Многопосочна активност на бакучиол срещу клетъчните механизми на стареенето на лицето – експериментални доказателства за холистичен подход към лечението, част 1

Резюме

Обективен: Стареенето на кожата е многофакторен процес, включващ образуването на реактивни кислородни видове, последващо възпаление с намалена жизнеспособност на епидермални и дермални клетки и произтичащо от това увреждане на извънклетъчния матрикс. Ефективните модалности на дермо-козметично лечение в идеалния случай трябва да се справят с тези отличителни белези в холистичен подход. Тук ние определихме съответния профил на активност на bakuchiol, получен от растения меротерпен, в набор от in vitro, ex vivo и in vivo проучвания и го сравнихме с ретинол, който понастоящем се счита за златен стандарт в локалната козметика против стареене.

Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Cistanche phenylethanoid гликозидите имат силна способност за изчистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да улавя свободните радикали DPPH и може да улавя реактивни кислородни видове, да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колагена и също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на аниона от свободните радикали на тимина.

Кликнете върху антиоксидант Cistanche Tubulosa

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Методи: Антиоксидативният капацитет и силата на бакухиол и ретинол бяха анализирани чрез измерване на редукцията на 2,2'-дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH) чрез неговото разпадане на абсорбция и резонансна спектроскопия с електронен спин, съответно. Ефекти върху простагландин Е2 (PGE2), инхибиторен фактор на миграцията на макрофагите (MIF), фибробластен растежен фактор 7 (FGF7), колаген тип I и VII (COL1A1, COL7A1), нива на фибронектин (FN), както и метаболизма на водоразтворим тетразолий 1 (WST-1) са определени в човешки дермални фибробласти. Епидермалната регенерация беше оценена с помощта на in vitro модел на зарастване на рани. Нивата на FN протеин се анализират ex vivo след третиране с формулировка, съдържаща бакухиол, ретинол или носител, като се използва течност от блистер за изсмукване. Подобряването на състоянието на кожата е определено in vivo в сравнително проучване на разделено лице след прилагане на бакучиол или носител.

Резултати: За разлика от ретинола, бакучиолът демонстрира висока антиоксидантна ефикасност. Нивата на PGE2 и MIF бяха значително намалени от бакучиол и ретинол. Бакучиолът, но не и ретинолът, повишава значително нивата на FGF7 протеин. Нивата на метаболизиране на WST-1 бяха значително увеличени от бакучиол и ретинол. Прилагането на бакучиол и ретинол доведе до значително повишаване на нивата на протеини COL1A1, COL7A1 и FN. Рани, допълнени с бакучиол, но не и с ретинол, показват значително увеличение на регенерацията на епидермиса. Клинично зоните, третирани с формулировка, съдържаща бакухиол, показват статистически значимо увеличение на стойностите на FN протеин след 4-седмично приложение в сравнение с нетретираните зони и зоните, третирани с носител.

Заключение: Тези данни предоставят доказателства за многопосочната ефикасност на бакучиол срещу клетъчните белези на стареенето на кожата. Неговият профил на активност споделя някои общи характеристики с ретинола, но демонстрира няколко досега неизвестни положителни ефекти в нашите проучвания, а именно стимулиране на критичния компонент на екстрацелуларния матрикс FN и ускорена епидермална регенерация и заздравяване на рани.

КЛЮЧОВИ ДУМИ

против стареене, бакучиол, обосновка на претенциите in vivo/ex vivo/in vitro, ретинол, физиология на кожата/структури

ВЪВЕДЕНИЕ

Състарената кожа се характеризира с бръчки, неравномерна пигментация, грапавост на кожата и отпуснатост. Тези клинични признаци са резултат от структурни и метаболитни промени, причинени от процеси на вътрешно и външно стареене. Вътрешното стареене се приписва на фактори, включително скъсяване на теломерите, хронично възпаление, единични мутации на митохондриална ДНК и свободни радикали [1]. Остарялата кожа допълнително включва намаляване на нейните антиоксидантни системи [2]. Също така, скоростта на клетъчна пролиферация намалява поради процеса на биологично стареене, водещ до загуба на структурата и функцията на кожата. Външното стареене се предизвиква предимно от ултравиолетово лъчение и влияние на околната среда. Тези обиди водят до увреждане на кожата, което засилва хронологичния спад и ускорява стареенето на кожата. Човешката кожа допълнително губи способността си да се справя с възпалителни състояния по време на стареенето, което води до хронично провъзпалително състояние.

Локалното приложение на ретиноиди като ретиноева киселина, ретинал или ретинол се счита за клиничен златен стандарт за ефективно лечение против стареене [3, 4]. Молекулярните механизми на ретиноидите са подробно описани [5–10]. Локалните ретиноиди ефективно намаляват видимите признаци на стареене като бръчки, отпуснатост или грапавост [4, 11] и намаляват депигментацията на фотоувредената кожа, включително ливедо ретикуларис и актинични лентигини [12]. Локалното лечение с ретиноиди обаче може да доведе до зависеща от концентрацията сухота и дразнене на кожата [13]. Тъй като прилагането на ретинол причинява незначителни нежелани реакции в сравнение с други ретиноиди като ретиноева киселина [6, 14], той е широко използвано активно вещество в козметичното лечение на стареенето на лицето.

За разлика от ретинола, който се прилага в продуктите за грижа за кожата от 1984 г. [15], бакучиол едва наскоро привлече вниманието като локално съединение против стареене. Бакучиолът е меротерпен (Фигура 1), който се извлича от семената на Psoralea corylifolia. Той се използва в традиционната индийска и китайска медицина от векове [16, 17] и се понася добре [18]. Предполага се, че бакучиолът проявява функции, подобни на ретинол, тъй като в модел на кожен заместител и двете вещества показват сходни модели на генна експресия in vitro [19] и подобрение на фотоувреждането на кожата in vivo [20]. Следователно той също така се нарича функционален ретиноиден аналог с растителен произход [21]. Допълнителни проучвания демонстрират антиоксидантни [19, 22–24], противовъзпалителни [19, 25–27], антибактериални [28], както и антипролиферативни и антитуморни ефекти [29, 30] на бакучиол.

За ефективно подобряване и забавяне на многофакторните процеси на стареене на кожата, различните клетъчни механизми трябва да бъдат разгледани чрез интегриран подход. Bakuchiol модулира едновременно различни цели, което го прави обещаващо съединение в това отношение. Тъй като оксидативният и възпалителният стрес са тясно свързани със стареенето на кожата, предотвратяването им от bakuchiol може да насърчи цялостното състояние на кожата. Качеството на настоящите научни доказателства обаче наскоро беше критично оценено [31]. В този контекст ние определихме (i) антиоксидантния и (ii) противовъзпалителния капацитет на бакухиол и ретинол и изследвахме способността им да подобряват клетъчния метаболизъм и синтеза на растежен фактор 7, обобщен като (iii) клетъчна активност. Допълнително анализирахме дали бакучиолът и ретинолът влияят върху експресията на определени (iv) ECM компоненти и подобряват (v) епидермалната регенерация и повторна епителизация. И накрая, беше проведено in vivo проучване, за да се провери клиничният капацитет против стареене на bakuchiol в човешката кожа.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Тестови материали

Bakuchiol е получен от Sytheon Ltd (Boonton, Ню Джърси, САЩ). Ретинолът е закупен от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). За експерименти с клетъчни култури и двете изпитвани вещества бяха прясно разредени в DMSO (Merck, Darmstadt, Германия). За изходните разтвори на DMSO, приложената концентрация на изпитваните вещества беше 1000-кратно над най-високата концентрация, приложена в клетъчна култура, давайки 0.1 процента DMSO в среда или буфер. Бяха извършени допълнителни разреждания, като се използва среда или буфер с 0.1 процента DMSO. Следователно, всички експерименти с клетъчни култури бяха проведени в присъствието на 0.1 процента DMSO. За in vivo проучванията ретинолът за локално приложение е формулиран в същия носител като бакучиол.

Ин витро изследвания

Определяне на антиоксидантния капацитет

Бакучиол, ретинол (и двата приложени при крайна концентрация от 100 μM) или високостандартен тролокс (Merck, крайна концентрация от 25 μM) бяха разредени в DMSO. Накратко, 30 μL от тези съединения (10-кратно по-висока концентрация от крайната концентрация за анализ) бяха добавени към 96-плака с плоско дъно на ямка. Впоследствие, 270 μL от 39 ug/mL DPPH (Merck, разреден в смес вода/етанол 1:1) бяха бързо добавени към всяка ямка, което доведе до крайна концентрация от 10 процента DMSO. Като контрола, DPPH разтворът се инкубира с DMSO без изпитвани вещества. Освен това, празните контроли бяха извършени чрез инкубиране на бакухиол или ретинол с вода/етанол (1:1) или само сместа вода/етанол (1:1), съдържаща 10 процента DMSO в отсъствието на DPPH. След 10, 30 и 60 минути, абсорбцията при 524 nm беше измерена с помощта на многомодов четец на микроплаки Spark (Tecan, Männedorf, Швейцария). Сигналите на празните контроли бяха извадени.

Определяне на антиоксидантната сила

HDF се посяват в {{0}}плаки с ямки с 150 000 клетки/ямка в 2 mL среда, съдържаща 10 процента телешки серум, и се инкубират за 24 часа. Впоследствие старата среда се изхвърля и клетките се третират със среда, съдържаща 2 процента телешки серум и бакухиол или ретинол в крайна концентрация от 10 μM. Контролните HDF бяха допълнени с 0,1 процента DMSO без бакухиол или ретинол. Празните контроли се извършват чрез инкубиране на среда без клетки. След 24 часа кондиционираната среда се прехвърля в центрофугиращи колони на Vivaspin протеинов концентратор (5000 MWCO; Sartorius, Гьотинген, Германия) и се концентрира приблизително 10-кратно. Обемите на всички средни супернатанти бяха изравнени чрез повторно добавяне на потока. Нивата на FGF7 протеин в концентрираната кондиционирана среда бяха анализирани с помощта на наличен в търговската мрежа комплект ELISA, следвайки инструкциите на производителя (Bio-Techne GmbH). Измерванията бяха извършени с помощта на многомодов четец на микроплаки Spark (Tecan). Сигналите, получени от празни контроли, се изваждат и нивата на FGF7 протеин се нормализират до общия брой клетки, който се определя с помощта на клетъчен брояч (Scepter, Merck).

Определяне на метаболизма на WST-1

HDF се посяват в {{0}}плаки с ямки с 3000 клетки/ямка в 100 μL среда, съдържаща 10 процента телешки серум, и се инкубират за 24 часа. Изчерпаната среда се изхвърля и клетките се третират със 100 μL среда, съдържаща ретинол или бакухиол в крайна концентрация съответно 1 μM или 10 μM. Контролните HDF бяха допълнени с 0,1 процента DMSO без бакухиол или ретинол. Като допълнителна контрола, клетките бяха третирани с 10 процента тритон-X (Merck). Празните контроли се извършват чрез инкубиране на среда без клетки. След 72 часа клетките се оцветяват с помощта на наличния в търговската мрежа реагент за клетъчна пролиферация WST-1 съгласно инструкциите на производителя (Merck). Абсорбцията беше измерена при 450 и 620 nm с помощта на Tecan infinity M200 четец за микроплаки (Tecan). Разликата в тези измервания беше използвана за анализ. Сигналите на празните контроли бяха извадени.

Определяне на нивата на протеин COL1A1 и COL7A1

HDF се посяват в {{0}}плаки с ямки с 10  000 клетки/ямка в 100 μL среда, съдържаща 10 процента телешки серум, и се инкубират за 24 часа. Бакучиол или ретинол се разреждат в 100 μL среда без телешки серум и се добавят към настоящата среда в крайна концентрация съответно 1 μM или 10 μM. Контролата беше допълнена със 100 μL среда без серум, което дава концентрация от 0,1 процента DMSO, съответстваща на лечението с ретинол и бакучиол. Като висок стандарт бяха приложени 10 ng/mL трансформиращ растежен фактор (TGF-) и 11 ug/mL натриев аскорбат (и двете Merck). Празните контроли се извършват чрез инкубиране на среда без клетки. След 4 часа нивата на протеин COL1A1 и COL7A1 на кондиционираната среда бяха анализирани с помощта на налични в търговската мрежа комплекти ELISA, следвайки инструкциите на производителя (Novus Biologicals, Littleton, Colorado, Съединени щати). Измерванията бяха извършени с помощта на многомодов четец на микроплаки Spark (Tecan). Сигналите на празните контроли бяха извадени. Нивата на протеини COL1A1 и COL7A1 бяха нормализирани до общото количество протеин на клетъчен лизат, което беше определено с помощта на наличен в търговската мрежа комплект за анализ на бицинхонинова киселина (Thermo Fisher Scientific) съгласно инструкциите на производителя. Предпоставка за използване на резултатите е положителната реакция на клетките към високия стандарт TGF- и натриев аскорбат.

За анализ на нивата на протеин COL7A1 след удължено време на инкубация, HDFs се посяват в 96-плаки с ямки с 3000 клетки/ямка в 100 μL среда, съдържаща 10 процента телешки серум. Всички лечения, контроли и анализи бяха извършени, както е описано по-горе, с изключение на това, че бакухиол и ретинол бяха използвани само в крайна концентрация от 10 μM. Клетките се събират, когато се достигне субфлуенция, по-специално след 72 или 96 часа.

Определяне на нивата на FN протеин

HDF се посяват в {{0}}плаки с ямки с 10 000 клетки/ямка в 100 μL среда, съдържаща 10 процента телешки серум, и се инкубират за 24 часа. Старата среда беше заменена със среда, съдържаща 2 процента телешки серум и бакухиол или ретинол в крайна концентрация от 10 μM. Контролата беше допълнена с 0,1 процента DMSO без бакухиол или ретинол. Празните контроли се извършват чрез инкубиране на среда без клетки. След 24 часа нивата на FN протеин в кондиционираната среда бяха анализирани с помощта на наличен в търговската мрежа комплект ELISA, следвайки инструкциите на производителя (R&D Systems, Минеаполис, Минесота, Съединени щати). Измерванията бяха извършени с помощта на многомодов четец на микроплаки Spark (Tecan). Сигналите на празните контроли бяха извадени. Нивата на FN протеин се нормализират до общото количество протеин на клетъчния лизат, което се определя, както е посочено по-горе.

Определяне на епидермална регенерация в in vitro модел на зарастване на рани

Експериментите бяха проведени, както е описано по-рано [34]. За лечение на модели за зарастване на рани, бакухиол или ретинол се разреждат в DPBS и се добавят в крайна концентрация от 100μM към областта на раната (5 μL на рана). Референтните рани бяха допълнени със същото количество DPBS, съдържащ 0,1 процента DMSO без бакучиол или ретинол. Допълнителни рани бяха оставени необработени като допълнителна контрола. Моделите за заздравяване на рани се инкубират в продължение на 43 часа при 95 процента влажност, 5 процента CO2 и 37 градуса. Впоследствие пробите се замразяват бързо в изопентан, предварително охладен с течен азот, и се съхраняват при -80 градуса. Повторната епителизация беше оценена в оцветени с хематоксилин и еозин криостатни срезове чрез измерване на дължината на регенерирания епидермис с помощта на микроскоп Leica DMLS (10 ×), Leica MC 170 HD CCD камера и софтуера Leica LAS V4.9 (Leica Microsystems, Вецлар, Германия). Количественото определяне беше извършено по заслепен начин.

In vivo проучвания I и II

И за двете проучвания in vivo препоръките на текущата версия на Декларацията от Хелзинки и насоките на Международната конференция за хармонизиране на добрата клинична практика бяха спазени като приложими за козметично проучване. Протоколът от изследване I беше одобрен от Независимия комитет по етика във Фрайбург (feki код 08/2610). И в двете проучвания всички доброволци са дали писмено информирано съгласие. Субектите имаха здрава кожа, принадлежаха към кожа тип I до III по Fitzpatrick и началото или смяната на хормоналното лекарство беше критерий за изключване.

По време на 10--дневен период на предварителна подготовка и през целия период на изследване, субектите трябваше да се въздържат от излагане на ултравиолетови лъчи в тестовите зони. Дейностите, стимулиращи изпотяването, бяха забранени 24 часа преди планираните оценки.

Изследовател демонстрира правилното прилагане на формулировки, използвайки количество, което съответства на обичайния режим на грижа за кожата на субектите.

Проучване I: Ex vivo определяне на нивата на FN протеин

От 52 жени, които са били включени в това контролирано от превозно средство проучване, 33 субекта са завършили проучването и данните от 31 субекта (30–64 години, средна възраст: 50,9 години) са включени в анализа на данните. Отпадане е настъпило поради пандемията от SARS-CoV-2 и лични причини (13 субекта), както и поради реакции на несъвместимост (пет субекта, причинени от лечение с ретинол). Медиираните от ретинол реакции на несъвместимост, както и проблеми с вземането на проби, причиниха различен брой изследвани субекти за всяко състояние (вижте резултатите за подробности).

Седем дни преди планираните оценки беше забранено използването на продукти за грижа за кожата, почистващи препарати и сапуни върху предмишниците. На първия ден от изследването бяха установени четири тестови зони върху вътрешната страна на предмишниците. Върху две тестови зони бяха приложени две формули verum, които съдържат съответно {{0}}.5 процента бакучиол или 0,15 процента ретинол. В становище, публикувано от Научния комитет по безопасност на потребителите през 2016 г., приложената концентрация на ретинол се счита за козметично лечение [35]. В другите две тестови зони е използвано съответното превозно средство или зоната е оставена необработена. Позиционирането на местата за лечение беше променено. След 4 седмици прилагане на тестови формули два пъти дневно, доброволците се върнаха в института за тестване. Във всяка тестова зона бяха генерирани три аспирационни блистера (7 mm в диаметър), както е описано по-горе [36, 37]. Накратко, изработени по поръчка вендузи с блистери бяха поставени върху тестовите зони и беше приложен вакуум от 550–850 mbar. След приблизително 90–150 минути, когато се образуват блистери при засмукване, вакуумът се освобождава и течността се аспирира от блистера с помощта на 24-игла за измерване. Течностите се замразяват незабавно при -80 градуса върху сух лед до анализа. Нивата на FN протеин се определят количествено в проби от флуидни блистери за изсмукване, като се използва наличен в търговската мрежа комплект ELISA (R&D Systems). Измерванията бяха извършени с помощта на многомодов четец на микроплаки Spark (Tecan). Нивата на FN бяха нормализирани до нивата на общия протеин в пробите от течност от смукателни мехури, които бяха определени, както е споменато по-горе.

Проучване II: In vivo определяне на подобрение на състоянието на кожата

Общо 43 жени доброволки бяха включени в това сравнително проучване с разделени лица, контролирано от превозно средство. Според медицински оценки субектите са показали смесен тип кожа (суха, нормална, мазна и комбинирана кожа). 34 субекта (39–66 години, средна възраст: 56,2 години) завършиха проучването и бяха включени в анализа. Отпадането е причинено от технически проблеми и несъответствие (осем субекта), както и реакции на несъвместимост (един субект, причинен от лечение с носител и бакучиол).

Две седмици преди началото на проучването и по време на целия период на проучването доброволците трябваше да се въздържат от използване на продукти за автобронзиране или интензивни козметични процедури за лице (напр. премахване на повърхностни слоеве на кожата). По време на 10--дневния период на предварителна подготовка и по време на проучването субектите бяха помолени да се въздържат от извършване на перманентен грим, процедури за мигли и вежди, маски за очи и лепенки. Три дни преди първата оценка субектите бяха помолени да се въздържат от използването на продукти за грижа за лицето. Вечерта преди планираното оценяване участниците трябваше да спрат прилагането на декоративна козметика.

През първите 7 дни от 10-дневната фаза на предварителна подготовка субектите получиха бурканче с крем, съдържащо крема за носител на изследването (без информация за съдържанието) и го нанасяха два пъти дневно върху цялото си лице. В началото доброволците извършиха самооценка. По-специално, те визуално оцениха цялостния вид на кожата на лицето си, като наблюдаваха нейната свежест и блясък, както и всички признаци на стареене на кожата. По този начин беше приложена визуална аналогова скала, варираща от 1 (много уморена, остаряла) до 10 (много свежа, без признаци на остаряла кожа). След това субектите получават две заслепени буркани с крем, съдържащи верум (носител, съдържащ 0,5 процента бакучиол) или съответно носител, без никаква спецификация на съдържанието. По време на периода на изследване от 12 седмици едната лицева страна се третира два пъти дневно с verum, докато другата лицева страна се третира два пъти дневно с носителя. Разпределението на третирането на тестовите места беше променено. След 12 седмици редовна употреба, доброволците отново извършиха самооценка, както беше споменато по-горе.

Статистически анализ

Статистическите анализи бяха извършени с помощта на Microsoft Excel за Office 365 (Microsoft Corporation, Редмънд, Вашингтон, Съединени щати), софтуерен пакет SAS за Windows V9.4 (SAS Institute GmbH, Хайделберг, Германия) и GraphPad Prism V8 (софтуер GraphPad, Сан Диего , Калифорния, САЩ).

Нормалното разпределение на данните беше оценено с помощта на тест на Shapiro-Wilk. Ако нормалното разпределение беше потвърдено, беше извършен анализ на дисперсията с повторна мярка (RM-ANOVA) с post hoc сравнение по двойки. Ако хипотезата за нормалност беше отхвърлена, Blom-трансформираните рангове на оригиналните данни бяха оценени с помощта на RM-ANOVA с post-hoc сравнение по двойки или оригиналните данни бяха оценени чрез използване на тест за ранг на знаци на Wilcoxon. Всички статистически тестове бяха двустранни при ниво на значимост алфа=0.05.

РЕЗУЛТАТИ

Ин витро изследвания

Определяне на антиоксидантните ефекти

За да анализираме (i) антиоксидантните ефекти на бакухиол и ретинол, ние проведохме два различни анализа, използвайки DPPH като детекторна молекула.

Антиоксидативен капацитет

Антиоксидативният капацитет се определя чрез измерване на редукцията на DPPH чрез неговото разпадане на абсорбцията. Високостандартният Trolox показа значително повишен антиоксидантен капацитет спрямо контролата (p=0.0000 за всички посочени времеви точки), потвърждавайки правилното измерване (Фигура 2а). Що се отнася до контролата, абсорбцията в проби, третирани с бакучиол, също беше значително намалена във всички изследвани времеви точки (10 минути: p=0.0003, 30 и 60 минути: p=0.0000 ), демонстриращи повишен антиоксидантен капацитет. Обратно, ретинолът не показва значителен антиоксидантен капацитет в сравнение с контролата.

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】