Многофакторното серопроилиране анализира приноса на вече съществуващи реакции на човешки коронавируси към имунитета срещу SARS-CoV-2 (част 2)

За да научите повече информация, моля свържете сеdavid.wan@wecistanche.com

Резолюция на времеви антитяло динамика от ABCORA сер-опроfiлинг.  кръст-секционенанализ на реактивност на антитела след SARS-CoV-2диагностика чрез RT-PCR (N = 369) ислед началото насимптоми (N = 333) подчертано на капацитет на ABCORA сер- опроfiлинг за дисекция на началото, пика и отслабването на SARS-CoV-2 антитяло отговори (Фиг. 5a, b, допълнителна фигура 11). При индивиди с a известен дата на fiпърво SARS-CoV-2 RT-PCR диагностика или поява на симптоми, ABCORA 2.3 откриваизд рано сероконверт-сион в 98 процента (48на 49) и100 процента (9на 9) на лица в рамките на7 дни след RT-PCR и съответно поява на симптомите. Освен това IgM и IgA реактивността, IgG отговорите бяха лесно откриваеми в ABCORA 2.0 след няколко дни на инфекция (ДопнтариФиг. 11a).

Надлъжна оценка на кохортана реконвалесцент пациенти нагореда се  11  месеца след заразяването (251 измервания на 120 пациенти)  подчертанонавремевидинамикана SARS-CoV-2 свързващи антитела. Изчислихме разпадането на of подвързване реактивност наемане на работа aстепенен закон смесен модел и идентифицира значим редуцдействие в RBD, S1, и N в всичко Иг подтипове (Фиг. 5b) спериоди на полуразпад вариращи от 67 да се 404 дни, с IgG N титри, намаляващи Най-бързият,влинияспредишен   доклади10.   Наполовина-живеенана неутраленiзация релевантни IgG отговори да се RBD и S1 са били 125 и съответно 404 дни. Интересно е, че кинетиката на неутрализиране антитела Направих не огледало на гниене ставки наблюдавани за свързване антитела. Неутрализиращата активност намалява презаll при a по-бавноскорост, с a половината-живот от 991 дни (фиг.5° С). Това отчасти се дължи на aсмесенреактивностмоделснякоилицапоказванеаннараства в неутрализиране дейност пост положителен ТОРС-CoV-2 RT- PCR5, докато неутрализиращата активност в други бързо се разпада (Допълнителен Фиг. 11в).

Ефекти на HCV имунитет На ТОРС-CoV-2 придобиване. Да се

дават възможност за изследване на взаимозависимостите между съществуващите преди товаng иммединство да се HCoV и ТОРС-CoV-2 инфекция, ние разширени наABCORA мънисто антиген масив да се включват S1 протеини на всичко четири циркулиращи  HCoV  (HCV-NL63,  HCV-229E, HCV-HKU1,HCV-OC43) (Suдопълнителен Фиг. 12a). Според да се неговотокапацитет да се монитор антитела да се five коронавируси, ние наречен анализът ABCORA 5.0 и обучени и валидиран то На на един и същкохорти като ABCORA 2.0 (Фиг. 1). За да позволи директно сравнение с ABCORA 2.0 инаизползване на моделите за прогнозиране на неутрализация, ниеизползвани на праг-/Базирани на SOC настройки за анализ на ABCORA 2.0 също за ABCORA 5.0. Въз основа На ABCORA 5.0 измервания на обучение кохорти I–III, ние измислен две случаен гора-базиран анализ модели. АНКОРА 5.4 включени единствено на 12 ТОРС-CoV-2 параметри и ABCORA 5.5 включваd вдопълнение на  S1  HCoV измервания добавяне общо до 24 параметъра. По аналогия сABCORA 2.3, учредяване на HCV реактивност в на моделбеше изгодно. АНКОРА 5.5 осигурява най-висока чувствителност испецfiград сред на анализ алгоритми сондирани ABCORA 5.0 (Допълнителен Фиг. 12b, допълнителна таблица 10).

Взаимозависимости междуантитяло  реактивност  да се  на  четири HCoV и SARS-CoV-2 огледален Какво ние преди това наблюдаваното

за HKU1 с a особено Високо корелация на IgM реактивност на

ТОРС-CoV-2 и HCoV в пред-пандемия индивиди, особено втезисскорошни  HCV  инфекция  (ДопълнителенФиг. 13). HCV инфекциите са чести, но подлежат на сезонностинаразпространение на индивидуален HCV инфекции луктира41,42. В редица с това, разпространението на отговорите на HCV, измерени от ABCORA 5.0 в местен кръв донори в януари 2019 (N = 285), Може  2019   (N=288) и януари 2020 г. (N=252) варирахазначително  (Фиг. 6). Да се активирайте a време-контролирани сравнение на HCV реактивност между ТОРС-CoV-2-заразен и здрави донори, ние екранизиран кръв донори от Може 2020  (N = 672), кога ТОРС-CoV-2 разпространение беше оценени под 2 процента в Цюрих, Швейцария43, от ABCORA 2.{{0}}/5.0 и изключи всички проби с ТОРС-CoV-2 реактивност. The остатъчен Може 2020кохорта (N=653)образувани a пандемия, здрави донор контрол група. интересно,Моделите на реактивност на HCV през 2019 г. и 2020 г. са разлеред по същество като оценени от един-начин ANOVA, с януари 2020 г. показвасравнително най-нисък и Може 2020 на най-високо IgA и IgGреактивност, който може посочвам a по късно начало на ан HCV епидемия през 2020 г. в сравнение с 2019 г. (t-тестове от май 2020 г. спрямо други групи sкак в Фиг. 6).

Най-интригуващото е, че съвпадащ във времето анализ comпарене Може2020 здрави донори с SARS-CoV-2-положителна проба от пациентиlиздвприл, Може, и юни 2020 (N = 65) разкри знациfiнаклонено нисъкHCV реактивност в ТОРС-CoV-2 положителен пациенти (Фиг. 7a). Това модел беше също очевидно кога ние разшири анализа, за да включи напъленкохортана ТОРС-CoV-2  измерени заразени лицас  ABCORA  5.0 (N=389, извадка от март 2020 г. дофевруари  2021,  Допълнителен  Фиг. 14). Като цяло тези резултати вdикатирани че пред-съществуващ имунна отговори да се HCoV може да се a известна степен на защита срещу SARS-CoV-2 инфекцияiНа.

Щракнете тук, за да научите повече за Cistanche

Фиг. 5 Мониторинг времеви еволюция на антитяло отговори. ан ABCORA 2.3 определение на серопозитивност в донори с положителен RT-PCR потвърдено ТОРС- CoV-2 инфекция и известна RT-PCR дата (N = 369). Серопозитивност рейтинготносно плазма вземане на проби време точкапостдиагностика е изобразен. Сив засенчена зона акценти на първи седем дни от положителен RT-PCR откриване. bСтепен закон модел, с време от RT-PCR като фиксирани ефект и индивидуален като случаен ефект, оценяване на гниене на активност на свързване на антитела въз основа на измервания с ABCORA 2.0 в 1–4 надлъжни времеви точки при 120 индивида, общо251 мяркаnts. Лилаво линии кореспондирам да се на на модела оценка илилаво засенчен области да се на95 процентаувереност интервали. Антитяло половината-живее (t1/2 в дни) от значително модели са изобразен. Значение беше оценени използвайки Сатъртуейт приближение за a две-едностранно t-тест На на наклон параметри. c Степен закон модел, с време от RT-PCR като фиксирани ефект и индивидуален като a случаен ефект, оценяване на гниене на неутрализиращ капацитет На 251измервания от 120 лица. само лица с NT50 > 100при техен първи измерване са били използвани да се оценка на половината-живот. The лилаво линия съответства да се на модел оценка и на лилаво засенчени ■ площ да се на95 процентаувереност интервали. Значение беше оценени използвайки Приближение на Сатъртуейт за a две-едностранно t-тест На на наклон параметри.

Фиг. 6 Сезонен и годишен flтрептене в HCV реактивност. Реактивност да се човек коронавируси (HCV-NL63, HCV-229E, HCV-HKU1, HCV-OC43)беше в сравнение от ABCORA 5.0. Реактивност в здрави кръв донори от 2019 и 2020 беше в сравнение. Пред-пандемия мостри включени: януари 2019 (N = 285), Може 2019 (N = 288), януари 2020 (N = 252). Мостри от Може 2020 (N = 672) са били събран по време на на пандемия в Швейцария. Само мостри без ТОРС-CoV-2 специфичен реактивност като дефинирани от ABCORA са били включени (N = 653). Звезди кореспондирам да се нива на значимост на две-едностранно t-тестове сравняване на посочено групи. Нива на значимост са поправено от на Бонферони метод за многократни тестване и посочено като следва:        *p< 0.05/36, **p < 0.01/36,="">p< 0.001/36.Boxplots представлявам на следното: Медиана с на средата линия, горен и нисък квартили с на кутия граници, 1.5x интерквартилен диапазони с на мустаци, и извънредни стойности с точки.

Ефекти на  HCV  имунитет в  ТОРС-CoV-2  инфекция.  Да се

проучваме допълнително взаимозависимостите с HCV имунитета, ние неxtразследван дали HCV отговори са свързани към еволюциятана ТОРС-CoV-2 антитела. Да се това накрая анализирахме антителаотговори в плазмата на 204 индивида, взети проби св 60 дни след SARS-CoV-2диагностика с помощта на линеен регресионен модел коригирани за възраст, пол и време след положителен RT-PCR и HCVреактивност. Да се разслоявам HCoV реактивност в Високо и ниско HCoV активност, Медианарегистрирайте MFI-ВРАГ са били деfiнед за всеки HCV иантитялоклас. LogMFI-FOE по-висок от съответниямедиана поне заt три HCoV (HKU1, OC43, NL63, или 229E) в конкретенc Иг клас са били класиран като имайки Високо HCV дейноств рамките на този клас. Първо, само реактивности между едни и същи антиbодиклас were проучени в на модел (i.e., HCV IgG Високо На ТОРС- CoV-2 IgG). Наблюдавахме изключениеllyсиленвзаимовръзки за IgA и IgM отговори към SARS-CoV-2, коетовсичкоса билизнациfiнаклоненопо-високвлицасВисоко HCVреактивност (Фиг. 7b). Това силно предполага, че съществуващ HCV имунитетът може да осигуриe ан предимство в монтаж ТОРС-CoV-2 отговори.Взаимозависимости между HCV IgG и SARS- CoV-2  специфични IgG се наблюдават само за отговора S2. Интересно е, че в подкрепа на това откритие, HCV S2 hелпер отговориса били наскоро намерени да се тласък ТОРС-CoV-2 имунитет, вконкретно S2 антитяло активност31. За да проучите дали SARS-CoV-2 IgG можеизграждане На скорошни HCV IgA и IgM отговори ние следващия сондиранидали HCV IgM и IgA са свързани с eleоценено ТОРС-CoV-2 спецfic  IgGнива.Докато не беше очевиден ефект за IgM, ние наблюдава знакifiнадвишение асоциация на Високо HCV IgA дейност Навсичкочетириизмерено  ТОРС-CoV-2  отговори  (Фиг.  7c,  d). Това силно предполагаческорошни  HCV  инфекция имаa бенеfiциал ефект върху нарастващия отговор на SARS-CoV-2 антителаses.

в на следващия анализ, ние сондирани ако пред-съществуващ HCV имунитетима ан въздействие върху тежестта на заболяването при COVID- 19. За тази цел ниесондирани HCoV имунитет в 80 хоспитализирани и нехоспитализиранилица заразен за по-малко от 30 дни (фиг.8а). Контролиране за възраст и пол установихме, че индивиди с здравgh пред-съществуващ HCV реактивността е значителнамравканисък  DDSда сеизискватхоспитализация  (логистикарегресия  ИЛИ = 0.16, 95 процента CI (0.04, 0.67), Фиг.8b, допълнителна фигура 15). Допълнителна стратегияifiкатион наpпациенти от дали те изисква се лечение при ан интензивно отделение показан a намалена вероятност, че пациентътц с Високо HCoV отговор изисквани ставки хоспитализация с интензивен грижа (редни регресияИЛИ {{0}}.36, 95 процента CI (0. 13, 0,96), Фиг.8b, ДопълнителенFig. 15). По този начин, лица с Високо HCoV нива имаше a 64 процента намалени коефициенти на необходимост от хоспитализация съгласно илидинален ранг регресионен анализ сравняване хоспитализиран в редовен отделения, в интензивно отделение, инехоспитализирайтеd лица   (Фиг.  8a,  b).   Колективно,  тези наблюденията силно предполагат кръстосано защитен ефектof HCVимунитет върху формирането на имунната защита срещу SARS-CoV-2.

Фиг. 7 Ефекти на пред-съществуващ HCV имунитет по време на ТОРС-CoV-2 придобиване. a време-съвпадение сравнение на ABCORA 5.0 реактивност за ТОРС-CoV-2и HCoV в здрави и ТОРС-CoV-2 заразен лица. Здрави донори са били взети проби в Може 2020 (N = 653; син). плазма от ТОРС-CoV-2     заразен индивидs беше събран между април–юни 2020 (N = 65; червен). Вижте Допълнителен Фиг. 14 заананализ на на пълен ТОРС-CoV-2 положителен кохорта(N = 389). Сив кутии посочвам стойности по-горе на индивидуален MFI-ВРАГ разрез-изкл за ТОРС-CoV-2 специфичен отговори за всеки антиген. Звезди кореспондирам до нива на значимост на две-едностранно t-тестове сравняване отрицателен срещу положителен пациенти. Нива на значимост са поправено от на Бонферони метод за множество тестване и посочено като следва: *p< 0.05/12, **p< 0.01/12, ***p< 0.001/12 (IgG HKU1: p = 0.66, IgG OC43: p = 0.45, IgG NL63: p=3.3 × 10−04, IgG 229E: p = 1.6 × 10−05, IgA HKU1: p=1.8 × 10−03, IgA OC43: p=1.3 × 10−05, IgA NL63: p=1.4 × 10−07, IgA 229E: p=3.0 × 10−05, IgM HKU1: p = 3.3 × 10−08, IgM OC43: p = 4.3 × 10−03, IgM NL63: p = 1.1 × 10−07, IgM 229E: p = 2.7 × 10−02). Boxplots представлявам на следното: Медиана с средата линия, горен и нисък квартили с на кутия граници, 1.5x интерквартилен диапазони с на мустаци, и извънредни стойности с точки. b Линеен регресия показване на модели на асоциация между ТОРС-CoV-2 и HCV сигнали в 204 ТОРС-CoV-2 положителен пациенти с известен дати на първо положителен RT-PCR откриване. Влияния в рамките на на един и същ антитяло клас са разследван. The модели са били коригирани На възраст (сплайн с 3 степени на свобода), пол, време оттогава положителен RT-PCR (сплайн с 3 степени на свобода), и ниво на HCoV реактивност. Мостри са проектирани да се пристанище Високо HCV реактивност ако те шоу ABCORA 5.0 HCVрегистрирайте MFI-ВРАГ стойности по-висок отколкото на съответстващ Медиана в при най-малко 3 HCoV измервания (HKU1, OC43, NL63, или 229E). Кривите съответстват да се на на модела оценка и засенчени области да се на95 процентаувереност интервали. p-стойности са били получено от бягане a две-едностранно Студент t-тест на параметър свързани с HCV реактивност в на линеен регресия. c Линеен регресия модел показване на асоциация между ТОРС-CoV-2 IgG и HCV IgA сигнали. Криви кореспондирам да се на на модела оценка и засенчени области да се на95 процентаувереност интервали. p-стойности са били получено от бягане две-едностранно Студент t-тест На на параметър свързани с HCV реактивност в на линеен регресия. d Линеен регресия модел показване на асоциациямежду SARS-CoV-2 IgG и HCV IgM сигнали. Кривите съответстват на оценката на модела, а защрихованите области на 95 процента доверителни интервали. p-стойностs бяха получено от бягане a две-едностранно Студент t-тест На на параметър свързани с HCV реактивност в на линеен регресия.

Обсъдетейон

Деfiниция на  ТОРС-CoV-2  имунитет след ваксинация иинфекцията е от непосредствено значение44–46. Дешифриране на антитялокорелирана ТОРС-CoV-2  защитаинаблюдение ваксина отзивчивостта предстоят предизвикателни задачи. Големината aи дълголетие на защитен антитяло отговори да се естествено инфекция и различно ваксини трябва да се бъда прегледан да се разбирампараметри че форма защитен отговори и ръководни решения относно реваксинацията при неотговорили и повторна имунизацияnулроман възникващи ТОРС-CoV-2 варианти47. По същия начин създаването означава да серологично разграничаване между de novo инфекция, reинфекция,и ваксина отговори, техен издръжливост и неуспехи ще оставаткрitical за клинични диагноза.

Тук ние демонстрирам на Високо полезност на мулти-параметър сер- oпрофилиране при справяне с ключови проблеми в defining  ТОРС-CoV-2 имунитет.  Едновременнооткриванена отговори на антитела към a диапазонна ТОРС-CoV-2  антигенииразлично  Игкласовес ABCORA  seroprofiлингпредостави цялостна картина на SARS-CoV-2 серологичен статус при едно изследване, което окn да бъдат полезни за клинична диагностика за определяне на наличиетоoе реинфекция,  деfiнеповторно заразяване,  иотговарямда севаксинация. Изчислителенмоделиранесъщопозволенпредсказване плазмен неу-реализация капацитет от ABCORA резултати, позволяващ aизчерпателен Оценяване на ТОРС-CoV-2 антитяло динамика и техния взаимодействие сHCV отговори. Ние изучавани две ABCORA анализверсии thпри и двете измерено HCV реактивност наред на  12 ТОРС-CoV-2 параметри.ANCORA 2 включва S1 антигена наHKU1. АНКОРА 5 включени S1 на всичко четири циркулиращи HCV.По-специално, изчислителен модели че включени на HCVизмервания позволен a по-висок прецизност в определящ ТОРС-CoV- 2 серопозитивност, високаосветление взаимовръзки между HCoVи ТОРС-CoV-2 отговори, които трябва да бъдат разрешени.

Записване реактивност срещу всичко четири HCoV в ТОРС-CoV-2неинфектиран изаразенлицаниенаблюдаванотоинтригуващасоциации. UзаразенлицаПоказвапо-висок  HCVреактивност в сравнение със заразени индивиди, което предполагаaпринос на HCV имунитет да се рано защита срещу ТОРС-CoV- 2. HCV имунитетът може също да има положителен ефект върху SARS-CoV-2инфекция. в споразумение с друго доклади, ние отбеляза aкръстосано хранене на ТОРС-CoV-2 и HCV отговори при SARS-CoV-2 инфекция31,48 с лица с Високо HCV реактивност разв-работа по-висок ТОРС-CoV-2 антитяло нива. Повечето по-специално, съществуващи преди това HCV имунитет имаше ан въздействие На заболяване тежест в нашата кохорта. ТОРС-CoV-2 заразен лица с ниско HCV реактивност имаше a по-висок вероятност на изискващи хоспитализация.

Докатонашиятпроучванеединствено измерени отговори на антитела, aпотенциалзащитенефектна HCoVимунитет срещу SARS-CoV-2 придобиване Трябва не бъда гледаникатоограничен да се активност на антитяло. Антитела и клетъчният имунитет могат да бъдат от значениеи активен в концерт31,49–51. Алтернативно, отговор на антителаsесmeasured в на настояще проучване може единствено документ скорошни HCV инфекцияn и доставям a сурогат измерване на друго защитенHCV отговори. The връзка между по-висок HCV  и ТОРС-CoV-2 реактивност при заразени индивиди е особено интригуващо. Най-силният ефекти са били видяно за IgM и IgA HCoV отговори, суgжестикулиране че скорошни HCV имунитет осигурява ан рано тласък да се Разработване на антитела срещу SARS-CoV-2вх.  Далитоваев следствиеда се кръстосано реактивни В-клетъчни отговори, върху коитона  ТОРС-CoV-2имунитет изгражда На и съзрява или дали кръст-реактивен T помощникдейностииграядоминираща роля, както се предполага31  ще бъде важно да се разрешавам в напред-идва проучвания. The точна роля и тиминg на HCoVотговоривлияещи  ТОРС-CoV-2  антитялоотговори също остават да се бъда деfiнед. Рано ниско-афfiност HCoV отговори може имат a положителен въздействие На на развитие на ТОРС-CoV-2 имунитет чрез формиране на имунна памет, върху която да се изграждане, като има предвид, че amplifiкатион на не-защитенкръстосано реактивенHCV антитела Според да се на антигенен грях принцип може имат негативни ефекти30.

Макар чеасоциацияпроучвания като нашето формално не могат деfiне причинно-следствена връзка, на последици на нашият констатациите са очевидни: Предиимунитет да се HCV може защитавам да се някои степен срещу ТОРС-CoV-2 придобиване, иможе предоставят a тласък да се на развитие на ТОРС-CoV-2 спецfic имунитет и с това нисък на риск затежкахоспитализация.  A  скромензащитен ефект на HCoVимунитет би се бъда a правдоподобен обяснение за на Високопропорцияна asympтоматичен и лек ТОРС-CoV-2 инфекции52,53. Дори Повече ▼ интригуващи са бъдещите перспективи. Както другите, така и ниеимат показано, ТОРС-CoV-2 и HCV имунитет да се инфекция сачесто не дълго-траен (Фиг. 5, Допълнителен Фиг. 11)5,54, ограничениече  ТОРС-CoV-2  ваксининадеждада сепреодолявам. Трябва ТОРС-CoV-2  отговоривзавойпредоставятстепен на защита срещу HCV инфекция, широк защита срещу коронавируси може да е в rвсеки.

Фиг. 8 Въздействие на HCoV имунитет На COVID-19 тежест. a Асоциация на хоспитализация състояние (не хоспитализиран (N = 16); хоспитализиран не в интензивно отделение(N = 42); хоспитализиран в интензивно отделение (N = 22)) и Високо или ниско IgG HCoV реактивност. Правоъгълник размери кореспондирам да се на пропорция на включени пациенти. b Влияние на HCoV реактивност (ниско/Високо) На на хоспитализация състояние в a подмножество на N = 80 пациенти, като оценени с коефициенти съотношения, в ан редни регресия (с нива = не хоспитализиран (N = 16); хоспитализиран не в интензивно отделение (N = 42); хоспитализиран в интензивно отделение (N = 22)) и a логистика регресия (справка = не хоспитализиран(N = 16); срещу всичко хоспитализиран (N = 64)). Данни е представени като параметър оценка и неговото95 процентаувереност интервал. Ниво на значимост на параметърът е получено с a две-едностранно t-тест (p-стойност е Показва ако <>в противен случай посочено като n.s.).

азметоди

Човек екземпляр. Серум и плазмените проби са събрани преди и след поникването на

SARS-CoV-2 вШвейцария (пред ислед февруари 2020, съответно) са биливключени. Не търпелив записване беше проведено за на настояще проучване. всичкоексперименти включващ мостри от човек донори са били проведено с одобрението на отговоритеспособен местен етика комитет (Кантонале Етична комисия) Цюрих,

Швейцария (BASEC бр 2020-01327, 2020-00363; 2021-00437; 2020-00787), от на провизии на на Декларация на Хелзинки и на Добър клиничен Практикувайте насоки на Международната конференция по хармонизация. Мостри са били получено от следните източници: (i) кръводаряване от Цюрихсервизес (ЖБДС): Анонимизиран здрави възрастен плазма от пред-пандемия времеточки (януари 2019, Може 2019,и януари 2020 г.) и от първата вълна на пандемия в Цюрих, Швейцария (Може 2020) са били предоставени от на ЖБДС вътрешни хранилище на серум и противвх за това проучване беше се отказа от на етика комитет(BASEC 2021-00437). (ii) Анонимизиран остатъци от рутинна диагностика при на институт на медицински Вирусология, университет на Цюрих, на Университетски деца Болница Цюрих, и на Кантонален Болница Винтертур (BASEC бр2020-01327, 2021-00437). Беше получено писмено информирано съгласие от всички участницичиято проба was взета по време на на пандемия при на университет БолницаЦюрих (BASEC 2020-01327). За пандемични проби от други болници анd предпандемия мостри съгласие беше се отказа от на етика комитет. (iii) Здравеопазванеработници с RT-PCR потвърдена инфекция със SARS-CoV-2йон участващи в a проучване при университет Болница Цюрих (BASEC 2020-00363). Написано информиран съгласие беше получено от всичко участници. (iv) Мъжки плазма донори участващи в ТОРС-CoV-2 плазма терапия проучване проведено в Университетската болница в Цюрих(CPT-ЖП, Swissmedic 2020TpP1004; ОСНОВЕН 2020-00787). Писмено информиране получено съгласие за изследване от всички участници. Tтой отчитане на всичко човек и патиеnt данниспазва снаСТРОБ изявление. Пред-пандемия (ТОРС- CoV-2 отрицателенve, N = 825) и конfirmed ТОРС-CoV-2 положителен мостри (N = 389)са били разделени в обучение и валидиране кохорти (Допълнителен Таблица 3).          Налични демографски данни daта На пол, възраст, време от положителен RT-PCR иsсимптом начало, и хоспитализация състояние са докладвани в Допълнителен Таблица 11.The ТОРС-CoV-2 обучение кохорта (N = 175) включва плазма, събрана по време наинфекция (N=114) и възстановяване (N=61). На dонор само един вземане на проби времебеше включена точка, дължнадлъжно мостри на донори включени в на обучение кохорта бяха не включени в на валидиране кохорта за установяване на независимост, когатооценяване на чувствителност и спецификата на различните диагностични методи. The   SARS-CoV-2 валидиране кохорта (N = 214), съставен плазма събран по време на инфекция (N = 90, една времева точка за вземане на проби на донор) и възстановяване

(N = 124, 79 реконвалесцентни пациенти с 1–4 надлъжни проби). Многократно времеточки на реконвалесцент пациенти са били включени в на набор от валидиращи данни за улавяне a широк спектър от wанинг антитяло титри. Напречно сечение анализ беше въз основа Намостри с известен време от положителен RT-PCR (N = 369) или известен време тъй като симптом начало (N = 333), и двете включително наблюденията на надлъжния анализ.И двете, времето от положителния RT-PCR и времетоот начало беше известен за330 проби, със средно време от три daгс между симптом начало и RT-PCR(1ул–3rdквартил: 1–7 дни). Базиран е лонгитюден анализ на реактивността на антитялото на 251 наблюдения от 120 оздравяванияцента пациенти с известен време от положителен RT-PCR и времето от появата на симптомите. Неутрализиране was измерено На 467 SARS-CoV-2 RT-PCRположителен мостри (N = 369 с известен време от положителен RT-PCR, N = 333 с известен време от симптом начало).

Допълнително оценихме кръстосаната реактивност ABCORA 2.0 и 5.0 в лявоt-над плазмаот рутинна диагностика в предпандемична контролна група with документиран, скорошен HCV инфекция (обучение II, N = 75; OC43 (N = 27), HKU1 (N = 17), NL63      (N = 22), 229E (N = 9)). Циркулиращ HCV е обикновено само екранизиран за вхоспитализирани, тежки респираторни инфекции и имунен компромет лицакоито рутинно се подлагат на братреклама скрининг за дихателна инфекции. Следователно, в този пациент група, и двете намалена антитяло реактивност в следствие да се имунна компрометиране илиповишен HCV антибоди реактивност в следствие да се скорошни или повтарящи се HCV инфекция можевъзникне. Тъй като тази група е диагностстично релевантни ние разглеждан то разумен да се включете това кохорта като обучение II данни комплект да се проверявам ако кръст-реактивност с ТОРС-CoV-2 вABCORA възниква в тази настройка. Данните от обучение II не бяха включени в прага деfiниция да се не над-представлявам лица с тежко заболяване. Този HCV-инфектирангрупа Показва като цяло нисък реактивност с ТОРС-CoV-2 отколкото плазма отздрави възрастни но важното показан не индикация на кръстосана реактивност (фиг.1a, b). Пандемичен образецлес от анонимен кръв донори с неизвестен ТОРС-CoV-2състояние събран в Може 2020 (N = 672) са били не включени в обучение и валидиране кохорти.

Реактиви и клетъчни линии. Му-тостарял ТОРС-CoV-2-получени антигени (рецептор

свързващ домейн (RBD), субединица S1 (S1), субединица S2 (S2), nuclеокапсид протеин (N)) и S1 от tтой четири циркулиращи HCoV (HKU1, OC43, NL63, 229E) са били закупени от Sino Biological Europe GmbH, Ешборн, Германия (ДопълнителенТаблица 12). Източници, специфики и концентрация на антитела за откриване и контрол и серуми, използвани за тестове ABCORA и неутрализацияц са изброени в Допълнителна таблица 13. 293-Т клетки са получени от Американската колекция от типови култури(ATCC CRL- 11268)55. HT1080/ACE2кл. 14 клетки33 са били любезно предоставена от П.Биениаш, Рокфелер университет, Ню Йорк. И двете клетка линии са били културен в DMEMcontainiнг10 процентаFCS.

Дизайн на мултиплекс мънисто анализ ABCORA 2.0. Ние установени две мънисто-въз основамултиплексиран SARS-CoV-2 имунологични анализи (ABCORA 2.0 и ABCORA 5.0) чевключва редица SARS-CoV-2 и HCoV антигени (китайско Биологичен ЕвропаGmbH, Ешборн, Германия, Допълнителна таблица 12). Четири антигена на SARS-CoV-2ns- RBD, S1, S2, и N - са били включени в и двете ABCORA 2.0 и ABCORA 5.0.АНКОРА 2.0 включени в допълнение S1 на HCV-HKU1, иABCORA 5.0 включени S1на всичко циркулиращи HCoV (HCV-NL63, HCV-229E, HCV-HKU1, HCV-OC43). в кратко, индивидуален MagPlex мъниста (Luminex корпорация, Остин, TX)    с уникаленue флуоресцентни мънисто региони са били избрани за всеки антиген, мъниста са билисвързани и смеси от антиген-свързани перлиsса билиинкубирани с търпелив плазма в a 96-добре плоча комплект-нагоре. TheМедиана Флуоресцентни Интензивност (MFI) на свързана с топчета плазмаантибодии беше измерено използвайки a FlexMap 3D читател (Luminex корпорация,Остин, TX). Ние проектирани на анализ да се пълноfill на следното критерии: (i) Високо скорост-cifiград, чувствителност, и възпроизводимост, (ii) гъвкав мултиплекс дизайн че позволява директно допълнение и/или промяна на антигени; (iii) широк динамичен диапазон;  (iv) по желание количествоfiкатион на антитяло отговори; (v) по желание записване наантитялоотговори на HCoVs и (vi) употреба при рутине диагностика и изследвания.

Избрахме стеричен ориентация улавяне чрез анти-Неговата антитела да се осигурете a хомогенен антигенен дисплей. Следователно карбоксилираният MagPlex мъниста (Luminex

корпорация, Остин, TX) са били съчетано с анти-Неговата антитяло (китайско Биологичен

Европа GmbH, Ешборн,Германия, допълнителна таблица 13) и след това съчетано с His-маркиранантигени използвайки био-Плекс Амин съединител (био-Рад ЛабораторииAG, Cressier, Швейцария) според iинструкции и катоописано56.

Титруването на серума/плазмата като цяло се счита за най-точния методtegy да серетринавечерието количествен информация На антитяло реактивност. въпреки това, в диагностичен използванетестове в идеалния случай Трябва доставям (полу)-количествен информация от a единичен серумразреждане да се разрешително достатъчна производителност. Окончателните условия на анализа обхващат a 2-log MFI обхват във всички изследвани комбинации антиген-Ig (допълнителна фигура 1).Ратифициране на валидност на използвайки a единичен плазма разреждане, ние конfirmed че плазмаот ТОРС-CoV-2 положителен пациенти и пред-пандемия ТОРС-CoV-2отрицателенплазмените проби показват оптимална доза-отговор извивки над a широк плазма разрежданедиапазон (Допълнителен Фиг. 1f). важно, a 1/100 разреждане на плазма беше в всичкослучаи близо до максималния сигнал, подчертавайки, че нарастващата плазмаконцентрацията няма да увеличи интензитета на сигнала, а по-скоро ще спреер намаляващисиустни в следствие да се прозон ефекти (Допълнителен Фиг. 1f).

Максимална анти-Неговата антитяло Зареждане беше постигнати при 5 µg антитяло пер милионамъниста (Допвлизане Фиг. 1c) и използвани като a стандартен съединител състояние. в на fiналпротокол,пет милиона свързани с анти-His антитяло магнитни зърна бяха инкубирани с Неговата-маркирани антигени разреден в PBS при концентрация от 320 nM.Белязани с фикоеритрин (PE) вторични антитела, специфични за IgG, IgA, или IgM са билиизползвани като детекторни антитела (допълнителноТаблица 13). качество контрол на наантиген loдобавяне беше изпълнени от инкубиране на мъниста с моноклоналниантитела, насочени към съответния CoV-dполучени антиген като подробно вДопълнителна таблица 12. Анализът е извършен с остроумиеh на FlexMap 3D читател(Luminex Corporation, Остин, TX) с на придобиване на при най-малко 50 мъниста перобласт на мънистата. Резултати аповторно записано като MFI пер мънисто регион.

Бяха въведени няколко контролни меркиalled да се констатираммежду-и интра-анализпроизводителност. За да се установи нисък анализ наанализ променливост, голям партиди назареден с индивидуален антиген beads са били подготвени и замразени в аликвоти до използвани при-20 степенC да се заобикаляненагниене на на антиген-съчетано мъниста (допълнителна фигура 1). Индивидуални свързани перли се смесват в деня на теста до yiелд на изисква се антигенкоктейл от мъниста. Коктейлите съдържаха 60 мъниста pер мънисто регион пер µl. в допълнение да сеSARS-CoV-2 и HCV сферичните региони, всеки коктейл включва празенy област на мънистата (не антиген съчетано) да се контрол за неспецифиченfic подвързване. качество контрол и валидиране процедури за на FlexMap 3D инструмент са били Свършен На всеки ден отексперимент съглпоръчване да сенапроизводител's инструкции. The променливост на на анализбеше анализирани като следва56: плазма мостри от 20 RT-PCR конfirmed SARS-CoV- 2 заразени пациенти бяха събрани и тествани over a диапазон на седем разреждания в 31  различни tитрации изпълнени На 10 различно дни (Допълнителен Фиг. 2). Презвсичко антигени и Иг класове, сигнали са били запазени над на тест месечен цикъл на 25дни пост съединител за мъниста. Коефициенти на вариация (CV) на свързващия сигнал през tитрацииот 12 антиген-Ig клас комбинации доказано ниско (диапазон: 0.010–0. 128, Медиана  0.059, Допълнителна фигура 3c, d, Допълнителни таблици 1, 2). Същият ден и ден за денпроменливост pблуждаех ниско и сравними (Допълнителен Фиг. 3e, f). По-долу a 1/ 100 плазма концентрация, CV увеличена подчертано (Допълнителен Фиг. 3d),         определяйки 1/100 като най-високата концентрацияНа (най-нисък плазма разреждане) да се бъда тестван в на анализ. По този начин плазменото разреждане 1/100 се определя като основноразреждане за скрининг плазма в ABCORA 2.0 кога a качествен (т.е. наличие или отсъствие на SARS-CoV- 2специфични антитела) или полуколичествено (т.е. интензитет на MFI сигнала) отчитане еrокомплектован.

Всички измервания на ABCORA бяха деразкъсан от единичен измервания освен акозаяви друго. За измерване на SARS-CoV-2 специфичниc антитела в търпелив плазма,топлинно инактивиран плазма (1 h при56 градусаC) беше разреден 1/100 в PBS-BSA1 процентосвен акоиначе казано. 50 µl разреденизд плазма са били инкубирани с 50 µl на на ABCORAантиген мънисто коктейл за 30 минути при стая температура в 96-добре чинии, измити три пъти с PBS-BSA 1 процент и се инкубират в отделни реакции wiфикоеритрин (PE)-етикетирани детектор антитела за IgG, IgA или IgM при a fiкрайна концентрация на 1/500 в PBS-BSA 1 процент. Това разреждане преди това беше дефинирано оттитруване на детекторните антитела, за да се получат оптимални MFI сигнали. След 45мминути наинкубиране при стайна температура, перлите се промиват три пъти с PBS-BSA1 проценти анализирани в 96-добре чинии на четеца FlexMap 3D (Luminex Corporation, Остин, TX). A минимум на 50 мънисто чете пер антиген беше придобити.

За контрол за истински кръстосано реактивни антителагодини, всеки плазма проба бешеоценено с beads без антиген (празна мънисто контрол) в комбинация койтовсеки детектор aантитяло. За анализ, суров MFI стойности са били трансформиран да се MFI-ВРАГ да се правилно за заден план подвързване.Ние установихме средна празна топка MFI-FOE за IgG, IgA и IgM на здрави донори преди пандемия (N=1016) и set средното MFI-ВРАГплюс4x стандартно отклонение като праг за контрола на празните перли.в абсолютен нива, тези прагове възлиза на да се MFI-FOE 41,58 (IgG), 55,91 (IgA), и 269.47 (IgM).Mизмервания за който на празна мънисто контрол записано стойности above това праг са били разглеждан невалиден и повтаря се.

Всяка плака с 96-ямки за анализ на Luminex беше настроена да контав на един и същ комплект наконтрол мостри, именно 7 сериен 4-гънка разреждания на SARS-CoV-2 положителна контроладонор басейн (N = 20 донори, стартиране разреждане 1/100, Допълнителен Фиг. 1f) и предварително-пандемия здрави донор басейн (разреждане 1/100, N =20 дарители, ДопФиг. 1f). Тези положителни и отрицателни контроли позволяват да се контролира изпълнението на анализаnceпрез независими измервания и в допълнение позволяватретроспекциястандартизация срещу външен контрол, ако е необходимоded.

Определение на ТОРС-CoV-2 серопозитивност в ABCORA 2.0 и ABCORA 5.0. Да серазграничим SARS-CoV-2-специфични от кръстосано реактивни антитела, ние дefiнед MFI- Прагове на FOE за всеки от 12-те антигена на SARS-CoV-2 и комбинация от клас Igs въз основа на плазмени антитела reдейност в обучение кохорти (Допълнителен Маси 3 и 4). Те включват здрави донори преди пандемията pлазма (обучение I, N = 573),донори с скорошни HCV инфекция (обучение II, N = 75; OC43 (N = 27), HKU1 (N = 17), NL63 (N = 22), 229E (N=9)) и донори с потвърдена SARS-CoV-2 инфекция (обучение III, N = 175). Прагове са били комплект да се минимизиранефалшиви положителни резултатидокато осигуряване чувствителност за ТОРС-CoV-2откриване на антитела и за достигане наобща специфика по-гореe99 процентаи включени нива за граница-линия реактивност за IgGRBD,IgG S1, и IgG N да се позволява също скромен антитяло реактивност да се тези антигени to бъда прегледан. MFI-ВРАГ чете на индивидуален мостри са били трансформиран встойности на превишаване на сигнала (SOC) (MFI-FOE/праг). SOC vалуи са използвани зазадниципея положителен реактивност за всеки индивидуален антиген-антитяло клас комбинация, с SOC > 1 означава положителна реактивност, а SOC < 1 означава отрицателна реактивност.Кога настройка индивидуален прагове, то трябва да бъда разглеждан че за всеки на на 12 сондирани дейности могат да възникнат кръстосани реакции. С 12 индивидуални SOC параметъра записан, общ specifiград ще намаляване ако всякакви положителен SOC независимо суфfices да се скорост a проба като цяло като ТОРС-CoV-2 антитяло положителен. Да се давам пример:Ако приемем независими отговори, дори високата 99 процента специфичност за всеки антиген ще добави to обща ниска 88 процента специфичност в целия анализ. По този начин изискваме for ТОРС-CoV-2 положителен обаждане в ABCORA 2.0 a минимум на две спецfiградове да се достигнатдейност по-горенапраг. Комбинираните стойности на SOC, използвани за определяне на общата стойностсеростатус на дадена проба са подробно описани в допълнителна таблица 5. За IgG RBD, S1, и N,за които също регистрирахме гранична SOC активност, допуснахме aкомбинация от 1 антиген реактивност SOC > 1, втората реактивност SOC > граница. The fiнал праг и положителен повикване критерии позволен за диференциация на частично (рано сероконверсия с само IgM и IgA отговори) да се пълен сер-          преобразуване (вкллудинг IgG отговори) (Допълнителен Таблица 5). в допълнение, критериите обозначават проби със слаба реактивност и/или неопределена реактивност(Допълнителна таблица 5).

За да се улесни сравнението междуeen ABCORA 2.0 и ABCORA 5.0 на един и същпраг граничните стойности са използвани за ABCORA 5.0. Избрахме да не създаваме конкретна границапрагове за реактивност на HCV антитела като an точен деfiниция на a отрицателенреакцията е сложна поради широко разпространената експозиция на HCoVs и consiнеприятенкръстосана реакция на антителативност между тях. HCV отговори са били въпреки това включени в статистикатакал анализи като MFI-ВРАГ стойности.

Определение на ТОРС-CoV-2 серопозитивност използвайки логистика регресия класификация.

Classifiкатион на серопозитивни срещу серонегативна мостри в ABCORA 2. 1 беше реализиранизползвайкилогистика регресия. The идентичен обучение и валидиране данни използвани за на заведение на ABCORA 2.0 са били използвани. Като на ABCORA 2.0 свързващи реактивности бяха силно корелирани, ние включихме следните променливи в модела (допълнителни Фиг. 6a): на означава стойност на всички IgG MFI-FOE отговори (RBD, S1, S2, N), на означава стойност на IgA MFI-FOE отговорите срещу RBD, S1 и S2 и средната стойност стойност на IgM MFI FOE отговорите срещу RBD, S1 и S2. IgA и IgM отговорs до N бяха изключени, тъй като не бяха групирани с другите отговори на същия Ig клас (Допълнителен Фиг. 6а). Логистичната регресия беше използвана за оценка и прогнозиране вероятността за дадена извадкаe да се бъда положителен (p) като описано в уравнение (1).

алметра  0, G, A, и  M са били оценени На на обучение набор от данни. A проба след това се определя като положителен, ако прогнозираната му вероятност да бъде положителен е по-високаa праг c/. Този праг е дефиниран, за да се получи специфичност от поне 0.99 и максимална чувствителност на набора от данни за обучение (по същия начин to c за на случаен гора). врезюме, в ABCORA 2. 1, всяка нова проба се определя като серопозитивна, ако нейната вероятност на серопозитивност, както е оценено чрез логистичната регресия, е над c/. Анализираме ниеre изпълнява се във версия Rn 3.6.3. Определение на ТОРС-CoV-2 серопозитивност използвайки случаен гора класификация.  Класификация на серопозитивните versus серонегативна мостри внаконтекст на АНКОРА 2.0 и ABCORA 5.0 беше реализиран използвайки a случаен гора Приближаване следното наосновна настройка на random гори като описано в57. The случаен гора себе си беше построена на ансамбъл от 1000 класификационни дървета, използващи MFI-FOE отговори (IgA, IgG,иIgM срещу RBD, S1, S2,N). The вероятност на a проба същество положителен като пред-  продиктувано от произволната гора е средната стойност на pробабилности над всичко 1000 дървета. И накрая, проба е дефинирананед като положителен ако неговото вероятност на същество положителен е по-горе a threshold c, който е деfiнед като да се получавам a спецfiград на при най-малко 0.99 и a максимален чувствителност във влакаинж набор от данни. в резюме, всякакви нов проба е деfiнед катосеропозитивни, ако iц вероятност на същество серопозитивни като оценени от на случаенгора е над трeshold c. Ние проведено a серия на случаен гора анализи които разглеждат или само SARS-CoV-2 отговори, или SARS-CoV-2 и HCV   отговори в ABCORA 2.0 и ABCORA 5.0: ABCORA 2.2 и ABCORA 2.3 бяхаобучени и използвани за прогноза На ABCORA 2.0 данни и включени само ТОРС-  CoV-2 отговори или ТОРС-CoV-2 и HKU1 отговори, съответно. ANCORA 5.4 (само отговори на SARS-CoV-2) и ABCORA 5.5 (SARS-CoV-2 и HCVотговори) са били обучени На ABCORA 5.0 данни. Подробности за включването на данни за съответно модели са изброени в Допълнителен Таблица 3 и Допълнителен Таблица 10. Анализите бяха извършени в R версия 3.6.3 с помощта на пакетес randomForest и     рейнджър58–61.

За да гарантираме надеждността на нашите констатации, извършихме проверкачувствителност анализ чрез рандомизиране наборите от данни за обучение и валидиране с помощта на 5-кратно кръстосано валидиранеметод. И двата комплектана положителен и негативи мостри са били разделени в five равенчасти и ние деfiнед че начин five валидиране комплекти (състоящ се на на i-th комплект напозитиви ина i-th комплект на негативи, i = 1.5). The Почивка на на данни беше използвани заобучение на ABCORA 2.3 произволна гора. За всеки набор за валидиране, специфичността ичувствителност на на случаен гора са били изчислено На на обучение, валидиране, и обучениеплюсвалидиране комплекти (Допълнителен Таблица 6).

Валидиране и проверка използвайки външен контроли. Ние използвани на Анти-ТОРС-  Панел за проверка на CoV-2 за серологични анализи (NIBSC код: 20/B770, NIBSC) да сепроверете ефективността на теста ABCORA 2.0 и ABCORA 2.3. Серумsдостатъчнона на вериfiкатион панел измерено от ABCORA 2.0/2.3 както е описано и резултатитев сравнение с резултатите от наличните в търговската мрежа анализи, докладвани от NIBSC (32 и допълнителна таблица 7). Ние фъртнея вериfiизд на чувствителност на на ABCORA 2 тест в откриване ТОРС-CoV-2 инфекция в директно сравнение с рекламататестове. антибоди състояние на плазма от ТОРС-CoV-2 положителен лица (N = 171) беше анализиранd с на следното тест системи: Включени тест системи насочени на N протеин (Elecsys® Анти-ТОРС-CoV-2 (Roche Diagnostics GmbH)), региона RBD на на S протеин (Elecsys® Анти-ТОРС-CoV-2 S анализ (Roche Diagnostics GmbH)),и на S1 подединица (ЕВРОИМУН Анти-ТОРС-CoV-2 ELISA (IgG)) (ДопълнителноТаблица 8). Всички анализи са извършени съгласнона производител's инструкции в на диагностика мерна единица на на институт на медицински Вирусология, Университет на Цюрих, Швейцария.