Нови антиоксидантни съставки от пивоварни вторични продукти за козметични формули

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:Целта на тази работа беше да се оцени общото съдържание на фенол и антиоксидантната активност на различни видове ръчно произведени бири (Ego, Alter, IFiat Lux, Triplo Malto, Ubi и Maior), както и изходните материали (малц, хмел и дрожди), междинните продукти и отпадъчните продукти (отработен малц, хмел и мая), с оглед на използването им в иновативни козметични формули. Екстракции от изходни и отработени проби са взети от вода или 70 градусов алкохол. Общото съдържание на фенол (Folin Ciocalteau Essay) на всички пивоварни продукти зависи от конкретния продукт, който се изследва. Най-високите стойности са открити в изходния хмел (вариращи от приблизително 93 до 155 mg GAE/g, според екстракционния разтворител), междинните стойности в изходния малц и изходните дрожди, а най-ниските стойности в пивната мъст. Общото съдържание на фенол в крайните бири произлиза от фенолите, които са били извлечени от различните съставки, а именно изходните малцове, хмел и дрожди, но незначителни стойности все още се наблюдават в отработените продукти. Методът, използван за оценка на антиоксидантната активност, еквивалентният антиоксидантен капацитет на Trolox (LPPH), антиоксидантният параметър за намаляване на железните йони (FRAP) и активността и редуциращата мощност на радикалните катиони (ABTS) силно повлияха на резултатите. Като цяло резултатите отразяват тенденцията, наблюдавана за общото съдържание на фенол: че бирите прогресивно се обогатяват с феноли, произхождащи от всички изходни съставки, и че отработените продукти все още притежават незначителна антиоксидантна активност.цистанчен холестеролИнтересно е да се отбележи, че отпадъчните дрожди често показват по-високи стойности от тези на изходния материал; може да се заключи, че дрождите са в състояние да абсорбират феноли от бирата по време на варене. Като се има предвид интересът към използване на отпадъците, получени от преработката на храни, биологичната активност на отпадъчните пивоварни продукти на Alter е оценена върху клетъчна култура на кератиноцити (отработени продукти от малц, хмел и дрожди). Бяха проведени предварителни in vitro анализи в кератиноцитни HaCaT клетки, за да се оцени потенциалната биоактивност на отработените екстракти. Сред използваните екстракти, използваните екстракти от хмел и дрожди показват способността да подобряват митохондриалната активност и да предотвратяват оксидативния стрес в HaCaT клетките, две характеристики на стареенето на кожата. В заключение, това проучване предлага доказателства, че отпадъците от ръчно изработени бири могат да бъдат интересен източник на феноли за приготвяне на козметика против стареене на кожата.

Ключови думи:крафт бира; пивоварни продукти; общо съдържание на фенол; антиоксидантна активност; цитотоксичност; против стареене

1. Въведение

Craftbeer става все по-популярна в САЩ и Европа [1,2], с важни последици за икономиката [3]. Този успех е подхранван от интереса на потребителите да дегустират нови бири с различни вкусове и аромати [2] и вниманието към ползите за здравето от умерената консумация на бира [4].

Моля, щракнете тук, за да научите повече

За разлика от търговските бири, занаятчийските бири са нефилтрирани и непастьоризирани и по този начин техните сензорни характеристики остават непроменени от процеса на варене. В допълнение, вещества, полезни за здравето, като антиоксиданти, също могат да бъдат спестени.

Търговските бири и техните отпадъчни продукти вече са оценени за техните антиоксидантни свойства. Джао и др. [5] определят фенолните профили и съответните антиоксидантни активности на 34 търговски бири и откриват забележими разлики в общото и индивидуалното фенолно съдържание и антиоксидантната активност. Най-разпространените фенолни съединения са галова и ферулова киселина. През същия период Ribeiro Tafulo et al. [6] определят антиоксидантната активност на 27 други търговски бири, използвайки няколко спектрофотометрични метода. Същата година Piazzon et al., 2010 [7] оценяват антиоксидантната активност и фенолното съдържание на различни видове търговски бири (abbey, ale, bock, wheat, lager, pilsner и dealcoholized) и откриват голямо разнообразие сред тях. В проучване върху домашните бири Farcas et al. [8] определят общото съдържание на полифеноли и антиоксидантната активност по време на целия производствен процес, като се започне от суровините (малц и хмел) и се стигне до възстановените отпадъци. Те показаха, че първоначалното по-високо общо съдържание на полифеноли и антиоксидантна активност в суровините се дължат на наличието на малц и че общото съдържание на полифеноли силно намалява при преминаване към бира и отработен малц в крайния бирен продукт и в отработения малц. Дрождите не са анализирани.

Cistanche може да спре стареенето

Фактът, че антиоксидантните съединения, получени от малца, е доказан от Zhao и сътрудници [9], които показват антиоксидантната активност и общото съдържание на фенол в няколко разновидности на пивоварния ечемик. Други автори идентифицираха четиридесет и седем фенолни съединения от четири вида търговска бира, използвайки течна хроматография, съчетана с електроспрей йонизираща хибридна линейна йонна капан квадруполна Orbitrap мас спектрометрична техника [10]. Наскоро идентифицирането на фенолни и азотни съединения с ниско молекулно тегло в занаятчийските бири беше постигнато чрез HPLC-ESI-MS/MS анализи [11]. Авторите се опитаха да разграничат видовете бири, като IPA, Lager и Weiss, според фенолните и азотните съединения, но не откриха значителни разлики в тези съединения между различните видове бира.

Съвсем наскоро [12], 20 фенолни съединения, например галова киселина, катехин, кафеена киселина, кверцетин, ксантохумол и хумулон, бяха избрани и количествено определени в различни занаятчийски бири, мъст, изходни съставки за варене (ечемичен малц, хмел и мая) ) и странични продукти (люспи от ечемик, отработен хмел и отработена мая). От това проучване беше установено, че съществуват значителни разлики между всички проби и че съставът на бирата зависи от получаването и процеса на варене. Фенолните съединения на бирите произхождат главно от ечемичен малц и, което е интересно, дрождите са били в състояние да абсорбират фенолни съединения от други източници.

По този начин оценката на антиоксидантите в отпадъчните продукти от производството на бира може да бъде от голямо значение, ако се вземе предвид бързият растеж на пазара на крафт бира в световен мащаб.

Използването на вторични продукти от пивоварната за разработване на здравословни продукти като козметика и/или добавки би спомогнало за повишаване на устойчивостта на производството на бира. Това проучване има множество цели: оценка на общото съдържание на фенол и антиоксидантната активност на различни видове италиански занаятчийски бири (лагер, кехлибарена, тройна малцова, червена и черна) и оценка на техния междинен продукт на производство, както и техните отпадъчни продукти. Биологичната активност на отпадъчните екстракти от пивоварната Alter беше оценена върху човешки кератиноцити. Това отваря нови и интересни възможности за използване на нови съставки от страничните продукти на пивоварната за coSmetic формулировки.

2. Експериментален

2.1. Материали

11-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ), (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (TROLOX), 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(98%TLC)(ABTS), gallic acid, sodium carbonate monohydrate ACS reagent, sodium acetate and ethanol(ethanol absolute grade) were purchased from Sigma-Aldrich(Steinheim, Germany). Manganese (IV)oxidize activated(>90 процента) и фенолният реагент на Folin-Ciocalteu е закупен от Fluka (Buchs, Швейцария). Безводният натриев ацетат и безводният железен (III) хлорид бяха закупени от JT Baker (Center Valley, PA, САЩ), а безводният натриев карбонат беше закупен от Carlo Erba (Милано, Италия). Всички разтворители и реактиви са с аналитичен клас. Свръхчистата вода е произведена от Gradient Milli-Q (Millipore, Molsheim, Франция). Изходни материали, ръчно изработени бири, мъст и техните отпадъчни продукти бяха любезно доставени от Birrificio Collesi (Apecchio, Италия).

Подробните характеристики на бирите, изследвани в настоящото изследване, са дадени в таблица 1. Типът изходен малц и хмел определят основните разлики между всички бири. Могат да се използват пет различни изходни малца, често в смеси и в различни пропорции. Хмелът Perle и Saaz се използва в различни пропорции за различните им аромати. Една и съща мая, Saccharomyces Cerevisiae, беше използвана за всички бири, които бяха типове с висока ферментация. Различните комбинации дават различни видове бири (светло, кехлибарено, тройно малцово, червено и черно) с алкохолно съдържание, вариращо от 6.0 до 9.0 процента V/V.

2.2. Приготвяне на пробата

Преди анализите изходните материали (малц, хмел и дрожди), бирата, пивната мъст и отпадъците (отработен малц, хмел и дрожди) бяха подложени на различни процеси според физическото им състояние, което можеше да бъде изсушено в твърдо, влажно състояние твърда или мътна течност (Таблица 2).

Влажните твърди вещества и течности първо бяха подложени на лиофилизация при температура от {{0}} градуса и налягане от 0,03 bar (FreeZone 1 Liter Benchtop Series77400 freeze-сушилня, LABCONCO, Kansans City, MO, USA). Изсушените твърди вещества се подлагат на смилане в мелница. След това всички проби бяха подложени на екстракции. Количеството на пробата се претегля внимателно и се диспергира в 100 mL разтворител (вода или 70-градусов етанол). Получената течност се поставя в Ерленмайерова колба, която след това се затваря внимателно. Пробите се разбъркват с магнитна бъркалка в продължение на 24 часа при стайна температура, след което се центрофугират при 12,000 rpm при 20 градуса в продължение на 10 минути, за да се отстранят неразтворените частици (Zetalab CNZ-140HE, Падуа, Италия). Пробите се лиофилизират и съхраняват при -20 градуса в полиетиленови флакони от 50 ml с капачка на винт (BD Falcon TM, BD Biosciences, Bedford, MA, USA), за да се осигурят оптимални условия на съхранение.

2.3. Определяне на общо съдържание на фенол

Общото съдържание на фенол (TPC) на пробите се определя по спектрофотометричния метод на Folin-Ciocalteu [13] с някои модификации [14]. Накратко, всички лиофилизирани продукти бяха използвани за приготвяне на бистри разтвори в концентрация от 10 mg mL-1. Аликвотна част от 50 μL от този разтвор се добавя към 150 μL фенолен реагент на Folin-Ciocalteu, разреден 1:4 с вода. След това се добавят 50 uL наситен разтвор на Na, CO3. След инкубиране при стайна температура в продължение на 10 минути, абсорбцията на всяка ямка се определя при 765 nm с помощта на четец на микроплаки (FLUOstar Omega, BMG Labtech GmbH, Ortenberg, Германия). Измерването беше сравнено с калибровъчен стандартен разтвор на галова киселина (GA) и резултатите бяха изразени като милиграми еквиваленти на галова киселина (GAE) на грам страничен продукт (mg GAE/g).

2.4. Оценка на антиоксидантната активност

Антиоксидантната активност на занаятчийската бира и страничните продукти беше оценена чрез измерване на 11-дифенил-2-пикрилхидразил (DPPH) активност на извличане на радикали, 2,2'-азино-бис(3- етилбензотиазолин-6-сулфонова киселина) (ABTS*) капацитет за извличане на радикални катиони и антиоксидантен капацитет за редуциране на желязо (FRAP).cistanche дозировка redditТролокс (6-хидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксилова киселина) се използва като стандарт за калибриране. Стойностите бяха изразени като mmol Trolox еквивалент/g от пробата като функция на IC50, определена като концентрацията на изпитвания материал, необходима за предизвикване на 50-процентно намаление на първоначалната DPPH, ABTS или концентрацията на желязо.

2.5. Оценка на еквивалентния антиоксидантен капацитет на Trolox (DPPH)

Активността на DPPH за улавяне на свободните радикали беше оценена чрез аналитичен анализ на микроплака съгласно публикувани по-рано методи [15] с някои модификации [16]. Накратко, 50 μL аликвотна част от пробата (концентрация от 10 mg mL-') и стандартът се добавят към 150 μL DPPH в абсолютен етанол в 96-ямкова микротитърна плака （BD FalconTM）След инкубиране при 37 степен за 20 минути, абсорбцията на всяка ямка се определя при 517 nm с помощта на четец на микроплаки. Антиоксидантната активност беше изчислена и изразена спрямо количеството Trolox съгласно уравнение (1)[17], където Ag и A са абсорбцията на DPPH● радикалния разтвор при 517 nm в присъствието съответно на контролната проба и екстрактните проби.

2.6. Активност на поглъщане на радикални катиони и намаляване на мощността (ABTS)

Анализът ABTS беше извършен след предишни процедури [18] и приложен към анализ на 96-ямкова микролитрова плака. Разтворът ABTS* плюс (5 mM) се приготвя чрез окисляване на ABTS с MnO във вода в продължение на 30 минути на тъмно. Аликвотна част от 50 μL от различните концентрации на пробата и стандарта （Trolox） се добавя към 150 μL разтвор на ABTS* в 96-ямкова микротитърна плака (BD FalconTM).ползи от екстракта от цистанчеСлед инкубиране при стайна температура в продължение на 10 минути, абсорбцията на всяка ямка се определя при 734 nm, като се използва четец на микроплаки. Стойностите бяха изчислени и изразени спрямо количеството Trolox съгласно уравнение (2) [17], където Ag и A са абсорбцията на разтвора на OHe радикала при 734 nm в присъствието съответно на контролната проба и екстрактните проби.

2.7. Фери-дълго-редуциращ антиоксидантен параметър (FRAP)

Стойностите на FRAP на занаятчийска бира/странични продукти бяха определени съгласно публикуван по-рано метод [19], с някои модификации [20]. FRAP реагентът се приготвя чрез смесване на следните три разтвора:

1. 50mL0,3M ацетатен буфер pH3,6 (1,23g натриев ацетат в 50 mL вода, подкисляваща

с оцетна киселина);

2. 5mLofstock разтвор на 5mMTPTZ(2,4,6-трипиридил-s-триазин)(15.6mg) в 40 mM HCl;3. 5 mL от 5 mM FeCl3:6 H2O (16.2 mg) в 40 mM HCI.

FRAP реагентът се нагрява при 37 градуса С преди употреба. Аликвотни части от 25 μL проба (разтвори с концентрация от 10 mg mL-1) бяха добавени в три екземпляра в ямки на 96-плака с ямки （BD Falcone）. Анализът започва с добавяне на 175 μL FRAP реагент към всяка ямка. Плаката незабавно се разклаща в четец на плаки FLUOstar Omega за 30 s и реакцията се оставя да тече 10 минути, след което плаката се чете на четец на плаки (593 nm). Референтен разтвор на Trolox беше пуснат едновременно и използван за генериране на калибрационната крива чрез линейна регресия. Стандартната крива е линейна между 25 и 800 μM Trolox（TE）. Резултатите бяха изразени в μM Trolox еквивалент （TE） gI проба.

2.8. Клетъчни култури

Човешка кератиноцитна клетъчна линия, HaCaT, се отглежда рутинно в модифицираната на Dulbecco Eagle's Medium (DMEM), допълнена с 10 процента фетален говежди серум (FBS), 2 mM L-глутамин, 50 U/mL пеницилин и 50 ug/mL стрептомицин при 37 градуса в овлажнен инкубатор с 5 процента CO. За да се оцени цитотоксичността, митохондриалната активност и вътреклетъчното образуване на ROS, HaCaT клетките бяха посяти в 96-ямкови плаки при 2×10* клетки/ямка. Всички експерименти бяха проведени след 24 часа инкубация при 37 градуса в 5 процента CO2. За експериментите с HaCaT клетки се приготвят основни разтвори на отработени екстракти във вода при 60 mg/mL. След това изходните разтвори се разреждат в пълна среда, за да се получат желаните концентрации на отработените екстракти.

2.9. Цитотоксичност и митохондриална активност

Клетъчната жизнеспособност се оценява чрез редукция на {{{{10}}}}(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил -2Н-тетразолиев бромид (MTT) към неговия неразтворим формазан, както е описано по-рано 21]. Накратко, клетките HaCaT бяха третирани в продължение на 24 часа с различни концентрации на екстракт (0.003-3 mg/mL) при 37 градуса в 5 процента CO. Впоследствие средата за третиране беше заменена с MTT в балансиран солев разтвор на Hank ( HBSS) (0,5 mg/mL) в продължение на 2 часа при 37 градуса в 5 процента CO. След промиване с HBSS кристалите формазан се разтварят в изопропанол. Нивата на формазан бяха измерени (570 nm, референтен филтър 690 nm) с помощта на четеца на плаки с множество етикети VICTORTM X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Клетъчната жизнеспособност се изразява като процент от контролните клетки.

Митохондриалната активност се определя от МТТ, както е описано по-рано, с леки модификации [22].Cistanche deserticola странични ефектиНакратко, клетките HaCaT бяха третирани в продължение на 4 часа или с DMEM 10 процента FBS (хранителна среда), или с буфериран с фосфат физиологичен разтвор на Dulbecco (физиологичен разтвор без хранителни вещества) в присъствието на 0,03 mg/mL екстракт при 37 градуса в 5 % CO. Впоследствие лечението беше заменено с МТТ за 2 часа при 37 градуса при 5 процента CO2. След промиване с HBSS кристалите формазан се разтварят в изопропанол. Нивата на формазан, които корелират с митохондриалната активност, се измерват (570 nm, референтен филтър 690 nm), като се използва четецът на плаки с много етикети VICTORTM X3 (PerkinElmer). Митохондриалната активност се изразява като процент от контролните клетки.

2.10. Вътреклетъчно образуване на ROS

Образуването на реактивни кислородни видове (ROS) беше оценено чрез флуоресцентна сонда 2'-7'дихлородихидрофлуоресцеин диацетат (H2DCF-DA), както е описано по-рано [23] (HaCaT клетките бяха третирани в продължение на 2 часа с 0.{ {23}}3 mg/mL екстракт при 37C в 5 процента CO2. Впоследствие средата за третиране се отстранява и към всяка ямка се добавят 100 μL H2DCF-DA（10ug/mL）. След 30 минути инкубиране при стайна температура, Разтворът на H2DCF-DA беше заменен с разтвор на H2O2（100 μM） за 30 мин. Паралелен набор от HaCaT клетки беше третиран с H2O и 0,03 mg/mL екстракт за 30 минути.цистанче чингис ханОбразуването на ROS се измерва от гледна точка на произволни единици флуоресценция, AUF (възбуждане при 485 nm и излъчване при 535 nm), като се използва четец на плаки с множество етикети VICTORTM X3 (PerkinElmer). Данните са изразени като кратно увеличение на образуването на ROS спрямо нетретирани клетки (т.е. AUF на клетки, третирани с Н, О,/AUF на нетретирани клетки).

Тази статия е извлечена от Cosmetics 2021, 8, 96. https://doi.org/10.3390/cosmetics8040096 https://www.mdpi.com/journal/cosmetics