Nlrc3 нокаут мишки показаха бъбречни патологични промени след HTNV инфекция

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Вирусът Hantaan (HTNV) заразява хората и причинява хеморагична треска сбъбречнасиндром(HFRS). Разработването на добре охарактеризирани животински модели на HFRS може да ускори тестването на кандидати за ваксина и терапевтични агенти и да предостави полезен инструмент за изследване на патогенезата на HFRS. Тъй като NLRC3 има множество имунорегулаторни роли, ние изследвахме чувствителността на Nlrc3−/− мишки към HTNV инфекция, за да установим нов модел на HFRS. Nlrc3−/− мишки развиха загуба на тегло,бъбречен кръвоизлив,и тубулна дилатация след инфекция с HTNV, обобщаваща много клинични симптоми на човешки HFRS. Освен това, заразените Nlrc3-/- мишки показват по-високи вирусни натоварвания в серума, далака и бъбреците, отколкото див тип C57BL/6 (WT) мишки и някои от тях проявяват повече хематологични нарушения и значителни патологични промени в множество органи, отколкото WT мишки. Нашите резултати идентифицират, че заразените с HTNV Nlrc3−/− мишки могат да развият клинични симптоми и патологични промени, наподобяващи пациенти с HFRS, което предполага нов модел за изследване на патогенезата и тестване на кандидат ваксини и терапевтични средства.

Ключови думи:HFRS, HTNV, NLRC3, бъбречен кръвоизлив, дилатация на бъбречните тубули

ВЪВЕДЕНИЕ

Хеморагична треска сбъбречнасиндром (HFRS) представлява остра интерстициална нефропатия след зоонотично предаване на хантавируси от гризачи на хора. Болестта се среща главно в Азия и Европа (1, 2). Най-разпространените патогени, причиняващи HFRS, са вирусът Dobrava (DOBV), вирусът Puumala (PUUV), вирусът Seoul (SEOV) и вирусът Hantaan (HTNV), всеки от които причинява различна тежест на HFRS. Характеристиките на заболяването са различни в Северна и Южна Америка, където хантавирусната инфекция причинява хантавирусен белодробен синдром (HPS), главно от вируса на Андите (ANDV) и вируса Sin Nombre (SNV) (3).

HFRS протича с характеристики на висока температура, хипотония,бъбречна недостатъчност и кръвоизлив(4). Може да се раздели на пет клинични стадия: фебрилен, хипотензивен шок, олигурен, диуретичен и реконвалесцентен. Остър епизод на HTNV инфекция, водещ до HFRS, често е придружен от тромбоцитопения, левкоцитоза, анемия, повишен серумен креатинин и чернодробни ензими (5). Тези клинични симптоми и признаци могат отчасти да се обяснят с факта, че HTNV атакува главно бъбреците и предизвиква бъбречно увреждане, характеризиращо се с остър тубулоинтерстициален нефрит, включващ инфилтрация на възпалителни клетки (6), като впоследствие засяга множество други органи (7)

Гризачите са естествените резервоари за хантавирусите, които упорито заразяват животните, без да причиняват заболяване (8). Техните екскременти, като слюнка, урина и изпражнения, се превръщат в потенциални замърсители, които могат да заразят хората, които вдишват аерозоли с малки частици от замърсени екскременти. Хантавирусите обикновено причиняват асимптоматична инфекция при възрастни BALB/c и C57BL/6 мишки (9), но смъртоносно неврологично заболяване или персистираща инфекция при кърмачета и новородени мишки (10, 11). Въпреки че нефропатични аномалии бяха демонстрирани при експериментално заразени с PUUV cynomolgus макаци (Macaca fascicularis), тези животни показаха само лека протеинурия, имунна клетъчна инфилтрация и тубулно увреждане на бъбреците, подобно на лек случай на HFRS (12). В допълнение, хамстери, заразени с HTNV по назален път, водят до персистираща асимптоматична инфекция, характеризираща се със спорадична виремия, но високи нива на копия на вирусен геном в белите дробове, мозъка и бъбреците. Поровете, заразени с висока доза HTNV чрез мускулна инжекция, показват постепенно намаляване на телесното тегло (5-12 процента с течение на времето), но непокътнатибъбречни функции,липса на виремия и липса на предаване на вируса към органите. При мармозетките интрамускулното инжектиране на HTNV води до висока степен на сероконверсия и производство на неутрализиращи антитела; последователно, тези животни нямат увреждане на бъбреците, виремия или предаване на вируса на органи (13).

Въпреки тяхното несъвършенство, животински модели, използващи плъхове и мишки, бяха широко използвани за изследване на патогенезата на Hantavirus (14). Yoshimatsu и др. показаха, че инфекцията на SCID мишки с HTNV причинява смъртоносна загуба на болест с белодробен оток (15, 16), а изчерпването на неутрофилите предотвратява развитието на белодробен оток, но не са открити характерни хеморагични лезии на HFRS (15). Shimizu и др. установено, че HTNV, изолиран от пациенти с HFRS, може да зарази 6-седмични женски BALB/c мишки интравенозно, причинявайки виремия за 6-9 дни, показвайки признаци на заболяване, включително временна загуба на тегло, бръчки на косата, бъбречна ексудация (17 ). В същия модел на мишка имаше макроскопски кръвоизлив в границата междубъбречна кораи медула, но не е изследвано дали наблюдаваните хистопатологични промени са свързани с намалена бъбречна функция. При хуманизирани мишки инфекцията с HTNV води до загуба на тегло, намалена активност, разрошена козина и белодробно увреждане, което изглежда, че белият дроб е основният целеви орган за вирусна инфекция (18). Следователно все още е необходим подходящ животински модел на HTNV инфекция, който улавя повечето болестни характеристики на HFRS.

cistanche мнениязадилатация на бъбречните тубули

NLR са най-известното семейство от вътреклетъчни вродени имунни рецептори и изпълняват различни функции при регулиране на вродения имунитет. Въпреки че най-известните NLR (напр. NLRP3) проявяват положителна регулаторна функция при възпалително и имунно активиране, необичайна подгрупа от NLR, дефинирани като инхибиторни NLR, проявяват инхибиторна функция при възпалителни реакции. За да се разбере механизмът на NLR-медиирана вродена имунна супресия, бяха изследвани лиганди за инхибиторни NLRs като NLRC3 и NLRX1 (19). NLRC3 е отрицателен регулатор, който отслабва отговора на интерферон тип I (IFN-I) чрез секвестиране и отслабване на активирането на стимулатор на интерферонови гени (STING) (19). NLRX1, като централен хомеостатичен вратар между митохондриалната биология и имунологичния отговор, е замесен в широк спектър от заболявания, както причинени от патогени, така и по друг начин (20). Тъй като заболяването HTNV проявява много нарушена регулация на възпалението и имунната активация, ние избрахме Nlrc3-/- мишки, за да изследваме молекулярните механизми на заболяването.

Това проучване демонстрира, че моделът на мишки Nlrc3−/− наподобява системно увреждане, наблюдавано при пациенти с HFRS, характеризиращо се с тромбоцитопения,дилатация на бъбречните тубули и кръвоизлив.Анализът на вирусното натоварване разкрива, че Nlrc3−/− мишките показват по-високи вирусни натоварвания в множество тъкани, включително серум, далак и бъбрек. Нашите проучвания установяват миши модел за HTNV инфекция, полезен за оценка на кандидат ваксини и терапевтични средства.

МЕТОДИ

VVirus запаси

HTNV щам {{0}} беше дарен от Changshou Hang (Китайски център за контрол и превенция на заболяванията) и след това запазен и разширен в нашата лаборатория. Клетките Vero E6 бяха използвани за размножаване на вируса и инфекциозните титри бяха количествено определени с помощта на 50 процента инфекциозна доза от тъканна култура (TCID50) чрез имунофлуоресцентни анализи (IFA). Преобразуването между TCID50 и образуващи плака единици (PSUs) се основава на следното изчисление: 1 PFUs ≈0,7×TCID50 (21).

поколение на Nlrc3 Knockout Mouse Model

Мишки от див тип C57BL/6J и модели на мишки с нокаут Nlrc3 (Nlrc3−/−) са проектирани и разработени от Shanghai Model Organisms Center, Inc (Шанхай, Китай). За получаване на Nlrc3-/- мишка, Cas9 mRNA и sgRNAs се приготвят чрез in vitro транскрипция. Две sgRNA, насочени към изтриване на екзони 2-3 на Nlrc3 ген: 5'- GTTGGTCTAATAAGCATCCTGGG {{10}}', 5'- TCCCATGAAACCATGTCAGAAGG -3'. Зиготи на C57BL/6J мишки бяха получени и инжектирани с In vitro транскрибирана Cas9 mRNA и sgRNA и прехвърлени на псевдобременни реципиенти. Генотипът на получените F0 мишки беше идентифициран и потвърден чрез PCR и секвениране с използване на двойки праймери: F-5'- GTGATGTCTGCTTACC CCGTCTCC -3'; R-5'- GCCTGTGCCGCCCTCTCA -3'. Чрез кръстосване с C57BL/6J мишки, положителни F0 мишки бяха избрани за получаване на F1 хетерозиготни Nlrc3 нокаут мишки. PCR и секвениращият анализ валидират получените F1 мишки. За получаване на хетерозиготни Nlrc3-/- мишки, женски и мъжки F1 хетерозиготни мишки бяха кръстосани на случаен принцип. За всички изследвания са използвани мишки на възраст 6-8 седмици.

Инфекция на животните и подготовка на проби

Общо 5×105 PFUs от HTNV в 50 ul среда се инокулират по интраперитонеален път. Мишките в контролните групи получават идентични количества PBS. Използвани са двадесет до двадесет и пет Nlrc3-/- или WT мишки. Всеки тип мишки беше подразделен на пет групи за вземане на проби на 0, 3, 6, 9 и 12 дни след заразяването. Телесното тегло и аналната температура се записват ежедневно. Във всеки момент четири до пет животни от двете групи бяха евтаназирани за тестване. За вирусологичен анализ бяха събрани пресни тъканни проби от сърцето, черния дроб, далака, белия дроб, бъбреците и мозъка и след това незабавно замразени при -80 градуса. Мишките се перфузират със студен PBS и органите се фиксират в 4 процента параформалдехид за 4 часа за хистологичен и имунохистохимичен анализ. Беше взета кръвна проба за тестване на вирусния товар и рутинно изследване на кръвта, а серумът беше изолиран за биохимичен анализ.

Анализ на цитокини

Общо 25 mL серум от всяка мишка беше анализиран за 13 различни цитокини с LEGENDplex™ Mouse Anti-Virus Response Panel (13-plex) (BioLegend) съгласно инструкциите на производителя. За откриване беше използван цитометър FACS Calibur (Becton Dickinson Biosciences, Калифорния). Данните бяха анализирани от LEGENDplex v8.0. Софтуер.

RT-PCR анализ в реално време

Тъканните проби от всяка мишка бяха претеглени и потопени в PBS и хомогенизирани чрез автоматизиран хомогенизатор-TissueLyser II (QIAGEN, Германия), използвайки честота 30/s и време 5 минути. За тотална екстракция на РНК, 200 mL тъканни хомогенати се прехвърлят в 500 mL TRIzol реагент, последвано от екстракция с хлороформ и утаяване с изопропанол. 140 mL серумни проби бяха прехвърлени в 560 mL AVL буфер, съдържащ РНК носител (Qiagen, UK) за екстракция на РНК с помощта на комплекта QIAamp Viral RNA Mini (Qiagen, UK). Накрая, РНК се разтваря отново във вода без РНКаза. Беше извършен HTNV специфичен RT-PCR анализ в реално време за откриване на вирусна РНК от всяка проба. Праймерните последователности, специфично насочени към сегмента на HTNV, бяха приети, както следва: F-5'- GATCAGTCACAGTCTAGTCA- 3' и R-5'- TGATTCTTCCACCATTTTGT-3'. One-Step TB Green PrimeScript™ RT-PCR комплект II (Perfect Real Time) (Takara, Япония) беше използван за qRT-PCR анализ. Последната основна смес (20 mL) включва 2 mL РНК, 5,6 mL dH2O без РНКаза, 0,8 mL пренасочващ и обратен праймер (10 mM), 0,8 mL PrimScript 1 стъпка ензимен микс 2 и 10 mL 2 × една стъпка TB Green RT-PCR буфер 4. Използваните циклични условия бяха 42 градуса за 5 минути, 95 градуса за 10 секунди, след това последвани от 40 цикъла от 95 градуса за 0 секунди, 65 градуса за 15 секунди и 95 градуса за 0 секунди. Реакциите бяха проведени и анализирани на платформата LightCycler (Roche Diagnostics, САЩ).

Абсолютно количествено определяне на вирусния товар

Вирусните РНК олигонуклеотиди като РНК стандарт бяха получени чрез in-vitro-транскрипция от ДНК с помощта на MAXIscript Kit (Thermo Scientific, Обединеното кралство), който включваше 562 бази от HTNV РНК, насочени от анализа (22), и след това количествено определени чрез спектрофотометър с ултрамикро микроплака ( BioTek Epoch, САЩ), концентрацията на стандартния запас на РНК беше 800 ng/mL. За оценка на вирусния товар във всяка проба, стандартната РНК се приготвя с 10-кратно серийно разреждане, вариращо от 1010 копия до 103 копия на реакция. Нашата стандартна РНК има граница на откриване от 1010 копия до 101 копия на реакция и по този начин ние задаваме прага на откриване за този анализ на 100 геномни копия на реакция. По време на анализ бяха установени стандартни криви с наклон -3.6624, Y-отсечка от 41.68 цикъла и R2 стойност от 0.9996.

Анализ на нивата на протеин чрез Western Blotting

Тъканните лизати се приготвят от тъканни проби от мишки. За откриване на протеинова концентрация беше използван комплект за анализ на протеин на бицинхонинова киселина (BCA) (Thermo Scientific, UK). За протеинов анализ, 30 mg общ протеин от всяка проба се качват върху SDS-полиакриламиден гел и се прехвърлят към NC мембрани. След това 5% разтвор на обезмаслено мляко се използва за блокиране при стайна температура в продължение на 2 часа. След това се добавя разредено 1:1000 моноклонално антитяло 1A8 срещу HTNV-NP (приготвено и пречистено от нашата лаборатория) (23, 24) и се инкубира при 4 градуса за една нощ. Накрая, мембраните се инкубират с вторични антитела, HRP-конюгиран заешки анти-миши IgG или HRP-конюгиран миши анти-заешки IgG при стайна температура в продължение на 2 часа. След това се добавя хемилуминесцентният субстрат на HRP за откриване на протеините. Денситометричният анализ на интензитета на протеиновата лента беше извършен с помощта на софтуер Image J (NIH, САЩ). b-актинът се използва като контрола на натоварването за нормализиране.

Имунохистохимичен анализ

Тъканните проби се поставят в парафин и се нарязват на 4 mm за имунохистохимично оцветяване. Срезовете се подлагат на депарафинизация и рехидратация и инактивиране на ендогенни пероксидази. Срезовете бяха подложени на извличане на антиген в цитратен буфер (PH =6) при 95 градуса за 10 минути. След това се използва 5 процента нормален кози серум за блокиране при стайна температура в продължение на 40 минути. mAb 1A8 се използва като първично антитяло за HTNV NP антиген и се инкубира с тъканни срезове при 4 градуса за една нощ. Това беше последвано от оцветяване с FITC анти-миши IgG (Invitrogen) при 37 градуса за 1 час и след това DAPI за 10 минути при стайна температура. 3DHISTECH (Унгария) беше използван за получаване на изображения и CaseViewer2.4 за анализ на данни.

Хистологично изследване

За да се запази клетъчната и тъканната морфология, 4 процента неутрален буфериран формалин беше използван за фиксиране на тъканни проби за хистопатологичен анализ. Тези тъкани се обработват в срезове от 5 mm и след това се оцветяват с хематоксилин и еозин (H&E). Накрая, секциите бяха изследвани чрез светлинна микроскопия и изображенията бяха заснети от 3DHISTECH (Унгария), анализирани от CaseViewer2.4. Степента на лезиите се оценява визуално с помощта на предварително зададена 4-система от степени: в нормални граници като 0, минимална като 1, лека като 2, умерена като 3, тежка като 4.

Изследвания върху животниВсички експерименти с животни са одобрени от Комисията за лабораторни експерименти на Четвърти военномедицински университетски център за животни. (№ 20210403).

СтатистикаДанните бяха анализирани с помощта на софтуер GraphPad Prism 9. Освен ако не е посочено друго, всички данни бяха представени като средна стойност ± стандартното отклонение (SD). Използвани са t-тестовете или еднопосочен ANOVA, както е посочено в легендите на фигурите. P-стойност по-малка от 0.05 се счита за значима.

РЕЗУЛТАТИ

Откриване на вирусен товар в различни органи на Nlrc3−/− мишки след интраперитонеална инфекция с HTNV

За да се характеризира чувствителността на Nlrc3−/− мишки към HTNV инфекция, група от Nlrc3−/− мишки бяха интраперитонеално инфектирани с 5×105 PFUs от HTNV на мишка, като се използват WT мишки като контроли. Всички животни се наблюдават ежедневно за клинични симптоми, температура и промени в телесното тегло. Мишките бяха умъртвени на 3, 6, 9 и 12 дни след заразяването (dpi), за да се анализират различни лабораторни параметри, вирусни натоварвания и патология. Nlrc3−/− мишки започнаха да губят тегло при 4 dpi, а при 6 dpi беше записана загуба на тегло > 5 процента от първоначалното им телесно тегло. За сравнение, WT мишки не показват загуба на тегло (Фигура 1А). Не е регистрирана треска и в двете групи (Фигура 1B). За да се оцени разпространението и репликацията на HTNV при заразени с вируси мишки, серумът и основните органи (включително сърце, черен дроб, далак, бял дроб, бъбрек и мозък) бяха събрани за абсолютно количествено определяне на броя на копията на вирусна РНК. Резултатите показват, че виремия се наблюдава при 3 dpi и в двете групи (Nlrc3−/− мишки: 943 ± 140 копия еквивалента на mL; WT мишки: 803 ± 277 копия на mL). Трябва да се отбележи, че серумните вирусни натоварвания на WT мишки достигнаха своя връх при 3 dpi и бързо намаляха след това, докато при Nlrc3−/− мишките вирусният товар поддържаше междинно ниво до 6 dpi и след това прогресивно намаля до ниското ниво от 9 dpi (Фигура 1C). В допълнение, ние събрахме цялата кръв от заразени с HTNV мишки на дни 0, 3, 6 и 9 след инфекцията, за да определим вирусната репликация в кръвта. Резултатите показват, че вирусното натоварване се увеличава с 3 dpi и след това намалява, което предполага вирусна репликация в кръвните клетки. Както е показано на допълнителна фигура 1, броят на вирусните копия при Nlrc3-/- мишки е по-висок от този при WT мишки (Nlrc3-/- мишки: 5752 ± 502 копия на ml; WT мишки: 3589 ± 869 копия на mL) при 3 dpi. Освен това, 2-кратно по-високи вирусни натоварвания са открити в далаците на Nlrc3−/− мишки (3033 ± 175 копия еквивалента на mg), отколкото WT мишки (1520 ± 425 копия на mg) при 6 dpi; същият модел се наблюдава в бъбреците при 9 dpi (Nlrc3-/- мишки: 500 ± 87 копия еквивалента на mg; WT мишки: 270 ± 40 копия на mg) (Фигура 1C). Като цяло, умерено по-високи вирусни натоварвания са открити при Nlrc3-/- мишки, отколкото WT мишки.

След това изследвахме нивата на HTNV нуклеопротеин (NP). Както е показано на фигури 2A, C, Nlrc3-/- мишките показват по-високи нива на вирусен антиген от WT мишките в далака и бъбрека. Статистически анализ на вирусни антигени в бъбрека и далака е показан съответно на фигури 2B, D. Ниски нива на вирусни антигени бяха открити в сърцето, черния дроб, белия дроб и мозъка на Nlrc3-/- мишки (допълнителна фигура 2). Нивата на вирусен NP протеин в сърцето, белия дроб и мозъка на Nlrc3−/− мишки са по-ниски от WT мишки на ниво протеин (допълнителни фигури 2B, F, H), но статистическата значимост е показана между сърцето и мозъка и на иРНК и протеинови нива (допълнителни фигури 2A, E, I). Това откритие предполага, че активният вирусен

репликация настъпва в кръвта, далака и бъбреците на Nlrc3−/− мишки след инфекция с HTNV. И накрая, използвахме имунофлуоресценция, за да открием нивата на експресия на HTNV NP в далака и бъбрека. Интензитетът на флуоресценция на HTNV NP FL е по-висок в бъбрецитебъбречнатубули (Фигура 2E) и червена пулпа на далака (Фигура 2F) на Nlrc3−/− мишки, отколкото WT мишки на 6 dpi и 9 dpi. Заедно тези резултати показват, че Nlrc3−/− мишките са по-податливи на интраперитонеална инфекция на HTNV.

Рутинни кръвни тестове на Nlrc3−/− мишки след инфекция с HTNV

Широко прието е, че патологията на HFRS е до голяма степен имуномедиирана, включително имунни комплекси, активиране на комплемента, Т-клетъчен отговор (24–26) и индуцирано от HTNV производство на цитокини (26, 27), причинявайки увреждане на множество органи. В допълнение, тромбоцитопенията е често срещана клинична характеристика при тези, заразени с вируси на вирусна хеморагична треска (VHF). По този начин, първо проведохме хематологичен тест, използвайки цяла кръв, събрана от Nlrc3-/- и WT мишки на 3, 6, 9 и 12 dpi. Резултатите показват, че броят на PLT при WT мишки намалява при 3dpi и след това постепенно се възстановява, но продължава да намалява при Nlrc3−/− мишки до достигане на най-ниската стойност при 9 dpi, значително по-ниска от тази при WT при 9 dpi (P<0.05) (figure="" 3a).="" the="" decrease="" of="" wbc="" counts="" was="" observed="" on="" 3="" dpi="" and="" then="" gradually="" recovered="" to="" normal="" levels="" in="" both="" mouse="" strains="" (figure="" 3b).="" to="" further="" dissect="" the="" subset="" changes="" in="" wbcs,="" we="" analyzed="" on="" 0,="" 3,="" 6="" dpi="" the="" number="" of="" monocytes,="" neutrophils,="" lymphocytes,="" and="" t="" cells="" by="" routine="" blood="" tests="" combined="" with="" fellow="" cytometry="" assay.="" the="" number="" of="">

се повишава значително при Nlrc3−/− мишки на 6 dpi, но не и при WT мишки (Фигура 3C). Неутрофилите и при двата вида мишки намаляват леко, но се възстановяват до средно ниво при 6 dpi (Фигура 3D). Броят на лимфоцитите намалява значително при 3 dpi, докато те започват да се покачват при WT мишки при 6 dpi, броят на лимфоцитите остава на ниско ниво при 6 dpi при Nlrc3-/- мишки (Фигура 3E). Съотношението на CD3 плюс CD4 плюс Т клетки спрямо CD3 плюс CD8 плюс Т клетки в периферната кръв беше определено чрез друга цитометрия и беше установено, че е повишено при 3 dpi и след това бързо обърнато при 6 dpi, в съответствие с промените, често наблюдавани при пациенти с HFRS (Фигура 3F), при които CD4 плюс Т клетки драматично намаляват, а CD8 плюс Т клетки остават непроменени или компенсаторно разширени, за да се получи обратно съотношение на CD4/CD8. Тези открития предполагат, че интраперитонеалното инокулиране на HTNV в Nlrc3−/− мишки до известна степен индуцира основните клинични характеристики на пациенти, заразени с HTNV, като тромбоцитопения и обърнато съотношение CD4/CD8 Т клетки.

Патологични промени в бъбрека на заразени Nlrc3−/− мишки показват изразен бъбречен интерстициален кръвоизлив и дилатация на бъбречните тубулиСлед това патологичните промени на инфектираните с HTNV мишки бяха оценени чрез H&E оцветяване и беше установено, че съществуват в бъбреците на всички заразени Nlrc3−/− мишки, проявяващи се като оток набъбречнатубулни епителни клетки. На 6 dpi се наблюдават хеморагични лезии вбъбречнамедула (Фигура 4А).Бъбречни тубулидилатацията се наблюдава рано при 3 dpi, нейната тежест достига пик при 9 dpi и продължава до 12 dpi и е по-изразена при Nlrc3-/- мишки, отколкото WT мишки (фигури 4B, C). Тези открития сочат

че острата нефропатия, характеризираща се сбъбречни тубулидилатация ибъбречен интерстициален кръвоизливсе индуцира в HTNV-инфектирани Nlrc3−/− мишки. Що се отнася до други патологични промени в черния дроб, далака, белия дроб, тези две групи мишки показват сходни резултати. Те включват главно екстрамедуларна хематопоеза в далака, удебеляване на алвеоларната стена в белия дроб и дегенерация на черния дроб (допълнителни фигури 3A-F). Въз основа на горното, патологичните особености, наблюдавани в бъбреците на Nlrc3-/- мишки по време на острата фаза на инфекцията с HTNV, много наподобяват клинично-патологичните промени в случаите на HFRS при хора.

Въз основа на това, ние допълнително изследвахме свързаните индекси на кръвта и урината при мишки за функционални нарушения на бъбреците. Миши серуми бяха събрани за оценка на аланин аминотрансфераза (ALT), креатин киназа MB фракция (CK-MB), урея, както и пикочна киселина (UA). Както е показано на фигура 4D, в сравнение с контролните WT мишки, нивото на серумния UA е значително повишено при 3 dpi при Nlrc3−/− мишки, серумният CK-MB е значително повишен при 9 dpi при Nlrc3−/− мишки, но серумните нива на ALT, UREA и CREA не са показали повишение (допълнителна таблица 1).

Бъбречнаучастието в HFRS, инфектиран с PUUV, включва преходна протеинурия, микроскопична, но рядко видима хематурия и олигурна AKI, последвана от полиурия и възстановяване. Характерна особеност на протеинурията при това заболяване е бързото й намаляване след острата фаза на заболяването (6). В голяма група пациенти с остър тубулоинтерстициален нефрит, причинен от различни етиологии, протеинурия е установена само при една четвърт от пациентите, докато само при 2 процента от всички пациенти е открита протеинурия от нефротичен диапазон (28). Събрахме урината на 0, 3, 6 dpi и открихме, че нивата на протеин в урината се повишават на 3 dpi, острата фаза на инфекцията. Концентрацията на протеин в урината беше значително увеличена и средната стойност беше близо до 0.3 g/L при 3 dpi при заразените Nlrc3−/− мишки и WT мишки (Фигура 4E).

За изследване на инфилтрираните възпалителни клеткибъбречнаинтерстициален след инфекция с HTNV, извършихме имунохистохимично (IHC) оцветяване с CD3, F4/80 и CD11b. Резултатите показват, че група имунни клетки, положителни за CD3, са проникнали вбъбречнаинтерстициален след инфекция с HTNV (Фигура 5А) и миелоидни клетки, положителни за CD11b, се появяват в кортикалния тубулоинтерстициален (Фигура 5В). Делът на инфилтриращи CD3 плюс Т клетки и CD11b плюс миелоидни клетки е значително по-висок при инфектирани Nlrc3-/- мишки, отколкото WT мишки, но макрофагите, положителни за F4/80, са разпределени в целия бъбречен кортекс и медула и не показват значими разлика между тези два типа мишки (Фигура 5C).

Инфекцията с HTNV индуцира силен цитокинов отговор при Nlrc3−/− мишки

Свръхпродукцията на възпалителни цитокини често се съобщава при субекти с HFRS и е довела до хипотезата, че цитокинова дисрегулация може да играе ключова роля в патогенезата на заболяването. Vaheri и др. (8) установиха, че множество цитокини се произвеждат от различни клетки, като макрофаги, моноцити и лимфоцити, в отговор на провъзпалителни сигнали като вирусна инфекция. Wang и др. съобщават, че серумните концентрации на TNF-a, IL-6, IFN-g, IL-8, IP-10 и RANTES (но не IL-4) са много повишени при пациенти със HFRS (29), в сравнение с контролите; и че най-високите концентрации обикновено се откриват по време на фебрилната, хипотензивната и олигуричната фаза, особено при тежки и критични случаи на HFRS. Високите плазмени нива на IL-6 са свързани с тежкибъбречнанеуспех и тромбоцитопения при PUUV-индуцирана HFRS и може да се използва като маркер за тежестта на заболяването.

Нашите резултати показват, че инфекцията с HTNV води до повишено производство на цитокини, включително CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a и IFN-g в Nlrc3−/− мишки и нивата на тези цитокини достигат пик при 6 или 9 dpi; за сравнение, WT мишките имат по-слаби цитокинови отговори по време на процеса на инфекция (Фигура 6).

В заключение, ние открихме в това проучване, че след интраперитонеална инокулация на HTNV, Nlrc3−/− мишки развиват загуба на тегло,бъбречен кръвоизливи дилатация на тубулите. Тези характеристики наподобяват клиничните симптоми на HFRS повече от всички други публикувани преди това животински модели. Освен това, мишките Nlrc3−/− също показват по-висок вирусен товар в серума, далака и бъбреците, отколкото мишките WT, а мишките Nlrc3−/− развиват хематологично разстройство и значителни патологични промени в множество органи, като по този начин установяват HTNV инфекция на Nlrc3−/ − мишки като нов модел за изследване на HFRS.

ДИСКУСИЯ

HFRS моделът на мишка, описан тук, демонстрира, че инфектираните с HTNV Nlrc3−/− мишки представляват подходящ малък животински модел, който може да се използва за оценка на HFRS ваксини и терапевтици. Моделът на мишка Nlrc3−/− наподобява системно увреждане, наблюдавано при хора, характеризиращо се с тромбоцитопения, лимфоцитопения, повишени серумни нива на AST (чернодробна дисфункция), LDH, креатин киназа MB фракция и UA(бъбречна дисфункция). Освен това, мишките Nlrc3−/− развиват загуба на тегло и очевиднабъбречен кръвоизлив. Вирусна репликация и хистопатологични промени в целевите органи бяха открити в белия дроб, далака, черния дроб и бъбреците. В допълнение, умерено по-високо ниво на натоварване на вирусна РНК беше открито в кръвта, далака и бъбреците на Nlrc3-/- мишки. За сравнение, WT мишките развиват леки хистологични промени въпреки откриването на вирусна РНК в кръвта, далака и бъбреците.

Our findings are generally in agreement with what would be expected for HTNV infection-induced HFRS and signify an improvement over previously published animal models. It has been reported that hemorrhagic fever (HF) virus infection in animal models can lead to a spectrum of diseases from asymptomatic to mild and severe and often transient viremia. A transient weight loss usually manifests mild illness, but severe disease showed more significant weight loss (>20 процента ) (30). Например, хамстери, заразени с HTNV по назален път, доведоха до персистираща асимптоматична инфекция, характеризираща се със спорадична виремия, но високи нива на копия на вирусен геном в белите дробове, мозъка и бъбреците. Поровете, заразени с висока доза HTNV чрез мускулна инжекция, показват постепенно намаляване на телесното тегло (5-12 процента с течение на времето), но непокътнатибъбречни функции, липса на виремия и липса на предаване на вируса към органите. При мармозетките интрамускулното инжектиране на HTNV води до висока степен на сероконверсия и производство на неутрализиращи антитела; последователно, тези животни нямат увреждане на бъбреците, виремия или предаване на вируса на органи (13).

Що се отнася до наблюдението, че хематологичните промени, наблюдавани само в един момент и промените в цитокините не са значими, смятаме, че те могат да се обяснят с естеството на HTNV инфекцията, която е подобна на много други вирусни инфекции, които засягат множество органи и следователно често трудно се откриват устойчиви промени на един параметър. Като цяло, нашите констатации като цяло са в съответствие със съществуващите познания в областта. Освен това откриването на Nlrc3−/− мишки, имащи по-голяма чувствителност към HTNV инфекция и показващи много промени, подобни на патологичните промени на HFRS, е нов принос в областта. Общоприето е, че човешките съдови ендотелни клетки са основните мишени за хантавирус , което води до различна степен на генерализирана капилярна дилатация и оток (31).

Вирусните антигени могат да бъдат открити в капилярния ендотел на различни тъкани (Хантавирусите насочват пропускливостта на ендотелните клетки чрез сенсибилизиране на клетките към фактора на васкуларната пропускливост VEGF, докато ангиопоетин 1 и сфингозин 1-фосфатът инхибират пропускливостта, насочена към хантавируса). Хистологичният анализ показа, че са наблюдавани бъбреците на Nlrc3−/− мишкибъбречни тубулидилатация при 9 dpi, Nlrc3-/- мишки с по-тежки патологични промени от WT мишки и са продължили на 12 dpi. При Nlrc3-/- мишки се наблюдава оток на бъбречни тубулни епителни клетки и забележителен бъбречен интерстициален кръвоизлив в бъбреците. Освен това, забележима екстрамедуларна хематопоеза в червената пулпа на далака се наблюдава при 6, 9 и 12 dpi, и разширения на зародишния център и увеличен брой многоядрени гигантски клетки при 12 dpi. Черният дроб също показва тежка хепатоцитна дегенерация и разпръсната некроза на дни 3, 6, 9 и 12 dpi. Белодробно възпаление и удебеляване на алвеоларната стена се наблюдават при 6 dpi. Това откритие предполага, че инфекцията с HTNV има значително и дългосрочно въздействие върху черния дроб и бъбреците при инфектирани с HTNV Nlrc3−/− мишки. В допълнение, Nlrc3-/- мишки показаха забележимидилатация на бъбречните тубули, интерстициален кръвоизлив и бъбречна дисфункция след инфекция с HTNV. Нивото на серумния UA беше значително повишено на 3 dpi, ясна индикация за бъбречна дисфункция. Концентрацията на протеин в урината беше значително повишена и средната стойност беше близо до 0.3 g/L при 3 dpi при заразените Nlrc3-/- мишки. Същата тенденция на увеличаване на UA не се наблюдава при WT мишки. Тези резултати предполагат, че нашият модел рекапитулира повече патологични характеристики на човешката HTNV инфекция.

N протеинът (NP) се произвежда изобилно в инфектирани с хантавирус клетки и може да бъде открит рано 4 часа след инфекцията (32). Тези характеристики обясняват основната причина, поради която крайната точка на ELISA е да се открие хантавирусен N протеин и имунофлуоресцентни анализи за оценка на броя на вирусните частици и прогресията на вирусната инфекция. Различните методи могат да повлияят на получените резултати и направените заключения. Вирусният протеин и виремията са два различни параметъра на вирусна инфекция и не винаги могат да се променят синхронно. Резултатите от количествената PCR в реално време показаха, че е настъпило преходно повишаване на нивата на NP при 6 dpi в далака, където вирусът може да е претърпял преходна репликация, последвана от неговото изчистване след това. Както се очаква, натрупването на вирусен протеин се наблюдава след пиковата виремия, която се появява на 3 dpi. Наистина, вирусната репликация в далака и бъбрека се поддържа на умерено ниво при 9 и 12 dpi, придружена от синтез на N протеин (далак при 9 dpi: WT мишки: 192 ± 128 копия на mg; Nlrc3−/− мишки: 431 ± ± 229 копия на mg; далак при 12 dpi: WT мишки: 160 ± 85 копия на mg; Nlrc3−/− мишки: 226 ± 118 копия на mg). Въпреки това, количеството на HTNV NP на ниво протеин достига максимума на ден 6 pi и остава повишено през 9 и 12 dpi. Разликата в кинетиката на вирусните РНК копия и количеството на протеина може да отразява техния диференциален разпад в различни органи.

Ролята на цитокините обикновено е по-сложна в моделите на заболяването. При PUUV-индуцирана HFRS, тежкабъбречна недостатъчности тромбоцитопенията са свързани с високи плазмени нива на IL-6 (33). Нашият анализ показа, че HTNV инфекцията води до повишено производство на цитокини, включително CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a и IFN-g в Nlrc3−/− мишки, но не толкова при WT мишки. Струва си да се отбележи, че при 9 dpi, Nlrc3-/- мишки показват забележителни патологични промени в далака и бъбреците, придружени от силен цитокинов отговор по това време. Тези констатации показват, че високото ниво на цитокини може да е свързано с патогенезата на заболяването.

В обобщение, резултатите, които докладваме тук, показват, че след инокулиране с HTNV по интраперитонеален път, Nlrc3−/− мишки развиват загуба на тегло, тромбоцитопения, rанална дисфункция и кръвоизлив.Те наподобяват повече клиничните симптоми на HFRS, отколкото всички други публикувани преди това животински модели. Този модел може да се използва за оценка на потенциални ваксини и терапевтици и задълбочено изследване на патогенезата на HFRS in vivo.