NGF модулира метаболизма на холестерола и стимулира секрецията на ApoE в глиални клетки, предоставяйки неврозащита срещу оксидативен стрес, част 1

Резюме:

Холестеролът играе решаваща роля в мозъка, където астроцитната активност по-специално регулира метаболизма. Наистина, възрастните неврони потискат своя биосинтез на холестерол и внасят този стерол чрез богати на ApoE частици, секретирани от астроцити. Последните доказателства сочат, че нервният растежен фактор (NGF) може да упражнява невротрофична активност чрез повлияване на клетъчния метаболизъм.

Невроните са основните единици, които изграждат човешкия мозък. Чрез връзките между невроните те формират нашата мозъчна кора, която носи цялото ни знание и спомени. Следователно невроните са тясно свързани със способността за памет.

Основната функция на невроните е да предават информация. Всеки неврон има синапс, който свързва дендритите и аксоните на други неврони. Когато невронът получи сигнал, той предава сигнала на невроните, към които е свързан. Това сигнализиране, наречено невронно предаване, е един от ключовите процеси при формирането, съхранението и извличането на паметта.

За да поддържаме мозъка си здрав, можем да насърчим правилното функциониране на нашите неврони чрез упражнения. Физическите упражнения подобряват кръвообращението и снабдяването на мозъка с кислород, като по този начин увеличават броя и връзките на невроните. В същото време различни социални и учебни дейности могат да образуват нови неврони в нови области на мозъка и да увеличат пластичността на мозъка.

Когато имаме повече, по-активни неврони, нашата памет става по-силна. Синхронът между невроните в мозъчната кора става по-равномерен, което ни улеснява да съхраняваме и извличаме информация, подобрявайки когнитивните си способности. В допълнение, голям брой неврони и връзки между невроните също ще подобрят скоростта на реакция и способността ни за вземане на решения.

Следователно поддържането на здрави неврони и подобряването на паметта вървят ръка за ръка. Можем да подобрим паметта си, като насърчаваме здрави неврони, като се съсредоточаваме върху физически упражнения, разнообразие от социални и учебни дейности и диетични навици. Нека работим заедно, за да поддържаме здравето на нашия мозък! Вижда се, че трябва да подобрим паметта си. Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola е традиционен китайски лекарствен материал с много уникални ефекти, един от които е да подобрява паметта. Ефикасността на мляното месо идва от различни активни съставки, които съдържа, включително карбоксилна киселина, полизахариди, флавоноиди и др. Тези съставки могат да стимулират здравето на мозъка по различни канали.

Щракнете върху познайте начините за подобряване на мозъчната функция

Независимо от това, ефектът на NGF върху хомеостазата на глиалния холестерол все още не е изяснен. Този проект има за цел да оцени дали NGF може да повлияе на метаболизма на холестерола в глиалните клетки. Клетъчната линия, получена от астроцити U373, беше използвана като експериментален модел за постигане на тази цел. Имуноблот и ELISA анализ показаха, че протеините и ензимите, принадлежащи към мрежата на холестеролния метаболизъм, се повишават при третиране с NGF в глиалните клетки. Освен това, NGF значително повишава секрецията на АроЕ и количеството извънклетъчен холестерол в културалната среда.

Експериментите с съвместно култивиране и U373-кондиционирана среда показват, че лечението с NGF ефективно противодейства на медиираната от ротенон цитотоксичност в N1E-115 невронни клетки. Обратно, неврозащитата, медиирана от лечението с NGF, беше потисната, когато N1E-115 бяха съвместно култивирани с ApoE-заглушени U373 клетки. Тези данни предполагат, че NGF контролира хомеостазата на холестерола в глиалните клетки. По-важното е, че NGF упражнява невропротекция срещу оксидативен стрес, вероятно свързан с индуцирането на глиална секреция на АроЕ.

Ключови думи:

АроЕ; астроцит; холестерол; диференциация; фактор на растежа на нервите; метаболизъм; неврон; реактивни кислородни видове; ротенон.

1. Въведение

Мозъкът се характеризира с най-високото количество холестерол в цялото тяло [1]. Изключителната концентрация на този стерол в централната нервна система (ЦНС) е оправдана от факта, че холестеролът участва в няколко основни биологични процеса. Трябва да се отбележи, че значително количество холестерол се интегрира в плазмените мембрани на астроцитите и невроните, където определя правилната клетъчна морфология и правилното функциониране на мембранните рецептори и синаптичната невротрансмисия [2].
Холестеролът също е от съществено значение за образуването на нови мембрани, необходими за израстване на неврит, синаптогенеза и освобождаване на невротрансмитери, като по този начин е от решаващо значение за диференциацията и съзряването на невроните [3–7].

По същество целият холестерол в мозъка произлиза от de novo биосинтеза in situ. По-конкретно, кръвно-мозъчната бариера (BBB) ​​предотвратява усвояването на холестерол, произтичащ от липопротеините, транспортирани през системното кръвообращение [8]. Поради тази причина нервните клетки развиват примерна регулаторна мрежа, за да управляват независимо собственото си търсене на този липид. Един добре приет модел установява, че след ембриогенезата, по време на постнаталния период, биосинтезата на холестерол драстично спада в невроните, с опит да се спести енергията, използвана за генериране на потенциалите за действие.

Съответно, астроцитите отговарят на съмнителните невронни изисквания на холестерола, чийто синтез става особено изразен [1,9,10]. Доставянето на холестерол, произведен от астроцитите, до невроните предполага елегантен механизъм на хоризонтален транспорт, който включва критични протеини и частици. По-конкретно, износът на холестерол започва в астроцитите, където нео-синтетизираният холестерол се зарежда в зараждащи се липопротеинови частици, съдържащи аполипопротеин Е (ApoE). Натрупващите се доказателства показват, че липидирането на богати на ApoE частици се медиира от транспортната ATP-свързваща касета A1 (ABCA1) [11]. Впоследствие, веднъж освободен в извънклетъчното пространство, АроЕ-съдържащият липопротеин се поема от неврони чрез рецептор-медииран ендоцитозен липопротеинов рецептор с ниска плътност (LDLr) и LDLr-свързан протеин 1 (LRP1) [12].

Според основната роля на холестерола, получен от астроцити, в невроналната хомеостаза, експерименталните открития показват, че холестеролът, съдържащ се в богатите на ApoE липопротеини, значително подобрява диференциацията на дендритите и синаптичната функция [13,14]. Кондиционирана среда с акординастроцити от астроцити на болестта на Хънтингтън (HD), които отделят само умерено количество ApoE-липопротеин-свързан холестерол, силно засяга невритния растеж и синаптичната активност в HD невроните [15].

Невротрофичното действие на ApoE-съдържащи частици, получени от астроцити, се поддържа допълнително от въздействието на дефицит на ApoE, което значително възпрепятства неврогенезата на възрастни в хипокампуса [16]. Слушането между астроцитите и невроните на холестерола също е критично за невропротекция срещу оксидативен стрес. Например, някои доклади показват, че ApoE възпрепятства окислителното увреждане и апоптозата, предизвикана от излагане на водороден пероксид [17,18].

От тези наблюдения поддържането на хомеостазата на холестерола в мозъка е необходимо, за да се гарантира функционирането на нервните клетки, а метаболитните пътища, лежащи в основата на регулирането на този липид, трябва да бъдат фино контролирани, за да се запази появата на няколко неврофизиологични процеса.

През последните години невротрофините се очертаха като основни играчи в клетъчния метаболизъм [2,19–22]. Невротрофините принадлежат към малко семейство растежни фактори, които имат неоспорима роля в развитието на невроните, оцеляването и пластичността [23]. Съвсем наскоро тези сигнални молекули също бяха признати за решаващи модулатори на клетъчния метаболизъм, включително метаболизма на холестерола [2,22].

Експерименталните доказателства подчертават, че нервният растежен фактор (NGF), прототипът на семейството на невротрофините, стимулира биосинтезата на холестерол в невронни клетки и хепатоцити [24,25]. Интересното е, че тези събития включват, поне отчасти, невротрофиновия рецептор с нисък афинитет p75NTR, който предизвиква активиране на свързващия протеин 2 на стеролния регулаторен елемент (SREBP-2) и на свой ред индуцира транскрипцията на свързани с холестерола гени [25]. Активността на NGF върху метаболизма на холестерола не е ограничена до биосинтезата, тъй като той също насърчава усвояването на холестерола чрез увеличаване на експресията на LDLr в невроните [26].

Въпреки тази информация, знанието за възможния принос на NGF в регулирането на холестеролната хомеостаза все още изглежда особено ограничено. Трябва да се отбележи, че липсват систематични проучвания, оценяващи ролята на NGF в регулирането на метаболизма на холестерола в астроцитните клетки. Като се има предвид, че холестеролът, произведен от астроцитите, е от съществено значение за гарантиране на физиологията на невроните, важно е да се разбере дали може да се повлияе метаболизма на холестерола в глиалните клетки, както и междуклетъчния транспорт на холестерола, чиято специфична регулация е наложителна, за да се осигури здравето на мозъка.

Въз основа на тази работа, целта е да се проучи бъдещото участие на NGF в модулирането на метаболизма на холестерола в глиалните клетки, както и неговото въздействие върху невронната диференциация и оцеляването на невроните при условия на оксидативен стрес.

2. Резултати

2.1. U373 експресира както NGF рецепторите TrkA, така и p75NTR

Първоначално NGF беше идентифициран като растежен фактор със специфичен тропизъм за невронни клетки. Въпреки това, натрупването на доказателства показва, че този невротрофин също предизвиква биологични ефекти в няколко не-невронални клетки и тъкани [22]. Активността на NGF се осигурява от свързването му с рецептора с висок афинитет TrkAd към рецептора с нисък афинитет p75NTR [2].

По този начин ние първоначално установихме дали U373 клетки експресират NGF рецептори. Трябва да се отбележи, че U373 е астроцитомна клетъчна линия, широко използвана като модел на астроцитна клетъчна култура, тъй като няколко доклада показват, че те възпроизвеждат морфологични, метаболитни и функционални свойства на астроцитите [27–29]. Според публикувани данни [30], имунофлуоресцентният анализ показа, че клетките U373 експресират както TrkA, така и p75NTR на значителни нива (Фигура S1A). Тези резултати също бяха потвърдени от Western blot анализ, което предполага, че U373 клетките имат потенциала да реагират напълно на NGF.

Тъй като прилагането на NGF може да повлияе на нивата на експресия на неговите рецептори, потенциално променяйки баланса между сигналните пътища, предизвикани от TrkA и/или p75NTR [31–33], експресията на двата рецептора също беше проверена след 48 часа лечение с NGF. Въпреки това, не са наблюдавани промени в количеството протеин както на TrkA, така и на p75NTR след стимулацията с невротрофина (Фигура S1B).

2.3. NGF повишава секрецията на холестерол от U373 в хранителната среда

Получените резултати ни накараха да проучим дали ефектите, медиирани от NGF, могат да отразяват модулирането на съдържанието на холестерол. Извършено е оцветяване с Oil Red O за визуализиране на неутрални липиди, включително холестерил естери. Размерът и броят на липидните капчици, намерени в U373 клетки, са подобни на тези, докладвани за първичните астроцити [34,35].

Въпреки това, не са наблюдавани промени при лечение с NGF (Фигури 2A и S2A, B). По подобен начин не са открити промени в количеството свободен холестерол, оценено чрез оцветяване с филипин (фигури 2B и S2C). Липсата на значителни ефекти върху нивата на вътреклетъчния холестерол беше допълнително подкрепена от ензимен анализ на холестерола, който подчерта, че NGF не променя съдържанието на общия холестерол, свободния холестерол и холестериловите естери (Фигура 2С).

Обратно, количеството холестерол (свободен, естери и общ) е значително повишено в културалната среда на U373-третиран NGF (Фигура 2D). Когато се оценят като цяло, тези данни показват, че NGF насърчава екструзията на холестерол чрез усилване на ABCA1-медиирания ефлукс на ApoE-съдържащи частици.

Фигура 1. NGF модулира експресията на основните протеини, участващи в хомеостазата на холестерола в U373 клетки и повишава секрецията на АроЕ n в културалната среда U373. (A–G) Представителен Western blot и денситометричен анализ на SREBP-1, SREBP-2, HMGCR, LDLr, NPC1, ABCA1 и ApoE в U373 клетки, третирани с носител (Ctrl) и NGF (100 ng /mL) за 48 часа. n=6 различни експеримента.

Актинът и винкулинът бяха използвани като контроли за натоварване. (H) Количествено определяне на нивата на АроЕ (µg/mL) чрез ELISA анализ в третирана с носител и NGF културална среда U373. n=3 различни експеримента. Данните представляват средно ± SD. Статистическият анализ беше оценен чрез единичен несдвоен тест на Studet. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

2.4. p75NTR участва частично в посредничените от NGF ефекти върху холестеролова протеинова мрежа

Експериментални открития показват, че NGF влияе върху метаболизма на холестерола в чернодробните клетки чрез активирането на неговия рецептор с нисък афинитет p75NTR [25]. За да проверим дали този сигнален път може да бъде запазен и в астроцитните клетки, ние третирахме U373 с LM11A-31, малък лиганд, действащ като специфичен p75NTR модулатор. Това съединение не активира TrkA, но, подобно на NGF, предизвиква индукция на p75NTR сигнални пътища надолу по веригата [36]. LM11A-31 имитира NGF-медиираното повишаване на HMGCR (Фигура 3А).

Въпреки това не са наблюдавани промени в другите протеини, участващи в метаболизма на холестерола (Фигура 3B–D), нито в количеството на извънклетъчния ApoE (Фигура 3E) и холестерол (общ, свободен и естери), освободен в културалната среда (Фигура 3F ). Взети заедно, тези резултати показват, че индуцираната от NGF експресия на HMGCR се медиира от активността на p75NTR, докато ефектите върху NPC1, ABCA1, секрецията на ApoE и екструзията на холестерол вероятно зависят от други пътища на трансдукция, вероятно включващи TrkA.

Фигура 2. Ефекти на NGF върху съдържанието на неутрални липиди и холестерол. (A) U373 клетките се третират с носител (Ctrl) или NGF (100 ng/mL) в продължение на 48 часа и след това се оцветяват с Oil Red O, за да се визуализира вътреклетъчното съдържание на неутрални липиди. n=3 различни експеримента. (B) Представително изображение на оцветяване с филипин, извършено върху U373 клетки, третирани с носител (Ctrl) и NGF (100 ng/mL) в продължение на 48 часа. n=3 различни експеримента. (C) Количествено определяне на нивата на вътреклетъчния холестерол (общ холестерол, свободен холестерол и холестерил естери) в U373 клетки, третирани с носител и NGF. n=3 различни експеримента. (D) Количествено определяне на холестерол (общ холестерол, свободен холестерол и холестерил естери) в културалната среда на U373 клетки, третирани с носител (Ctrl) и NGF (100 ng/mL) в продължение на 48 часа. n=3 различни експеримента. Данните представляват средно ± SD. Статистическият анализ беше извършен чрез пеене на несдвоен t-тест на Student. ** стр<0.01.

Фигура 3. Ефекти на p75NTR модулация от LM11A-31 върху метаболизма и секрецията на холестерола. (A–D) Представителен Western blot и денситометричен анализ на HMGCR, ABCA1, NPC1 и ApoE в U373 клетки, третирани с носител (Ctrl) и LM11A-31 (0.1 µM) за 48 часа. n=4 различни експеримента.

Vinculin служи като домакински протеин за нормализиране на протеиновото натоварване. (E) Количествено определяне на количеството на АроЕ (µg/mL) чрез ELISA анализ в културална среда от U373 клетки, третирани с носител и LM11A-31-. n=3 различни експеримента. (F) Количествено определяне на холестерол (общ холестерол, свободен холестерол и холестерил естери) в културалната среда на U373 клетки, третирани с носител (Ctrl) и LM11A-31 (0.1 µM) за 48 часа. n=3 различни експеримента. Данните представляват средно ± SD. Статистическият анализ беше извършен с помощта на единичен несдвоен тест на Studet. *** p < 0.001.

For more information:1950477648nn@gmail.com