира чрез водородна връзка между съседния His927 и урациловата база. Не се очаква заместването на Ile923 с Val във вариант rs35667974 да въведе някакви пространствени сблъсъци, вместо да минимизира взаимодействията с 2′-ΟΗ на уридин U12 (Фиг. 3B). В случай, че РНК е метилирана при рибозата на U12, тогава естественият вариант на MDA5 с Ile923 показва благоприятен ван дер Ваалсов контакт с 2′-OMe група на U12 при 3,6 Å (фиг. 3C), докато Val923 на варианта rs35667974 е разположен на 5.0 Å (фиг. 3D). Тези разлики не могат да предполагат голям ефект от заместването на Ile923Val само по себе си; въпреки това, фините структурни промени често водят до значителни функционални промени чрез нарушаване на структурната динамика на системата.

Изчисления на молекулярната динамика

За да изследваме ефекта от I923V мутацията на MDA5 в нейното взаимодействие с dsRNA, както нативна, така и 2′-Ο-метилирана, ние използвахме симулации на молекулярна динамика на 4 системи в 100-ns времева скала. Динамиката на системите се наблюдава, като се използват средноквадратичните флуктуации (RMSF) на всеки протеинов остатък и разстоянието на водородна връзка на H927 с U12 (фиг. 4). Нашите изчисления предполагат, че мутацията на I923 до V923 в MDA5 е довела до незначително смущение на динамиката в контактната област на РНК (остатъци 923–934) и веригата на междупротеиновото взаимодействие (950–955) на комплекса с естествена dsRNA (фиг. 4C) . Това наблюдение е подобно в случая на 2'-O-метилиране в U12, въпреки че се наблюдава по-изразен ефект в общата динамика на карбокси-терминалния регион на MDA5 V923 мутант (фиг. 4D).

Сега, като се има предвид ключовото взаимодействие на водородна връзка на съседния остатък H927 с урациловата база, нашите MD симулации предполагат, че метилирането при 2'-O не го засяга в естествения MDA5 (фиг. 4E). Въпреки това, V923 мутацията не засяга водородната връзка на H927 в нативната dsRNA, но показва дестабилизиращ ефект в присъствието на 2'-O-метилиране (фиг. 4F). Взети заедно, нашите MD симулации предполагат, че въпреки че ефектът от I923V мутацията на MDA5 във взаимодействието с нативната dsRNA е незначителен, неговият ефект върху динамиката и стабилността на комплекса MDA5/RNA е по-значим, когато урацилът е 2′-O-метилиран .

Дискусия

Това проучване представлява еволюционно и структурно изследване на ролята на споделения rs35667974 вариант на автоимунен локус IFIH1, за който се съобщава, че води до модифициран функционален фенотип за MDA5 (Downes et al. 2010). Прилагането на модели на еволюционно място и място на разклоняване за извършване на анализ на положителна селекция не показва места на положителна селекция в сайтовете за взаимодействие на РНК, където се намира полиморфизмът rs35667974. Нито моделите на сайтове на клонове показват, че някои конкретни сайтове са преминали положителна селекция в домейна CTD.

Това е в съгласие с много ниските честоти на появяване на варианта Ile923Val дори сред човешката популация (Таблица 1). Въпреки това, европейската популация в сравнение с останалите има разлика в честотата на алела С от един порядък. Без да пренебрегваме малкия размер на извадката, географското разпределение на изследвания полиморфизъм показва, че появата му в европейското население като отправна точка може да се дължи на условията на живот и хранене, които са се променили през последните години. Структурното изследване на ролята на изследвания SNP беше извършено чрез изследване на структурата на dsRNA-MDA5 (нативен и мутантен) комплекс.

На нивото на образуване на комплекс dsRNA-MDA5 въвеждането на мутацията Ile923Val влияе върху взаимодействието на протеиновия С-терминален домен (CTD) с dsRNA с въвеждането на хидрофобна кухина до рибозната захар на едната верига на dsRNA . Ние показахме, че в случай на метилирана РНК във фосфорибозилната верига на едната верига, допълнителни динамични ефекти могат да повлияят на взаимодействието на мутанта, без да засягат дивия тип. Това е в съгласие с експериментални проучвания (Looney et al. 2015; Brisse and Ly 2019), показващи, че ефектът на полиморфизма на Ile923Val, идентифициран в близост до точка на взаимодействие MDA5-dsDNA, може да не повлияе на нативните dsRNA-свързващи свойства, но е променен от 25-кратно намаляване на каталитичната активност (Shigemoto et al. 2009). Също така, молекулярно-динамичните изследвания показват критичната роля на метилирането в мутанта по отношение на мобилността и стабилността на MDA5 вериги 941–959 и 970–977, участващи във взаимодействието на dsRNA и интерпротеиновото взаимодействие при образуването на MDA нишка. Такива ефекти могат да възпрепятстват сглобката на нишките MDA5, асоциацията MDA5–MAVS и сглобката на нишките MAVS, които допълнително активират експресията на гените на интерферон тип I (IFN1: IFN и IFN). В случаите на T1D и PsA, като следствие, намалените нива на активността на протеина MDA5 и следователно по-ниското производство на IFN предпазват от автоимунитет. Тези наблюдения предполагат, че няколко варианта на IFIH1, за които се предвижда да повлияят на взаимодействието на MDA5 с MAVS и намаляването на производството на IFN, биха намалили риска от заболявания, докато нормалната функция на MDA5 е свързана с тях (Shigemoto et al. 2009).

Това води до заключението, че както в случая на вирусна РНК, само-dsRNA метилиране, РНК-идентифицирана мутация, е важен фактор за подбор/активиране за въвеждане на защитни ефекти при някои автоимунни заболявания. Резултатите от настоящото изследване разширяват знанията за биологичното значение на rs35667974 SNP на IFIH1 локус в развитието на гореспоменатите заболявания и подчертават важността на изследванията на споделени гени от множество автоимунни заболявания. Въпреки това, в популационни изследвания за генетична асоциация на SNPs с автоимунни заболявания, като се използват, например, PCR-RFLPs, секвениране или генотипни чипове, случай на РНК метилиране не се взема предвид. Следователно е важно да се знае състоянието на метилиране на взаимодействащата dsRNA и неговия ефект върху алела MDA5. Както в случая с разпознаването на вирусна dsRNA (Wu et al. 2013) и разграничението между собствена и несобствена mRNA (Züst et al. 2011), загубата на метилова група от взаимодействащия MDA5, както в случая на мутант Ile923Val MDA5, може да повлияе на образуването на филамент и индуцирането на тип I интерферон.

Трябва да се отбележи, Plenge et al. (2013) преди това са обсъждали потенциала на рядък вариант в ген на причинно-следствена болест да представлява предполагаема терапевтична цел за фармацевтична интервенция. За тази цел биологичната функция на причинния вариант трябва да бъде известна при всеки опит за свързване на генетични открития с нова терапевтична цел. Следователно, локализирането на позицията на причинен вариант в 3D структурата на съответния протеин и изследването на неговата роля от структурна/функционална гледна точка в патогенетичен път, водещ до автоимунно заболяване, изглежда е от основно значение за по-нататъшното управление и по-доброто лечение на пациентите. Остава върховна необходимост да се премине отвъд откриването на свързани SNPs към по-задълбочено разбиране на причинно-следствените варианти, за да се изяснят молекулярните механизми и пътища на заболяването. Необходим е по-нататъшен структурно-функционален анализ, за ​​да се изследва свързването на рибоза-2′-Ο-метилирана собствена dsRNA към MDA5 и как това влияе върху сглобяването на фибрилите на MDA5. Неуловимата биологична роля на 2'-Ο-метилираната иРНК като сензор за разграничаване между вирусна и собствена иРНК при индуцирането на интерферон тип I може да е била разширена до защитен сензор при някои автоимунопатии.

Заключение

Редкият полиморфизъм на гена rs35667974 IFIH1 предпазва от T1D, PS и PsA, докато алелът IFIH1, носен от по-голямата част от населението, предразполага към заболяванията. Финансирането, че мутантният Ile923Val MDA5 функционира по различен начин във взаимодействието със собствената dsRNA и по-специално с 2'-O-метилираната предполага, че в някои случаи варианти, взаимодействащи с метилирана dsRNA, нарушават образуването на MDA5 нишка, MAVS взаимодействието и образуването на нишка, и IFN сигнализирането, както при антивирусния отговор на гостоприемника, може да е било отрицателно избрано, тъй като осигурява защита от болести.

Авторски принос

Концептуализация—AA, AP, EEE и GNG, методология—AA, AP и EEE, валидиране—AA, AP, MIZ, GNG и EEE, разследване—GNG, AA, AP и MIZ, ресурси—GNG, AA, AP и MIZ, обработка на данни—AA и AP, писане и подготовка на оригинална чернова—EEE, GNG, AA, AP и MZ, писане, рецензиране и редактиране на ръкописа—AA, AP, MZ, GNG и EEE, визуализация—AA, AP и EEE, надзор—EEE и придобиване на финансиране—EEE. Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране

Финансирането с отворен достъп се осигурява от HEAL-Link Гърция. Тази работа беше подкрепена от проекта „INSPIRED-Националните изследователски инфраструктури за интегрирана структурна биология, усилия за скрининг на лекарства и целева функционална характеристика на лекарства“ (грант MIS 5002550), който се изпълнява в рамките на действие „Подсилване на инфраструктурата за научни изследвания и иновации“, финансиран от Оперативна програма „Конкурентоспособност, предприемачество и иновации“ (НСРР 2014–2020) и съфинансиран от Гърция и Европейския съюз (Европейски фонд за регионално развитие).

Наличност на данни

Наборите от данни, използвани и/или анализирани по време на настоящото проучване, са достъпни от съответния автор при поискване.

Декларации

Конфликт на интереси

Авторите декларират липса на конфликт на интереси. Финансиращите нямат никаква роля в дизайна на проучването; при събирането, анализите или тълкуването на данни; в написването на ръкописа или в решението за публикуване на резултатите.

Етично одобрение

Не е приложимо.

Съгласие за участие

Не е приложимо.

Съгласие за публикуване

Не е приложимо.

Свободен достъп

Тази статия е лицензирана съгласно международен лиценз Creative Commons Attribution 4.0, който позволява използване, споделяне, адаптиране, разпространение и възпроизвеждане във всякакъв носител или формат, стига да посочите подходящото признание на оригиналния автор(и) ) и източника, осигурете връзка към лиценза Creative Commons и посочете дали са направени промени. Изображенията или други материали на трети страни в тази статия са включени в лиценза Creative Commons на статията, освен ако не е посочено друго в кредитната линия към материала. Да предположим, че материалът не е включен в лиценза Creative Commons на статията и предвидената от вас употреба не е разрешена от законовите разпоредби или надхвърля разрешената употреба. В този случай трябва да получите разрешение директно от притежателя на авторските права.

Препратки

1. Aduri R, Psciuk BT, Saro P et al (2007) AMBER параметри на силовото поле за естествено срещащите се модифицирани нуклеозиди в РНК. J Chem Theory Comput 3:1464–1475.

2. Altschul SF, Madden TL, Schäfer AA et al (1997) Gapped BLAST и PSI-BLAST: ново поколение програми за търсене на протеинови бази данни. Нуклеинови киселини Res 25:3389–3402.

3. Andreou A, Giastas P, Christoforides E, Eliopoulos EE (2018) Структурни и еволюционни прозрения в рамките на генното семейство на полизахаридната деацетилаза на bacillus anthracis и bacillus cereus.

4. Aučynaitė A, Rutkienė R, Tauraitė D et al (2018) Идентифициране на 2'-O-метилуридин нуклеозидна хидролаза с помощта на метагеномни библиотеки. Молекули.

5. Berman HM, Westbrook J, Feng Z et al (2000) The protein data bank. Нуклеинови киселини Res 28: 235–242.

6. Bielawski JP, Yang Z (2004) Метод на максималната вероятност за откриване на функционална дивергенция в отделни сайтове на кодони, с приложение към еволюцията на генното семейство.

7. Biros E, Jordan MA, Baxter AG (2005) Гени, медииращи взаимодействията на околната среда при диабет тип 1.

8. Boccaletto P, Machnicka MA, Purta E, et al (2018) MODOMICS: база данни за пътища за модификация на РНК. 2017 актуализация. Нуклеинови киселини Res 46:D303–D307.

9. Brisse M, Ly H (2019) Сравнителен анализ на структурата и функцията на RIG-I-подобните рецептори: RIG-I и MDA5.

10. Budu-Aggrey A, Bowes J, Stuart PE et al (2017) Рядък кодиращ алел в IFIH1 е защитен за псориатичен артрит. Ann Rheum Dis 76:1321–1324.

For more information:1950477648nn@gmail.com