In Silico Дизайн на безразборна химерна мулти-епитопна ваксина срещу Mycobacterium Tuberculosis Част 2

 2.15. Преглед на дизайна на многоепитопна ваксина

Фигура 1 обобщава цялостната концепция на този дизайн на мулти-епитопна ваксина. Накратко, анализирахме антигенността на протеини на M. tuberculosis, получени от IEDB и избрахме осем антигенни кандидати за изграждане на мулти-епитопна ваксина, като взехме предвид тяхната функционална класификация и субклетъчна локализация. След това предвидихме антигенните епитопи на тези осем протеина и избрахме 15 CTL епитопа, 16 HTL епитопа и 10 В-клетъчни епитопа, които бяха допълнително свързани с HBHA адювант и PADRE чрез подходящи линкери. Освен това, ние предвидихме антигенността, алергенността, физикохимичните свойства и имуногенния профил на проектираната мулти-епитопна ваксина. Междувременно ние също предвидихме вторичните и третичните структури на ваксината и анализирахме нейното потенциално взаимодействие с TLR4 имунния рецептор.

Mycobacterium tuberculosis е често срещан патоген, който причинява туберкулоза. Протеинът на Mycobacterium tuberculosis е един от основните компоненти на Mycobacterium tuberculosis, който е много критичен за функцията на човешката имунна система.

Протеинът на Mycobacterium tuberculosis може да активира човешката имунна система и да подобри имунитета на организма. Когато тялото е заразено с Mycobacterium tuberculosis, човешката имунна система ще произведе поредица от имунни отговори, включително активиране и пролиферация на специфични Т клетки и В клетки. Тези клетки могат да отделят различни имунни фактори, като интерферон, интерлевкин и др., както и антитела, за да помогнат на тялото да устои на нахлуващите Mycobacterium tuberculosis.

В допълнение, протеинът Mycobacterium tuberculosis може също да регулира баланса на имунната система и да избегне имунни увреждания, причинени от прекомерно активиране на имунния отговор на организма. През последните години изследванията и разработването на ваксини срещу туберкулоза също се фокусират основно върху приложението на протеин от Mycobacterium tuberculosis, който може да подобри имунитета на човешката имунна система чрез ваксинация и ефективно да предотврати появата и разпространението на туберкулоза.

Следователно протеинът на Mycobacterium tuberculosis е много важен за ефекта на човешкия имунитет. Чрез активно укрепване на имунната система, чрез правилни упражнения и разумно хранене, можете по-добре да предотвратите туберкулозата и други инфекциозни заболявания и да поддържате добро здраве. От тази гледна точка трябва да подобрим имунитета си. Cistanche може значително да подобри имунитета, тъй като полизахаридите в месото могат да регулират имунния отговор на човешката имунна система, да подобрят способността за стрес на имунните клетки и да повишат имунитета на имунните клетки. Бактерициден ефект.

Кликнете върху добавката Cistanche deserticola

3. Резултати

3.1. Извличане на протеини от M. tuberculosis за конструиране на мулти-епитопна ваксина

За да конструираме мулти-епитопна ваксина срещу туберкулоза, първо анализирахме антигенността на протеините в M. tuberculosis H37Rv. Общо 492 протеина с валидирани имунологични свойства бяха получени от базата данни на IEDB, от които 402 протеина (81,70 процента) бяха предвидени като антигенни. За функционалното характеризиране на тези 492 протеина, 353 бяха обогатени в базата данни DAVID, докато 139 не бяха. Анализът на локализацията показа, че 97 от 353 обогатени протеини са локализирани в извънклетъчното отделение, пространството извън клетъчната повърхност. Протеините, локализирани в извънклетъчния компартмент, включват протеини на външната мембрана и секретирани протеини.

Сред 97 протеина, 49 са секреторни протеини. По-нататъшното обогатяване на 49 секретирани протеина разкри, че пет протеина се секретират в извънклетъчното пространство и пет са необходими за патогенезата (експериментално потвърдено от BioCyc) [48]. Освен това, когато тези десет протеина бяха подравнени с общите протеини на H. sapiens, два протеина (Mpt83 и Mpt70) бяха много подобни на протеините на H. sapiens. Следователно, останалите осем протеина, които не са подобни на протеините на H. sapiens (Таблица 1), се считат за окончателни кандидати за конструирането на мулти-епитопна ваксина.

3.2. Прогнозиране на Т-клетъчни и В-клетъчни епитопи на кандидат протеини

Преди прогнозирането на епитопа, сигналните пептиди бяха идентифицирани и изтрити от кандидат протеини. Общо 623 CTL епитопа от осем кандидат протеина със 135 силни свързващи вещества (16 от A1, 40 от A2, 22 от A3, 19 от A24 и 38 от B7 супертипове на MHC клас I) бяха предсказани от NetMHCpan{{12} }.1 сървър (фиг. 2A, B). Сред 135-те силни свързващи вещества, 36 са антигенни и имуногенни. Накрая, ние избрахме 15 от 36 CTL епитопа според следните критерии: три епитопа за супертип и поне един за кандидат протеин (Забележка: EsxA няма силно свързващо вещество, което е антигенно и имуногенно) (Таблица 2).

Освен това, ние предвидихме техните HTL епитопи (MHC клас II епитопи). {{0}}mer епитопи от четири алела (HLA_DRB, HLA_DP, HLA_DQ и H-2-I) с процентно класиране По-малко или равно на 2.0 се считат за силни свързващи вещества и се класират от най-ниския до най-високия резултат. HLA-DR алелите имат най-голям брой MHC II свързващи вещества (2990), докато HLA-DP има най-малко (601) (Фиг. 2C, D). Трябва да се отбележи, че имунният отговор при грануломатозни заболявания като туберкулоза, проказа и саркоидоза е доминиран от IFN-продуциращи Т-хелпер -1 (Th1) клетки [97]. В допълнение, предишни доклади разкриха, че експресията на Th1 цитокини (IFN- и IL2) намалява при пациенти с туберкулоза [98]. Следователно, за да стимулираме Th1 клетките, ние предвидихме 15-mer IFN- -индуциращи пептиди на тези протеини. Общо 534 епитопа с IFN-индуцираща активност бяха предвидени с помощта на NetMHCIIpan 4.0, от които 315 епитопа са антигенни. От тези 315 епитопа, 103 показват силна активност на свързване към поне един HLA алел.

Също така, полиморфизмът в HLA алелите води до алелни вариации, водещи до широко разграничени пептид-свързващи специфичности [55]. В резултат на това избрахме един епитоп с най-силна активност на свързване (най-промискуитетният епитоп) от всеки от осемте кандидат протеина. В допълнение, останалите 95 епитопа бяха класирани въз основа на силата на свързване и след това бяха избрани допълнителни осем епитопа, с максимум два епитопа на кандидат протеин. Накрая, ние избрахме 16 от 103 HTL епитопа според следните критерии: най-малко един епитоп и максимум три епитопа на кандидат протеин, най-силна свързваща активност за кандидат протеин и повечето антигенни и IFN-индуциращи. След това ги използвахме, за да конструираме тази мулти-епитопна ваксина (Таблица 2).

Що се отнася до прогнозирането на линейни В-клетъчни епитопи, бяха използвани два сървъра (BepiPred2.0 и ABCpred) и бяха получени 166 епитопа. Ние предвидихме антигенността на първите пет епитопа за всеки протеин и след това избрахме десет антигенни епитопа (16-mer, поне един от всеки кандидат протеин) (Таблица 2).

3.3. Конструиране на многоепитопна ваксина

За конструиране на мулти-епитопна ваксина, HBHA, PADRE, 16 HTL (15-mer), 15 CTL и 10 линейни В-клетъчни (16-mer) епитопи бяха свързани чрез подходящи линкери и опаковани от His × 6 етикет (фиг. 3). Адювантите са важни компоненти на ваксините, които могат да засилят вродените и адаптивни имунни отговори [99]. Много протеини от M. tuberculosis имат адювантни свойства и са използвани за проектиране на ваксини [17,27,87,100–105]. Един от най-широко използваните е HBHA [100–105], който е мощен имуностимулант, който индуцира узряването на дендритни клетки (DC) чрез обработка на TLR4 [105,106]. Установено е, че DC, третирани с HBHA, активират наивни Т клетки, поляризират CD4 плюс и CD8 плюс Т клетки, за да секретират IFN- и индуцират Т-клетъчно медиирана цитотоксичност [47].

В това проучване ние поставихме HBHA като протеинов адювант в N-края, тъй като е подходящ за иницииране на синтеза на конструкцията на ваксината от HBHA, естествено срещащ се протеин. HBHA преди това е бил поставян в N-края на някои мултиепитопни ваксини като адювант [105,107]. В допълнение към адювантите, PADRE, който е безопасен за хората, може значително да подобри имуногенността на ваксината, тъй като се свързва с висок афинитет към множество миши и човешки MHC-II алели с висок афинитет за индуциране на реакции, медиирани от Th клетки [47,62]. HBHA и PADRE бяха свързани чрез спирален PEAK линкер, който осигурява твърдост, като същевременно разделя двата протеинови компонента, за да подобри ефективността и да намали смущенията. Освен това, Glu-Lys солен мост, образуван в сегментите, стабилизира линкера.

Тъй като PADRE може да подобри активността на HTL епитопите на ваксината [54], ние поставихме 16 HTL епитопа след PADRE. GPGPG линкерът беше използван за свързване на HTL епитопи един с друг и с PADRE, тъй като улеснява прогресията на имунните клетки и представянето на епитоп [108,109]. Освен това, GPGPG индуцира HTL имунен отговор, който може да наруши имуногенността на връзката и да възстанови имуногенността на отделните епитопи след обработка [108].

За 15-те CTL епитопа, индивидуалният епитоп е свързан с AAY линкер, който помага на епитопа да произведе подходящи места за свързване с TAP транспортера и да подобри представянето на епитопа [47]. Освен това, цялата CTL епитопна субединица беше свързана с горните HTL епитопи чрез HEYGAEALERAG линкера, който притежава пет подходящи места на разцепване (A7-L8, A5-E6, Y3-G4, R 10-A11 и L8-E9), които са от съществено значение за еукариотните протеазомни и лизозомни системи за разграждане. При еукариотите протеазомите и лизозомите са най-важният протеолитичен механизъм, който използва съответно убиквитин-протеазомната система (UPS) и автофагичния път [110].

HEYGAEALERAG линкер също беше използван за свързване на CTL епитопна субединица към 10 низходящи линейни В-клетъчни епитопа, свързани заедно с KK линкери. Според предишни проучвания KK линкерът предотвратява индукцията на антитела в аминокиселинната последователност, получена от комбинацията на двата пептида, като по този начин улеснява специфичното показване на всеки пептид към антитялото [111]. Накрая, His × 6 етикет беше прикрепен към С-края на последния линеен В-клетъчен епитоп за последващо пречистване и характеризиране на ваксината (Фигура 3).

Крайният химерен протеин се състои от 933 аминокиселинни остатъка, започвайки с HBHA адювант, последван от 41 епитопа и завършвайки с His × 6 етикет (Фиг. 3). Тъй като този химерен протеин е съставен от мулти-епитопни антигени от осем протеина, ние го нарекохме MTBV8, мулти-епитопна туберкулозна ваксина, получена от 8 кандидат-протеина.

3.4. Анализ на антигенността, алергенността и физикохимичните параметри на MTBV8

Предишни проучвания показват, че антигенността е необходима на човешките ваксини, за да предизвикат хуморални имунни отговори, водещи до генериране на клетки на паметта, насочени срещу епитопи на инфекциозни агенти [112]. Затова прогнозирахме антигенността на мулти-епитопната ваксина MTBV8 с помощта на сървъра VaxiJen 2.0 и получихме антигенност от 0.97, което е значително по-високо от праговата стойност ({{7} }.4) [45,46] за бактериален протеин, който да се счита за антигенен. Трябва да се отбележи, че MTBV8 е по-антигенен от всички компонентни протеини (фиг. 4), което предполага, че може ефективно да стимулира имунните отговори на гостоприемника

Освен това се съобщава, че много микробни макромолекули имат потенциала да индуцират реакции на свръхчувствителност при хора [113]. За да анализираме проблема със свръхчувствителността на MTBV8 и осемте съставни протеина, прогнозирахме тяхната алергенност, използвайки сървъра AllerTOP 2.0. Два от осемте компонентни протеини (LprA и EspC) се предвиждат като алергени (Таблица 1). Трябва да се отбележи, че въпреки че проектираната мулти-епитопна ваксина (MTBV8) съдържа десет епитопа, получени от тези два протеина, се прогнозира, че не е алергична, което показва, че тази ваксина е безопасна.

За да характеризираме допълнително MTBV8, ние анализирахме неговите физикохимични свойства чрез сървъра ExPASy ProtParam. Рекомбинантният протеин има молекулно тегло 94,84 kDa и изоелектрична точка 8,91. Освен това протеинът се счита за стабилен с изчислен индекс на нестабилност (II) от 26,44 (протеини с индекс на нестабилност > 40 се считат за нестабилни) [64]. Изчисленият in vitro полуживот е 30 h в ретикулоцити на бозайници, по-дълъг от in vivo 20 h в дрожди и in vivo 10 h в E. coli. В допълнение, алифатният индекс на MTBV8 е 71.91, а общата средна стойност на хидрофилност (GRAVY) е -0.32, което показва, че рекомбинантният протеин е хидрофилен. И накрая, пропорционалната стойност на разтворимост за MTBV8 (0,54) е по-голяма от средната за набора от данни за популацията (0,45), което показва, че кандидатът за ваксина е по-разтворим от половината от протеините на E. coli [114]. Горните резултати показват, че MTBV8 има добри физични и химични свойства и е подходящ за използване като ваксина.

3.5. Имуногенен профил на MTBV8

За да оценим профила на имуногенност на MTBV8, ние анализирахме имунните отговори in silico чрез C-IMMSIM имунния сървър. Както е показано на Фиг. 5А, титрите на IgM и IgG1 бяха значително повишени след вторична имунна стимулация от MTBV8. Освен това, нивото на активните В-клетки се повишава и остава на високо ниво след всяка имунизация (фиг. 5В). Дори за В клетките в плазмата, В изотиповете IgM и IgG1 остават високи след имунизация (допълнителна фигура 1A, B). Що се отнася до ефекта върху Т клетките, нивата на Th клетките на паметта (y2) (допълнителна фигура 1C) и активните Th клетки (фигура 5C) се повишават бързо след първична имунизация и са значително повишени след вторична имунизация. Регулаторните Т клетки (предимно активни клетки) се стимулират при първоначална имунизация и след това бързо намаляват (допълнителна фигура 1D). Интересно е, че нивото на активните цитотоксични Т (Тс) клетки се повишава бързо след първичната имунизация, остава високо при втората имунизация и след това намалява стабилно, докато почиващите Тс клетки показват обратната тенденция към активни Тс клетки (фиг. 5D). Обратно, нивата на анергични (y2) Tc клетки (Фиг. 5D) и Tc клетки на паметта (допълнителна фигура 1E) остават непроменени при имунизация. В допълнение, трябва да се отбележи, че нивата на имунните фактори IFN- и IL-2, секретирани от Т клетки, които са критични за имунния отговор срещу M. tuberculosis [115], също значително се повишават след MTBV8 имунизация (фиг. 5E).

Освен това, ние предвидихме ефекта от ваксинацията с MTBV8 върху популациите на вродени имунни клетки (Фиг. 5F и Допълнителна Фигура 1FH). Представящите -2 клетки в DCs и макрофагите се увеличават бързо при първата имунизация, докато само малко увеличение се наблюдава след втората имунизация (фиг. 5F и допълнителна фигура 1G). В допълнение, при макрофагите, първата имунизация води до едновременно увеличаване или намаляване на активните и почиващите макрофаги. Няколко седмици след втората имунизация, активните макрофаги намаляват бързо, докато макрофагите в покой се увеличават бързо. (Допълнителна фигура 1G). По-специално, естествените клетки убийци и активните епителни клетъчни популации показват доста постоянен модел при имунизация. (Допълнителна фигура 1F, H). Взети заедно, тези прогнози предполагат, че MTBV8 може мощно да стимулира както вродените, така и адаптивните имунни отговори, което го прави потенциално ефективен кандидат за ваксина.

3.6. Прогнозирани вторични и третични структури на MTBV8

За да характеризираме по-добре MTBV8, ние предвидихме неговите вторични и третични структури, последвани от прецизиране на неговата третична структура. Вторичната структура на MTBV8 се състои от 42,12 процента спирали, 11,79 процента нишки и 46,09 процента намотки (допълнителна фигура 2). Според прогнозите на DISOPRED3, 27,11% от аминокиселинните остатъци са нарушени.

Третичната структура на MTBV8 беше предсказана от I-TASSER сървъра и бяха получени 5 модела с добри C-резултати. C-резултатът е между −5.0 и 2.0 и е пропорционален на надеждността на прогнозата. Тези модели бяха подложени на ProSA-web анализ и модел 4 беше избран поради следните характеристики; C резултат=−3,8, Z резултат=−4,4. Графичният анализ на Ramachandran на тази третична структура показа, че по-малко от 70.0 процента от остатъците са в предпочитани региони, поради което е необходимо допълнително усъвършенстване на третичната структура.

Третичната структура, получена от I-TASSER, беше прецизирана от сървъра ModRefiner, последван от сървъра GalaxyRefine за генериране на пет модела. Сред петте усъвършенствани модела, модел 2 имаше най-добрата структура при разглеждане на следните параметри: Тест за глобално разстояние, висока точност (0.89), RMSD (0.58), MolProbity (2.31), сблъсък резултат (14,8), лош ротамер резултат ({{10}}.80) и резултат на Рамачандран (86.5 процента) (Фиг. 6А). Анализът на Рамачандран на тази структура с помощта на PROCHECK разкри, че от 753 неглицинови, непролинови и нетерминални остатъци, 78,9 процента от тях са в най-благоприятния регион [A, B, L], 17,3 процента са в допълнително позволен регион [a, b, l, p] и 1,5 процента в общо позволения регион [∼a, ~b, ~l, ~p], със само 2,4 процента в забранения регион (фиг. 6B). Когато анализирахме диаграмата Рамачандран на рафинираната структура, използвайки Molprobity, открихме, че 86.5 процента от аминокиселинните остатъци са разположени в благоприятния регион, който е същият като получен от сървъра GalaxyRefine (фиг. 6C) . Освен това, 98,0 процента от остатъците бяха в допустимата област, докато 19 остатъка бяха отклонения (phi, psi) (фиг. 6C). Въпреки че усъвършенстваният модел има повече остатъци в предпочитания регион в сравнение с модела, генериран от I-TASSER, той се нуждае от допълнително валидиране.

Валидирането на модела е ключова стъпка в процеса на изграждане на модела, тъй като може да идентифицира потенциални грешки в прогнозирани 3D модели [116]. За валидиране на усъвършенствания модел на MTBV8 бяха извършени анализи ProSA-web и ERRAT. ProSA-уеб анализът показа Z-резултат от -5,76 за MTBV8 (фиг. 6D), който беше малко извън експериментално определения диапазон от резултати за протеини с подобен размер. Анализът ERRAT обаче показа общ фактор на качеството от 70,94 за пречистен MTBV8. Тъй като ERRAT резултат, по-голям от 50, представлява модел с добро качество [117], резултат от 70,94 показва, че имаме високо доверие в моделираната структура за последващ анализ.

3.7. Молекулярно свързване на MTBV8 с рецептори на имунни клетки

Силният афинитет на ваксините към рецепторите на имунните клетки води до стабилен имунен отговор [118]. За да придобием представа за потенциалните взаимодействия между MTBV8 и рецепторите на имунните клетки, ние извършихме молекулярно докинг между MTBV8 и имунния рецептор TLR4 (фиг. 7A и B). Предишни проучвания показват, че TLR4 лигандите могат да активират DCs, които от своя страна активират наивни Т клетки, ефективно поляризират Т клетки (CD4 плюс и CD8 плюс клетки), за да секретират IFN- и да индуцират медиирана от Т клетки цитотоксичност [106]. Тези процеси биха довели до увеличаване на групата от ефекторни клетки на паметта [119]. Тъй като взаимодействието на TLR4 с антигенни пептиди води до отговори срещу туберкулозна инфекция, ние се фокусирахме върху взаимодействията между MTBV8 и TLR4 (фиг. 7A). Резултатите от молекулярно скачване от Firedock показаха, че най-предпочитаният рафиниран модел има глобална енергия от −40,28, атрактивна енергия на Ван дер Ваалс (aVdW) от −19.86, енергия на отблъскване (червено) от 2,19, атомна контактна енергия от 4,70 и принос на водородна връзка (HB) от −1,03 (фиг. 7B). Освен това, Prodigy прогнозира енергия на свързване между TLR4 и MTBV8 от −8,6 kcal/mol. Резултатите по-горе показват, че MTBV8 има силен афинитет към TLR4, което му позволява да генерира стабилен имунен отговор.

3.8. Симулация на молекулярната динамика

Молекулярно-динамичната симулация беше използвана за анализиране на движението на атомите във ваксината [120]. Деформируемостта на основната верига разкрива степента, до която една молекула може да се деформира при всеки съставен остатък. Областите с висока деформация показват позицията на "пантата" на веригата (фиг. 7C), а експерименталният B фактор е получен от съответната PDB банка данни, докато изчислението е извършено чрез умножаване на NMA подвижността по 8pi^2 (фиг. 7D ). Собствената стойност, присвоена на всеки нормален режим, е мярка за коравина на движение, която е пряко свързана с енергията на деформация на цялата конструкция. Собствената стойност е право пропорционална на лекотата на деформация (фиг. 7E). Дисперсията на всеки нормален режим е обратно пропорционална на собствената стойност. Индивидуалните вариации са оцветени в кафяво, докато кумулативните вариации са оцветени в зелено) (фиг. 7F). В ковариационната матрица има свързване между двойки остатъци и се показват корелирани (червени), некорелирани (бели) и антикорелирани (сини) движения (фиг. 7G). Мрежата на еластичност представлява двойки атоми, свързани с пружини, и всяка точка представлява пружина между съответните двойки атоми. Цветът на точките показва тяхната твърдост; по-тъмните сиви точки илюстрират по-твърди пружини и обратно (фиг. 7H). Симулациите на молекулярната динамика, използващи iMODS сървъра, предполагат, че докинг комплексът между MTBV8 и TLR4 е стабилен.

3.9. In silico оптимизация и клониране на MTBV8

Синтезът на протеини е предпоставка за неговата дейност [121]. В съответствие с това, повишената транскрипционна и транслационна ефективност на ваксината е необходима за нейната свръхекспресия в клетки на E. coli чрез самовъзпроизвеждащ се плазмид pET28a( plus ) [103]. Неговата оптимизация беше постигната чрез индекса на адаптация на кодона (CAI) от 0,99 и съдържание на GC (54,81 процента) между 30 процента и 70 процента, които обикновено се считат за благоприятни за експресия на протеин в гостоприемника. ДНК фрагментът на mtbv8 може да бъде клониран в pET-28a(plus) вектор между NcoI и XhoI рестрикционните сайтове, използвайки SnapGene за генериране на pET-28a(plus)-mtbv8 рекомбинантен плазмид (допълнителна фигура .3).

4. Дискусия

4.1. Появата на многоепитопни ваксини срещу туберкулоза

Ваксинацията е най-надеждният начин за борба с туберкулозната инфекция. В продължение на много години учените са идентифицирали множество обещаващи кандидати за ваксина, които биха могли да заменят BCG, единствената одобрена ваксина срещу туберкулоза [8100,122–125]. Напоследък рекомбинантните противотуберкулозни ваксини получават все по-голямо внимание. Няколко рекомбинантни ваксини са показали ефикасност в предклинични и клинични изпитвания, включително ID93/GLA-SE, състояща се от четири кандидат ваксини Rv2608 (семейство PE/PPE), Rv1813 (експресирана при стрес/хипоксия), ESXV и ESXW, които са обещаващи в предклинично изпитване с мишки [122]. За клиничните изпитвания GamTBvac, получен чрез сливане на Ag85a и ESAT6-CFP10, беше успешен във фаза I изпитвания [125], докато M72, състоящ се от два кандидата [Mtb39A (PPE18) и Mtb32A], даде значителна ефективност във фаза II опити [123].

Успешните изпитания на тези рекомбинантни ваксини показват по-голямата ефикасност на базираните на епитоп ваксини, които просто включват имунологичните свойства на различни кандидат протеини в синтетичен протеин [124]. Трябва да се отбележи, че няколко ваксини за туберкулозна субединица са получени от голям брой кандидати за ваксини и те се очертават като потенциално привлекателни кандидати в проучвания върху животински модели [100]. Например, MP3RT, мултиепитопен пептиден кандидат за ваксина срещу туберкулоза, състоящ се от шест имуногенни HTL пептида, индуцира значително по-високи нива на IFN- и CD3 плюс IFN- плюс Т лимфоцити и по-ниски единици, образуващи колонии (CFU) в белия дроб и далака на хуманизирани мишки, отколкото мишки от див тип [8]. Занапред изследванията за по-голяма ефективност на тези ваксини доведоха до обогатяване на потенциални протеинови кандидати.

Освен това, протеини, секретирани от M. tuberculosis, също са взети предвид при проектирането на MTBV8 (Таблица 1), тъй като те са важни за патогенезата и вирулентността на туберкулозата [126]. В допълнение, някои секретирани протеини от външните слоеве на клетките на M. tuberculosis могат да служат като полезни антигени. Например, EsxA и EsxB са пречистени от капсулата на M. tuberculosis [127] и задържането на EsxA в капсулата е замесено в цитотоксичността [128]. В допълнение, EsxA е необходим за целостта на бактериалната клетъчна стена [129]. Като цяло, секретираните протеини имат достатъчно открити повърхности, така че да са мишени на имунните отговори на гостоприемника [130,131].

4.2. Потенциално стимулиране на вродената имунна система от MTBV8

Скринингът за епитоп в кандидат протеини включва активиране на вродената имунна система, последвано от разпознаване на антиген от лимфоцити, тъй като и двата фактора са необходими за последващото активиране на адаптивната имунна система [50]. За вродения отговор образуването на стабилен комплекс между MTBV8 (подпомогнат от TLR4 стимулатора HBHA като адювант) и TLR4 на DCs (фиг. 5F) е важно, тъй като TLR4 лигандите могат да активират DCs и активираните DCs могат на свой ред да активират наивни Т клетки, ефективно поляризират CD4 плюс и CD8 плюс Т клетки, за да секретират IFN- и индуцират медиирана от Т клетки цитотоксичност [106] и впоследствие увеличен набор от ефекторни клетки на паметта [119].

Този комплекс вероятно е допринесъл за увеличаването на популацията на клетките на паметта (y2) в В лимфоцитите (допълнителна фигура 1A) и Th лимфоцитите (допълнителна фигура 1C) в сравнение с клетките без памет. Имунната стимулация от MTBV8 е сравнима с тази, получена с други мултиепитопни ваксини срещу туберкулоза [33,37,39] и други заболявания [27,62,107,124,132]. Това намекна за последователността на механизма на мулти-епитопната ваксина.

4.3. Потенциално стимулиране на адаптивната имунна система от MTBV8

В и Т лимфоцитите са първичните ефекторни клетки, които координират адаптивните имунни отговори чрез хуморален или клетъчно-медииран имунитет чрез разпознаване на части от нахлуващи патогени, наричани антигени [50]. За да индуцираме хуморален адаптивен имунен отговор, ние включихме В-клетъчни епитопи с висок резултат (Таблица 2) за разпознаване и унищожаване от антитела, експресирани и секретирани от В-лимфоцити [50,133]. Стимулирането с ваксина на активни В лимфоцити (Фигура 5В), предимно IgM- и IgG1-секретиращи В клетки (Допълнителна Фигура 1А), може да доведе до прекомерна секреция на IgM и IgG1 (Фигура 5А).

Високата антигенност на ваксината (Фигура 4) може да има важни последици за повишаване на отговорите на антителата (Фигура 5А). Наистина, клетъчно-медиираните имунни отговори са силно зависими от способността на Т-клетките да разпознават антигени [134]. За да постигнем това, ние избрахме силни антигенни и силни МНС-свързващи CTL и HTL епитопи (Таблица 2), които подобриха стабилността на пептид: МНС комплекс (pMHC), който е ключовият фактор, контролиращ имуногенността на МНС пептида [135] и играе роля в праймирането на CD8 плюс и CD4 плюс Т клетки от DCs, което води до Т лимфоцитни отговори (Фиг. 5C, Допълнителна Фигура 1C) [136].

Включването на подходящи линкери и синтетични олигопептиди (PADRE и HEYGAEALERAG) и прецизното позициониране на всеки компонент може да улесни обработката и представянето на епитопа (фиг. 3). Поради вариацията на алелите сред хората, ние избрахме CTL епитопи въз основа на разпознаване на MHC-I алели на основните човешки раси Допълнителна таблица 1 (Таблица 2), и безразборни HTL епитопи бяха избрани след скрининг за IFN-индуциращи свойства и антигенност.

4.4. Перспективите за развитие на MTBV8

Този дизайн на ваксина in silico е подходящ индикатор във фазите на скрининг по отношение на синтеза и ефикасността на кандидат ваксините. За синтез нашите прогнози разкриха, че той може да бъде синтезиран в системата на E. coli, но други системи като клетки от насекоми и бозайници също могат да бъдат разгледани, ако системите, базирани на E. coli, представляват трудности. Мокрото лабораторно валидиране е следващият етап в потвърждаването на кандидатите за ваксина след in silico проучвания. Този метод всъщност е използван ефективно в някои кандидати за ваксина, които също са проектирани първо in silico и по-късно се оказват ефективни в експерименталната фаза [137].

5. Заключение

Ключова подкрепа на целта за устойчиво развитие на СЗО за пълно изкореняване на туберкулозата е достъпът до мощна ваксина за предотвратяване на инфекция с M. tuberculosis. Предишни проучвания показват, че химерните мулти-епитопни ваксини могат да използват имунните/антигенните свойства на определени протеини за повишаване на имунната ефикасност. В това проучване използвахме in silico подход за проектиране на химерна ваксина (MTBV8) чрез интегриране на 41 безразборни епитопа, получени от осем антигенни протеина, секретирани от M. tuberculosis H37Rv. Предвижда се, че MTBV8 е стабилен, разтворим, безопасен, силно антигенен и имуногенен.

Имуно-информационният анализ показа, че MTBV8 проявява добър афинитет към основния имуноклетъчен рецептор TLR4. Важно е, че ваксинационната стимулация на MTBV8 може значително да повиши нивата на В клетките, Т клетките и популациите на вродени имунни клетки и да стимулира производството на имуноглобулини (IgG1, IgM и др.), както и имунни фактори (IFN-, IL{{6). }} и т.н.). Взети заедно, многоепитопната ваксина MTBV8 е подходящ индикатор във фазата на проектиране на противотуберкулозни ваксини и може да се превърне в потенциален крайъгълен камък в реализацията на „Стратегията за край на туберкулозата“.

Декларация за авторски принос

Бинда Т. Андонгма: Концептуализация, методология, софтуер, писане – оригинална чернова. Yazheng Huang: Подреждане на данни, Софтуер. Фанг Чен: Софтуер, Визуализация. Qing Tang: Подреждане на данни, Официален анализ. Мин Янг: Софтуер, Визуализация. Shan-Ho Chou: Писане – преглед и редактиране. Xinfeng Li: Концептуализация, методология, софтуер, придобиване на финансиране. Jin He: Надзор, писане – преглед и редактиране, придобиване на финансиране.

Декларация за конкурентен интерес

Авторите декларират, че нямат известни конкурентни финансови интереси или лични взаимоотношения, които биха могли да повлияят на работата, докладвана в този документ.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от Националната природонаучна фондация на Китай (32200026, 31900057), отворените фондове на Държавната ключова лаборатория по селскостопанска микробиология (AMLKF202108) и Китайската постдокторска научна фондация (2019M662654).

Приложение A. Подкрепяща информация

Допълнителни данни, свързани с тази статия, могат да бъдат намерени в онлайн версията на doi:10.1016/j.csbj.2023.01.019.

Препратки

[1] Boineau R, Domanski M, Troutman C, Anderson J, Johnson G, Mcnulty SE, Clappchanning N, Davidson-ray LD, Fraulo ES, Fishbein DP, et al. Амиодарон или имплантируем кардиовертер-дефибрилатор за застойна сърдечна недостатъчност. New Engl J Med 2005; 352 (3): 225–37.

[2] Khoshnood S, Heidary M, Haeili M, Drancourt M, Darban-sarokhalil D, Nasiri MJ, Lohrasbi V. Нови кандидати за ваксина срещу Mycobacterium tuberculosis. Int J Biol Macromol 2018; 120 (Pt A): 180–8.

[3] Kyu HH, Maddison ER, Henry NJ, Ledesma JR, Wiens KE, Reiner R, et al. Глобално, регионално и национално бреме на туберкулозата, 1990-2016: резултати от проучване на глобалното бреме на болести, наранявания и рискови фактори от 2016 г. Lancet Infect Dis 2018; 18 (12): 1329–49.

[4] Световна здравна организация (2022 г.). Глобален доклад за туберкулозата. 〈https://www. СЗО. int/publications/i/item/9789240061729〉.

[5] Mirzayev F, Viney K, Linh NN, Gonzalez-Angulo L, Gegia M, Jaramillo E, Zignol M, Kasaeva T. Препоръки на Световната здравна организация относно лечението на резистентна към лекарства туберкулоза, актуализация от 2020 г. Eur Respir J 2021;57(6):2003300.

[6] Ahmad Khan F, Fox G, Menzies D. Устойчива на лекарства туберкулоза. Ню Йорк: Наръчник за антимикробна резистентност Springer; 2017. стр. 263–86.

[7] Mitchison D, Davies G. Химиотерапията на туберкулозата: минало, настояще и бъдеще. Int J Tube Lung Dis 2012;16(6):724–32.

[8] Gong W, Liang Y, Mi J, Jia Z, Xue Y, Wang J, Wang L, Zhou Y, Sun S, Wu X. Базирана на пептиди ваксина MP3RT индуцира защитен имунитет срещу инфекция с Mycobacterium tuberculosis в модел на хуманизирана мишка . Front Immunol 2021; 12: 1–19.

[9] Lange C, Aaby P, Behr MA, Donald PR, Kaufmann SHE, Netea MG, Mandalakas AM. 100 години Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin. Lancet Infect Dis 2022; 22 (1): e2–12.

[10] Glaziou P, Floyd K, Raviglione MC. Глобална епидемиология на туберкулозата. Semin Respir Crit Care Med 2018;39(3):271–85.

[11] Ernst JD. Механизми на избягване на имунитета на M. tuberculosis като предизвикателства пред дизайна на ваксина срещу туберкулоза. Клетъчен гостоприемник микроб 2018; 24 (1): 34–42.

[12] Li X, Chen F, Liu X, Xiao J, Andongma BT, Tang Q, Cao X, Chou SH, Galperin MY, He J. Clp протеаза и антисенс РНК съвместно регулират глобалния регулатор CarD, за да медиират микобактериалния отговор на гладуване. eLife 2022; 11:1–22.

[13] Liu CH, Liu H, Ge B. Вроден имунитет при туберкулоза: защита на гостоприемника срещу избягване на патогени. Cell Mol Immunol 2017; 14 (12): 963–75.

[14] Elvang T, Christensen JP, Billeskov R, Hoang TTKT, Holst P, Thomsen AR, Andersen P, Dietrich J. CD4 и CD8 Т клетъчни отговори на M. tuberculosis Ag85B-TB10.4, насърчавани от субединица с адювант, аденовектор или хетероложна първична усилваща ваксинация. PLoS ONE 2009;4(4):e5139.

[15] Rossjohn J, Gras S, Miles JJ, Turner SJ, Godfrey DI, McCluskey J. Т клетъчно антигенно рецепторно разпознаване на антиген-представящи молекули. Annu Rev Immunol 2015; 33: 169–200.

For more information:1950477648nn@gmail.com