Нови ваксини, базирани на рекомбинантен вирус на нюкасълска болест, заобикалят майчиния имунитет, за да осигурят пълна защита от ранно вирулентно предизвикателство, част 1

Резюме:

Нюкасълската болест (ND) е една от икономически най-важните болести по домашните птици. Въпреки интензивните усилия с настоящите програми за ваксиниране, това заболяване все още се среща в световен мащаб, причинявайки значителна смъртност дори при ваксинираните стада. Това отчасти се дължи на пропуск в имунитета по време на периода след излюпването поради наличието на майчини антитела, които влияят отрицателно на репликацията на често използваните живи ваксини. Ваксините in ovo имат множество предимства и представляват възможност за справяне с този проблем.

Използваните понастоящем в ovo ND ваксините са рекомбинантен херпесвирус на пуйки (HVT)-векторни ваксини, експресиращи антигени на вируса на нюкасълската болест (NDV). Въпреки че са доказано ефективни, тези ваксини имат някои ограничения, като забавена имуногенност и невъзможност за прилагане на втора HVT ваксина след излюпването. Използването на живи ND ваксини за in-ovo ваксинация понастоящем не е приложимо, тъй като те са свързани с висока ембрионална смъртност. В това проучване, рекомбинантни NDV-векторни експериментални ваксини, съдържащи антисенс последователност на птичи интерлевкин 4 (IL4R) и техните гръбнаци, бяха приложени in ovo в различни дози в 18-дневни търговски яйца, притежаващи високи титри на майчини антитела. Излюпените птици бяха заразени с вирулентен NDV на 2-седмична възраст. Отделянето на ваксина след излюпване, преживяемостта след предизвикване, отделянето на вируса на заразяване и хуморалните имунни отговори бяха оценени в множество времеви точки. Ваксинираните с рекомбинантен NDV (rNDV) птици имат значително намалена смъртност след излюпване в сравнение с дивия тип LaSota ваксина.

Всички rNDV ваксини успяха да проникнат в майчиния имунитет и да индуцират силен ранен хуморален имунен отговор. Освен това, rNDV ваксините предпазват от клинично заболяване и значително намаляват отделянето на вирус след ранно вирулентно заразяване с NDV две седмици след излюпването. Титрите на антителата за инхибиране на хемаглутинация след предизвикване във ваксинираните групи остават сравними с титрите преди предизвикване, което предполага капацитета на изследваните ваксини да предотвратят ефективна репликация на заразения вирус. Преживяемостта след излюпване след ваксинация с rNDV-IL4R ваксините зависи от дозата, с увеличаване на преживяемостта с намаляване на дозата. Тази подобрена преживяемост и данните за зависимостта от дозата предполагат, че новите атенюирани in ovo rNDV ваксини, които могат да проникнат в майчиния имунитет, за да предизвикат силен имунен отговор още 14 дни след излюпването, което води до висока или пълна защита от вирулентно предизвикателство, показват обещание като принос за контрола на нюкасълската болест.

В допълнение към ваксинирането на хора, хората могат също да приемат храна и добавки. Cistanche съдържа различни химични вещества, като полизахариди, стероиди, алкалоиди, флавоноиди и др. Тези вещества имат важна роля в регулирането на имунната система. Сред тях полизахаридите могат да насърчат активирането и пролиферацията на имунните клетки и да повишат имунитета на организма; стероидите могат да регулират функцията на имунните клетки и да засилят имунния отговор; алкалоидите и флавоноидите могат да устоят на окисляването, да действат противовъзпалително, антибактериално и допълнително да засилят имунитета. Следователно Cistanche има значителен имунорегулиращ ефект и може да се използва като здравословна храна и лекарство за подобряване на имунитета.

Кликнете върху ползите за здравето от цистанче

1. Въведение

Нюкасълска болест (ND), опустошителна болест по домашните птици, която може да достигне 100 процента смъртност при нелекувани птици, се причинява от вирулентни щамове на вируса на Нюкасълската болест (NDV) [1]. Този вид вирус, наскоро преименуван на птичи ортоавулавирус 1, е член на семейството Paramyxoviridae [2,3]. Вирусите на нюкасълската болест имат едноверижен, несегментиран, отрицателно-чувствителен РНК геном, кодиращ най-малко шест структурни протеина (30—нуклеопротеин [NP]—фосфопротеин [P]—матричен протеин [M]—слят протеин [F]— хемаглутинин-невраминидаза [HN]—и голяма РНК-полимераза [L]—50) и включващ един от трите размера на генома (15 186, 15 192 и 15 198 нуклеотида) [4,5]. Нюкасълската болест се счита за третата най-важна болест по домашните птици в света [6] и остава ендемична в много страни в Азия, Африка и Америка [7].

Контролът на ND включва строга биосигурност за предотвратяване на въвеждането на вирулентен NDV (vNDV) в птицеферми [8,9] и правилно прилагане на ваксини [10]. Въпреки това множеството огнища на ND, възникващи в световен мащаб [11], показват, че настоящите ваксини и процедури за ваксиниране не са напълно ефикасни. В допълнение към конвенционалните живи и инактивирани ваксини, през последните две десетилетия бяха проучени множество концепции за ваксинация срещу ND, включително векторни ваксини, комплекс антиген-антитяло, вирусоподобни частици и ваксини с лиганд на подобен на таксата рецептор [1, 8,9]. Няколко птичи ваксини, създадени да коекспресират имуностимулиращи цитокини, също се предполага, че подобряват защитния имунитет [12]. Друг подход, който е изследван, е използването на антигенно съвпадащи ваксини. Въпреки че всички NDVs се считат за членове на един серотип [3,13], съществуват антигенни вариации между щамовете [14]. Предишни проучвания с пилета на различна възраст показаха, че пилета, ваксинирани с щамове, които са антигенно съвпадащи с вируса на предизвикване, отделят значително по-малко количество vNDV, отколкото количеството, екскретирано от пилета, ваксинирани с хетероложни ваксини [15–17]. Трябва да се отбележи, че пасивно прехвърлените майчини анти-NDV антитела, въпреки че защитават пилетата през критичните ранни седмици от живота, пречат на развитието на имунитета на гостоприемника след ваксинация [18].

Ваксинацията in ovo е подход, който осигурява множество предимства – например значително намаляване на разходите, стандартизация, масово прилагане на ваксина, автоматизирана ваксинация в люпилнята, равномерно доставяне на ваксината във всяко яйце и липса на стрес за птиците [19–21]— и е привлекателен метод за имунизация за птицевъдната индустрия [22]. Между 80 процента и 90 процента от пилетата-бройлери, отглеждани в САЩ, понастоящем са ово-ваксинирани два до три дни преди излюпването [23,24], а автоматизацията на процеса позволява до 70000 яйца за да бъдат ваксинирани на час [23].

В световен мащаб този метод на прилагане на ваксина се използва в 26 от 30-те водещи страни в света за производство на птици [23]. Понастоящем са налични няколко in-ovo ваксини срещу ND, но всички те са генерирани с помощта на не-NDV вектори. Доказано е, че ваксините, базирани на вектор на вируса на шарка по птиците (FPV), експресиращи NDV F и HN протеините, приложени in ovo, предпазват домашните птици от заразяване с vNDV [25,26].

Рекомбинантните FPV-ND ваксини обаче не се използват широко поради имунна интерференция от предишни FPV ваксинации или експозиции (FPV обикновено присъства в околната среда) и липса на оптимизация за прилагане чрез масови методи [9]. Най-широко използваният вектор за производство на рекомбинантна ND in ovo ваксина е Meleagrid alphaherpesvirus 1, известен като херпесен вирус на пуйки (HVT) или вирус на болестта на Марек от серотип 3 [12,23]. Само в САЩ през 2018 г. са произведени 8,2 милиарда дози рекомбинантни HVT (rHVT)-ND ваксини в сравнение с 3,6 милиарда дози от конвенционалните ваксини срещу ND [27].

В допълнение към предимството да се използват in ovo, rHVT ваксините, експресиращи NDV протеини, предизвикват силен и дългосрочен имунитет след еднократно приложение [28]. Освен това, те са временно повлияни от наличието на анти-NDV майчини антитела [8]. Въпреки това ваксините rHVT-ND имат някои ограничения, като например забавен имунитет, и предишна ваксинация срещу HVT изглежда е неподатлива на използването на бустер ваксини срещу HVT при същите птици [9,29]. HV ваксините са клетъчно свързани и се изисква да се съхраняват и транспортират в течен азот, което е ограничение за употребата им в много страни.

Перспективата за нови in ovo ваксини нараства [23]. Изследвани са различни вектори за in-ovo пътя на приложение и са докладвани обещаващи резултати с нереплициращи човешки аденовирус- [30] и алфавирус-векторни ваксини [31]. Въпреки че не е имало напредък в рутинната търговска употреба, бяха положени усилия за разработването на нови in ovo не-HVT NDV-векторни ваксини [32–35]. Използването на живи ND ваксини in ovo е предизвикателство. Докато живите ND ваксини, като LaSota, B1, Clone 30 и Ulster, за да назовем само няколко, придават силен имунен отговор и обикновено се използват за ваксиниране на пилета на възраст от един ден, те се свързват с висока ембрионална смъртност, когато приложен на 18 дни от зараждането на ембриона. Смъртност до 100 процента при използване на див тип нисковирулентни вируси и 80 процента при използване на генетично атенюирани живи вируси е докладвана след употреба in-ovo и в момента не се използват живи ND ваксини за този метод на приложение на ваксина [36,37] .

Нова рекомбинантна NDV (rNDV)-векторна експериментална ваксина, съдържаща антисенс птичи интерлевкин 4 вложки (IL4), наречена ZJ1*l-IL4R, наскоро беше показано като обещаващ in ovo кандидат за ваксина след оценка в свободен от специфични патогени (SPF) ) ембрионални кокоши яйца (ECE) [38]. Това проучване имаше за цел да оцени допълнително приложимостта на тази рекомбинантна векторна ваксина с NDV и нейния рекомбинантен гръбнак (атенюирано място на разцепване от див тип вирус) и рекомбинантен LaSota-IL4R вирус за in-ovo ваксинация на 18-дневна възраст търговски яйца с високи титри на майчини антитела. Наличните в търговската мрежа ваксини LaSota и rHVT-ND бяха включени като контроли. В допълнение, това проучване имаше за цел да оцени защитната ефикасност на изследваните ваксини срещу ранни предизвикателства с vNDV. Тук е демонстрирана способността на тези рекомбинантни ваксини ефективно да преодолеят майчиния имунитет, дори в ниски дози, и да предизвикат силен имунен отговор. Експерименталните rNDV ваксини показаха 100 процента защита след ранни предизвикателства с vNDV.

2. Материали и методи

2.1. Вируси

Вирулентната гъска/Китай/ZJ1/2000 (ZJ1, GenBank номер за достъп AF431744) NDV, член на подгенотип VII.1.1 (бивш VIId), беше използван като провокационен вирус в това изследване. Рекомбинантен ZJ1 вирус (атенюирана версия на ZJ1) с ниско вирулентно място на разцепване (ZJ1*L), който преди това беше генериран в нашата лаборатория чрез обратна генетика [39], беше използван като основа за създаване на рекомбинантни ZJ1*L ваксини и като ваксина вирус. Ниско вирулентният ваксинален щам LaSota (LS) беше използван като контрола на ваксината и като гръбнак за генериране на рекомбинантна ваксина LS-IL4R. Всички вируси са получени от хранилището на Югоизточната лаборатория за изследване на птиците (SEPRL) на Националния изследователски център за домашни птици на Съединените щати (USNPRC), Министерство на земеделието на САЩ (USDA). Освен това, налична в търговската мрежа rHVT-ND ваксина (вмъкване на слят ген) също беше използвана като контрола.

Рекомбинантните NDV експериментални ваксини, използвани в това проучване, са създадени с помощта на обратна генетика, както е описано по-рано [38,39]. Накратко, кодиращата последователност на птичи IL4 беше клонирана в гръбнака на ZJ1*L и LS в обратната ориентация (IL4R) между P и M гените, генерирайки два рекомбинантни атенюирани живи вируса — а именно ZJ1*L-IL4R и LS- IL4R (GenBank номера за достъп MM680659 и MM680665, съответно). Рекомбинантните вируси бяха спасени с помощта на модифицирания вирус на ваксиния Ankara, експресиращ Т7 полимераза (MVA/T7), следвайки предварително публикувани протоколи [38–41]. Схематично представяне на конструкциите е предоставено на допълнителна фигура S1A. За целите на тази работа терминът "DV ваксини", използван по-долу, се отнася до ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R и LS-IL4R.

Работните запаси от всички NDV бяха размножени в {{0}} до 11-дневни SPF ембрионални кокоши яйца (ECE) [42]. Вирусните суровини, използвани за инокулиране на яйца в това проучване, бяха разредени в мозъчно-сърдечна инфузия (BHI) бульон (BD Biosciences, MD, САЩ), съдържащ 200 µg/mL гентамицин, 2{{22} }00 U/mL пеницилин и 4 µg/mL амфотерицин B, до три различни целеви титъра, 105,5/0,1 mL, 104,5/0,1 mL и 103,5/0,1 mL ембрионална инфекциозна доза (EID50), с изключение на LS , който се разрежда до 105.5/0.1 mL и 104.5/0.1 mL EID50. Титрите на разредените работни запаси на живите ваксини бяха потвърдени чрез обратно титруване в SPF ECE на възраст 9- до 11- дни, следвайки стандартните процедури, както е посочено по-горе. Ваксината rHVT-ND беше директно разредена с помощта на захароза фосфат глутамат албумин разредител за rHVT ваксини, описан в протокола за изпитване на Центъра за ветеринарни биологични продукти на USDA [43].

2.2. яйца

Двеста шестдесет и две търговски (без SPF) яйца от стадо носачки от породата Hy-Line Rockside W-36 (Mansfield, GA, USA) бяха любезно дарени за този експеримент. Стадото носачки е било рутинно ваксинирано с ваксината LaSota. Имунитетът на стадото е редовно тестван чрез ELISA и въпреки че тези резултати не могат да се преведат директно в титри на инхибиране на хемаглутинацията (HI), средните нива на анти-NDV антитела на родителското стадо са много високи (т.е. 15 534 с граница за положителни проби от 1159). Източникът на SPF ECE (42 яйца) беше стадото SEPRL SPF White Leghorn. Всички яйца се инкубират при температура 37,5 ◦C и 55–60 процента относителна влажност в продължение на 18 дни.

2.3. Ваксинация

Търговските (n {{{{10}}}) и SPF (n=42) яйца, на 18 дни ембриони (DOE), бяха разделени на 14 групи с 21 яйца във всяка група (с изключение на контролните групи BHI и Hatch, които имаха по 26 яйца). С помощта на 1 mL, 24 G × 1/2 спринцовки, всяко яйце беше инокулирано в алантоисната кухина с 0.1 mL разредена ваксина или BHI, с изключение на контролната група на Hatch, в която яйцата не бяха манипулирани при всичко. Имаше тринадесет групи инокулирани яйца, разделени на седем експериментални и шест контролни групи. Седемте експериментални групи бяха както следва: ZJ1*L-IL4R 104.5, ZJ1*L-IL4R 105.5, LS-IL4R 103.5, LS-IL4R 104.5, LS-IL4R 105.5, ZJ1*L 104.5 и ZJ1*L 105.5, всяка получаваща съответната EID50 доза инокулум за 0,1 mL, както е посочено в името на групата. Освен това бяха създадени шест контролни групи. Две контролни групи търговски яйца бяха инокулирани, както е описано по-горе, съответно с BHI и rHVT-ND. Две контролни групи търговски яйца бяха инокулирани, както е описано по-горе, с LS 104.5 и LS 105.5 EID50 доза инокулум на 0.1 mL. Две контролни групи SPF яйца бяха инокулирани с ZJ1*L 103.5 и ZJ1*L-IL4R 103.5. Схематично представяне на дизайна на изследването е предоставено на допълнителна фигура S1B, C.

След инокулацията, яйцата бяха поставени в Turbofan Hova-Bator инкубатори (GQF Manufacturing Company Inc., GA, САЩ), които впоследствие бяха поставени в изолатори в съоръжение за биосигурност на животните ниво 2 (ABSL-2). Инкубаторите бяха регулирани с термостати за поддържане на постоянна температура от 37,5 ◦C и относителна влажност между 55 процента и 60 процента.

2.4. Излюпване, вземане на проби, смъртност

След излюпване при 21 DOE, пилетата бяха настанени в изолатори с отрицателно налягане (ABSL-2) и им беше осигурен достъп до храна и вода ad libitum. Пет не-SPF пилета както от Hatch контролната, така и от BHI групите бяха умъртвени и обезкървени веднага след излюпването, за да се установи базовият титър на майчините анти-NDV HI антитела. Всички пилета бяха претеглени на 1, 8 и 13 дни след излюпването (DPH). Орофарингеални и клоакални тампони бяха събрани в BHI от всяка птица при 2 и 4 DPH. Клиничните признаци и смъртността се записват два пъти дневно през периода след излюпването и кръвните проби се събират при 13 DPH.

2.5. Предизвикателство

Дванадесет птици от всяка група (с изключение на LS 1{{10}}5.5, в която всички птици умряха до 6 DPH) бяха прехвърлени в съоръжението ABSL-3E при 13 DPH. Птиците се поставят в изолатори с отрицателно налягане и се оставят да се аклиматизират за 24 часа преди заразяването. Всички птици бяха провокирани при 14 DPH с вирулентен ZJ1 NDV при 106 EID50/0.1 mL по окуло-назален път. Птиците се наблюдават ежедневно за клинични признаци и смъртност. Орофарингеални и клоакални тампони бяха събрани от всяка птица на 2 и 4 дни след предизвикване (DPC). Всички оцелели птици бяха претеглени и обезкървени при 14 DPC и бяха евтаназирани чрез цервикална дислокация след анестезия с 0,2 mL разтвор на кетамин/ксилазин (66 mg/mL кетамин и 6,6 mg/mL ксилазин), приложен интрамускулно с 25-калибровна игла.

2.6. RT-PCR в реално време

РНК се екстрахира от всички среди за тампони с помощта на комплекта за изолиране на вирусна РНК MagMAX 96 AI/ND (Ambion, Inc. Austin, TX, USA) с процесор за магнитни частици KingFisher (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), следвайки инструкциите на производителя , с модификация за отстраняване на инхибитора, описана от Das et al. [44]. Количествена RT-PCR в реално време (rRT-PCR) за откриване на NDV, насочена към матрицата (M) ген, беше извършена с помощта на AgPath-ID едноетапен RT-PCR комплект (Ambion) и ABI 750{{31 }} Бърза PCR система в реално време (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA), използваща праймери и сонда, описани по-рано от Wise et al. [45]. Условията на анализа са обратна транскрипция за 10 min при 45 ◦C; начална денатурация за 10 min при 95 ◦C; 40 цикъла на денатурация за 10 секунди при 94 ◦C, отгряване на праймера за 30 секунди при 56 ◦C и удължаване на праймера за 10 секунди при 72 ◦C. Общият реакционен обем от 25 µL за всяка проба се състоеше от вода с молекулен клас - 2,5 µL; 2X буфер—12.5 µL; преден праймер—0.25 µL (20 pmol/µL); обратен праймер—0.25 µL (20 pmol/µL); сонда—0.50 µL (6pmol/µL); 25X ензимна смес—1.0 µL; и РНК шаблон - 8.0 µL. За количествено определяне на вируса беше установена стандартна крива за всеки вирус, с РНК, извлечена от същия титриран запас от вируси, използвани за инокулиране на яйцата (за пробите от тампони, събрани след излюпването) или вируса за предизвикване (за пробите от тампони, събрани след това -предизвикателство).

Резултатите се отчитат като EID50/mL. Изчислената долна граница на откриване на анализите беше между 101,7 и 101,9 EID50/mL. Важно е да се отбележи, че rRTPCR открива вирусни нуклеинови киселини и че изчислените стойности не представляват непременно инфекциозни вируси. Стойностите на EID50/mL нямат за цел да представят инфекциозност и се използват за осигуряване на средства за относително сравнение на отделянето на вируси между групите. Въпреки използването на протокол за екстракция на нуклеинови киселини за отстраняване на инхибитора, големият обем на РНК шаблон може да е повлиял на изчисленията от стандартната крива. Трябва да се отбележи, че едно и също количество РНК матрица е използвано във всички реакции и потенциалните остатъчни инхибитори биха повлияли еднакво на всички резултати.

2.7. HI анализ

Тестът за инхибиране на хемаглутинацията (HI) беше използван за оценка на присъствието и титрите на антитела в серумните проби, събрани по време на експеримента. Следвайки стандартните процедури [46], вирусът, използван като гръбнак за всяка ваксина, беше използван като антиген за всяка съответна група серуми (ZJ1*L за всички ZJ1 групи и LS за всички LS групи). За серумните проби, събрани след предизвикване, вирулентният ZJ1 вирус беше използван като антиген в HI анализа. Титрите бяха изчислени като реципрочна стойност на последното HI-положително серумно разреждане и проби с HI титри от log2 3 и по-ниски се считаха за отрицателни.

2.8. Статистически анализи

Софтуерът Prism v.7.03 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) беше използван за анализ на данните и отклоненията бяха идентифицирани с помощта на теста ROUT. Тестът за нормалност на D'Agostino-Pearson беше извършен, за да се оцени дали стойностите във всяка група идват от разпределение на Гаус. Въз основа на разпределението на нормалността, непараметричният тест на Крускал-Уолис с посттеста на Дън беше използван за множество сравнения между групите. За статистически цели всички проби от тампони, от които не са открити вируси, получиха числена стойност от 1 log под границата на откриване за всеки вирус. Кривите на оцеляване бяха анализирани с помощта на Log-rank (Mantel-Cox) тест. Статистическата значимост беше определена на р-стойност <0,05.

3. Резултати

3.1. Излюпваемост, преживяемост след излюпване и телесно тегло

Преживяемостта след излюпване за всички групи, излюпени от търговски яйца, е изобразена като криви на оцеляване на Фигура 1 (разделени на Фигури 1A и B за яснота и за избягване на претоварване на графиките). Комбинирана графика е налична в допълнителна фигура S2. Контролната група Hatch (неинокулирана) беше включена в дизайна, за да се гарантира, че няма необичайна люпимост или смъртност след излюпване, които не са свързани с инокулацията на яйцата.

Както се очакваше, много ниска (rHVT-ND) до никаква (Hatch и BHI) смъртност след излюпване се наблюдава в три от контролните групи. За разлика от това, контролните групи с LS са имали 57,1% и 0% преживяемост, когато са използвани съответно дози от 104,5 и 105,5, което преди това е докладвано за конвенционалните ND живи ваксини. Две яйца не се излюпиха в групата LS-IL4R 105.5 и едно яйце не се излюпи в групата LS 104.5. Променлива смъртност се наблюдава в другите групи в зависимост от ваксината и дозата на инокулация. Групите ZJ1*L-IL4R 104.5 и 105.5 имаха съответно 90.5% и 71.4% преживяемост, а преживяемостта, регистрирана в групите ZJ1*L 104.5 и 105.5, беше съответно 80.9% и 76.2% (Фигура 1А), но разликите бяха не е статистически значимо. Преживяемостта в групата с LS-IL4R 103,5 е 95,2 процента. Степента на преживяемост, наблюдавана в групите с LS-IL4R 104,5 и 105,5, е съответно 85,7 процента и 66,7 процента (Фигура 1B).

Няма значителни разлики в преживяемостта между експерименталните групи с ваксина ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R и LS-IL4R и контролните групи на Hatch, BHI и rHVT-ND, но процентът на преживяемост в тези контролни групи е числено по-висок , с наблюдавана отрицателна корелация между дозата на ваксината и преживяемостта след излюпване (оцеляването нараства с намаляване на дозата на ваксината). Контролната група LS 1{{10}}5.5 има значителни разлики в преживяемостта в сравнение с експерименталните групи (p стойности между 0.0001 и 0,02). Контролната група LS 104.5, въпреки че не се различава статистически, има значително по-ниски нива на преживяемост в сравнение с експерименталните групи със същата доза. Двете LS контролни групи имат значителни разлики в преживяемостта в сравнение с контролните групи Hatch, BHI и rHVT-ND (p стойности между 0,0001 и 0,04). Клинични признаци не са наблюдавани в нито една от групите след излюпването. В групите, в които е налице смъртност след излюпване, птиците са намерени мъртви при ежедневни проверки.

Всички птици бяха претеглени на ден 1, 8 и 13 след излюпването (Таблица 1). При 1 DPH средното телесно тегло на птица в повечето групи е между 38,5 и 42,6 грама (g). Имаше значителни разлики в телесното тегло само между групите rHVT-ND и ZJ1*L-IL4R 104,5 от едната страна и ZJ1*L 104,5 и контрола LS 1{{4{{42} }}}4,5 от друга (птиците в първите две групи тежаха повече от птиците в контролната група) (p стойности между 0.0001 и 0,017, съответно). При 8 DPH, двете ZJ1*L групи и LS-IL4R 104.5, LS-IL4R 105.5 групата и контролната LS група (средно тегло 50–63 g) имат телесно тегло значително по-ниско в сравнение с птиците от Hatch, BHI и rHVT-ND контролни групи (средно тегло 77–82 g) (p стойности между 0,0001 и 0,03). Същите групи, които са значително различни от контролите при 8 DPH (с изключение на LS-IL4R 104,5), имат значително по-ниско телесно тегло от контролните групи Hatch, BHI и rHVT-ND също при 13 DPH (р стойности между 0,0001 и 0,01). Птиците от инокулирани SPF контролни групи не бяха включени в това сравнение, тъй като SPF яйцата (и птиците, излюпени от тях) традиционно са по-малки и по-леки от търговските яйца.

Фигура 1. Преживяемост на пилета след излюпване след инокулиране на търговски яйца на 18 дни от ембриона с експериментални in ovo NDV ваксини. Яйцата Hy-Line Rockside W-36 бяха инокулирани с рекомбинантни вируси и LaSota. Три контролни групи са инокулирани с BHI или rHVT-ND ваксина или не са инокулирани (контролна група на Hatch). Птиците бяха наблюдавани в продължение на 13 дни след излюпването. Кривите на оцеляване са представени на две фигури: (A) контролни групи и ZJ1*L групи и (B) контролни групи и LS-IL4R групи. Различните горни букви показват статистически значими разлики между групите (p-стойност < 0.05). Групови съкращения: HATCH—яйцата не са инокулирани; BHI—яйца, инокулирани с BHI; rHVT-ND—яйца, инокулирани с рекомбинантна HVT ваксина; ZJ1*L—яйца, инокулирани с рекомбинантен ZJ1*L вирус, чието място на разцепване е модифицирано, за да бъде с ниска вирулентност; ZJ1*L-IL4R—яйца, инокулирани с рекомбинантен ниско вирулентен ZJ1*L с интерлевкин-4 ген, вмъкнат в обратна ориентация; LS—яйца, инокулирани с щам LaSota; LS-IL4R — яйца, инокулирани с рекомбинантния вирус LaSota с гена на интерлевкин-4, вмъкнат в обратна ориентация. Вирусната доза, която са получили яйцата във всяка група, е представена като число след името на групата в EID50/на яйце.

Таблица 1. Средни тегла (и стандартни отклонения) на пилета на 1, 8 и 13 дни след излюпване след инокулация на търговски яйца на 18 дни от ембриона с експериментални in ovo ваксини и 14 дни след предизвикване с вирулентна нюкасълска болест вирус.

3.2. Отделяне на ваксинални вируси след ваксинация, както е демонстрирано чрез rRT-PCR

При 2 DPH не е имало значителни разлики в отделянето на вируси сред ваксинираните групи. (Фигура 2А). По същия начин, при 4 DPH, разликите между групите не са статистически значими. (Фигура 2B). Не е открито отделяне на вируси в нито една от контролните птици Hatch и BHI.

Фигура 2. Средно отделяне на ваксина след излюпване от пилета, излюпени от търговски яйца, инокулирани на 18 дни от ембриона с експериментални in ovo ваксини. Всяка точка от данни представлява една птица и NDV титри, открити в орофарингеални (OP) и клоакални (CL) тампони в различни дни след излюпването (DPH). Отделянето е представено отделно за 2 дни след излюпване (A) и 4 дни след излюпване (B). Стълбчетата представляват стандартните отклонения на средната стойност. На всички тампони, от които вирусът не е открит, е дадена цифрова стойност от 1 log под границата на откриване за всеки от съответните вируси. Границата на откриване на rRT-PCR е представена като хоризонтална пунктирана линия (използва се най-ниската граница). Групови съкращения: HATCH—яйцата не са инокулирани; BHI—яйца, инокулирани с BHI; rHVT-ND—яйца, инокулирани с рекомбинантна HVT ваксина; ZJ1*L—яйца, инокулирани с рекомбинантен ZJ1*L вирус, чието място на разцепване е модифицирано, за да бъде с ниска вирулентност; ZJ1*L-IL4R—яйца, инокулирани с рекомбинантен ниско вирулентен ZJ1*L с интерлевкин-4 ген, вмъкнат в обратна ориентация; LS—яйца, инокулирани с щам LaSota; LS-IL4R — яйца, инокулирани с рекомбинантния вирус LaSota с гена на интерлевкин -4, вмъкнат в обратна ориентация. Вирусната доза, която са получили яйцата във всяка група, е представена като число след името на групата в EID50/на яйце.

3.3. Хуморален имунен отговор след излюпване

Анализът на серумни проби, събрани при 13 DPH (запълнени с диагонални ленти ленти) чрез HI анализ (откриване на хемаглутинационни антитела срещу NDV) е изобразен на Фигура 3. За да се установи титърът на пасивно прехвърлените анти-NDV майчини HI антитела в търговските яйца, десет пилетата са обезкървени веднага след излюпването (0 DPH). HI титрите при излюпване варират между log2 5 и log2 8, със средно log2 7.17 (Фигура 3, пунктирана хоризонтална червена линия). Антителата при 13 DPH в групите Hatch, BHI и rHVT-ND (средно от log2 4.7) са остатъчни майчини антитела, тъй като тези групи или не са ваксинирани, или са ваксинирани с rHVT-ND ваксина, което прави не индуцират HI антитела срещу NDV. Титрите на антителата в групите ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R и LS 104.5 бяха значително по-високи в сравнение с контролните групи Hatch, BHI и rHVT-ND. Не са наблюдавани значими разлики между различните дозови групи на ваксините с една и съща основа. Групите LS-IL4R имат по-ниски HI титри след ваксинация в сравнение с групите ZJ1*L-IL4R и ZJ1*L, въпреки че тези разлики не са статистически значими. Трябва да се отбележи, че макар числено малко по-високи, HI титрите след ваксинация на птиците във всички LS-IL4R групи не се различават значително от титрите, измерени при контролните неваксинирани птици.

Фигура 3. Титри на HI антитела преди и след предизвикване (и стандартно отклонение) от пилета, излюпени от търговски яйца, инокулирани на 18 дни от ембриона с експериментални in ovo ваксини и ранно заразяване с вирулентен вирус на Нюкясълска болест на 14 дни след излюпването. Запълнените с диагонални ивици ленти представляват титрите преди провокиране 13 дни след излюпването. Плътниците с плътен пълнеж представляват титрите след предизвикване на 14 дни след предизвикването. Статистически значимите разлики между различните групи са представени с малки букви над всяка група (p-стойност<0.05). The level of maternal antibodies on the day of hatch (0 DPH) is presented as a horizontal dotted line. Group abbreviations: HATCH—eggs not inoculated; BHI—eggs inoculated with BHI; rHVT-ND—eggs inoculated with recombinant HVT vaccine; ZJ1*L—eggs inoculated with the recombinant ZJ1*L virus whose cleavage site was modified to be of low virulence; ZJ1*L-IL4R—eggs inoculated with the recombinant low virulent ZJ1*L with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation; LS—eggs inoculated with the LaSota strain; LS-IL4R—eggs inoculated with the recombinant LaSota virus with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation. The virus dose that the eggs in each group received is represented as a number after the group name in EID50/per egg.

3.4. Клинични признаци и преживяемост след ранно заразяване с CDV

В контролните групи, първите наблюдавани клинични признаци са в групите Hatch и BHI при 3 DPC. Три птици в групата Hatch и една птица в групата BHI са имали затруднено дишане. При 4 DPC се наблюдават разрошени пера и треперене на главата в BHI и групите за излюпване, а при 5 DPC в групата rHVT-ND; в последната група атаксия и тежък тортиколис също са регистрирани при две птици. Птиците в контролната група на Hatch показват летаргия при 5 DPC, а две птици в BHI групата показват парализа. Летаргия и парализа се наблюдават в групата rHVT-ND при 6 и 7 DPC. Опистотоноз, тортиколис и затруднено дишане са наблюдавани в контролните групи Hatch и BHI, започвайки от 9 DPC. В групата с rHVT-ND, тортиколис се наблюдава още на 5 DPC, затрудненото дишане и атаксията започват на 6 DPC, а опистотоносът започва на 13 DPC. До 14 DPC всички птици с изключение на две Hatch, една BHI и две rHVT-ND птици (съответно 83,3%, 91,6% и 83,3% заболеваемост) или умряха, или развиха предимно неврологични клинични признаци като атаксия, опистотонус, тортиколис, тремор , и парализира. Птици, които показват тежки клинични признаци, спират да ядат или пият или остават в легнало положение, са евтаназирани и докладвани като мъртви на следващия ден за изчисляване на времето за оцеляване. Не са наблюдавани клинични признаци в нито една от групите ZJ1*L и ZJ1*L-IL4R. Леки клинични признаци на опистотонос или тортиколис са наблюдавани при една птица (8,4 процента заболеваемост) във всяка от групите LS-IL4R и групата LS 104.5 при 14 DPC.

Преживяемостта след заразяване с вирулентния ZJ1 NDV е изобразена като криви на оцеляване на Фигура 4. Докато всички групи, инокулирани с рекомбинантни ваксини и LS, показват 100 процента преживяемост, птиците в групите Hatch, BHI и rHVT-ND имат 58,3 процента, 58,3 процента и 66,6 процента преживяемост, съответно. Преживяемостта след провокация в контролните групи Hatch и BHI е значително по-ниска в сравнение с групите с експериментална ваксина. Трябва да се отбележи, че въпреки че телесното тегло на птиците в инокулираните групи варира след излюпването в сравнение с контролите Hatch, BHI и rHVT-ND, всички птици, ваксинирани с rNDV (282–328 g), надвишават телесното тегло на неваксинираните контролни птици след предизвикване (255–266 g) (Таблица 1). Въпреки това не се наблюдава значителна разлика в телесното тегло между нито една от изследваните групи.

Фигура 4. Преживяемост на пилета след инокулация на търговски яйца на 18-ия ден от раждането на ембриона с експериментални in ovo ваксини и ранно заразяване с вирулентен вирус на Нюкасълска болест на 14-ия ден след излюпването. Птиците бяха наблюдавани в продължение на 14 дни след заразяването. Различните горни букви показват статистически значими разлики между групите (p-стойност < 0.05). Групови съкращения: HATCH—яйцата не са инокулирани; BHI—яйца, инокулирани с BHI; rHVT-ND—яйца, инокулирани с рекомбинантна HVT ваксина; ZJ1*L—яйца, инокулирани с рекомбинантен ZJ1*L вирус, чието място на разцепване е модифицирано, за да бъде с ниска вирулентност; ZJ1*L-IL4R—яйца, инокулирани с рекомбинантен ниско вирулентен ZJ1*L с интерлевкин-4 ген, вмъкнат в обратна ориентация; LS—яйца, инокулирани с щам LaSota; LS-IL4R — яйца, инокулирани с рекомбинантния вирус LaSota с гена на интерлевкин-4, вмъкнат в обратна ориентация. Вирусната доза, която са получили яйцата във всяка група, е представена като число след името на групата в EID50/на яйце.

3.5. Отделяне след предизвикване, както е демонстрирано чрез rRT-PCR

При 2 DPC, птиците в контролните групи Hatch, BHI и rHVT-ND отделят високи вирусни титри (1{{20}}5,3−5,7 EID50/mL) чрез орален път, докато всички групи с ваксина имаше по-ниски от 104 EID50/mL средни титри на отделяне (Фигура 5А). Резултатите за излъчване на вируси през клоаката бяха под границата на откриване на анализа във всички групи. При 2 DPC, птиците във всички групи ZJ1*L и ZJ1*L-IL4R и тези в групата LS-IL4R 105.5 имат значително по-малко вирусна РНК, открита по орален път в сравнение с контролните групи Hatch, BHI и rHVT-ND (р стойностите варират между 0,001 и 0,02). При 4 DPC отделянето по орален път в групите Hatch, BHI и rHVT-ND е високо (106,2-6,9 EID50/mL) (Фигура 5B).

За разлика от това, по-малко отделяне се наблюдава във всички групи с ваксина при 4 DPC в сравнение с 2 DPC, с най-висок среден титър от 102,9 EID50/mL в групата ZJ1*L 104,5 и най-нисък среден титър от 101,5 EID50/mL в ZJ1* l-IL4R 104.5 група (вирусна РНК не е открита при някои птици). Всички експериментални групи с rNDV ваксина отделят значително по-малко вирус по орален път в сравнение с контролните групи на Hatch, BHI и rHVT-ND (p стойности от<0.0001 to 0.03). No significant differences in oral shedding were observed among the experimental rNDV vaccine groups. The birds in the rNDV vaccine groups shed significantly less virus through the cloacal route compared with the Hatch, BHI, and rHVT-ND control groups (p values from <0.0001 to 0.007). The differences in the titers were not significant among the experimental rNDV vaccine groups and the LS control group.

Фигура 5. Средно вирусно отделяне след заразяване от пилета след инокулиране на търговски яйца на 18 дни от ембриона с експериментални in ovo ваксини и ранно заразяване с вирулентен вирус на Нюкясълска болест на 14 дни след излюпването. Всяка точка от данни представлява титри на NDV, открити в орофарингеални (OP) и клоакални (CL) тампони в различни дни след предизвикване (DPC). Отделянето е представено отделно за 2 дни след предизвикване (A) и 4 дни след предизвикване (B). Стълбчетата представляват стандартните отклонения на средната стойност. На всички тампони, от които вирусът не е открит, е дадена цифрова стойност от 1 log под границата на откриване. Границата на откриване на rRT-PCR е представена като хоризонтална пунктирана линия.

Статистически значимите разлики между различните групи са представени с малки букви над всяка група (p-стойност < 0.05). Групови съкращения: HATCH—яйцата не са инокулирани; BHI—яйца, инокулирани с BHI; rHVT-ND—яйца, инокулирани с рекомбинантна HVT ваксина; ZJ1*L—яйца, инокулирани с рекомбинантен ZJ1*L вирус, чието място на разцепване е модифицирано, за да бъде с ниска вирулентност; ZJ1*L-IL4R—яйца, инокулирани с рекомбинантен ниско вирулентен ZJ1*L с интерлевкин-4 ген, вмъкнат в обратна ориентация; LS—яйца, инокулирани с щам LaSota; LS-IL4R — яйца, инокулирани с рекомбинантния вирус LaSota с гена на интерлевкин-4, вмъкнат в обратна ориентация. Вирусната доза, която са получили яйцата във всяка група, е представена като число след името на групата в EID50/на яйце.

3.6. Серология след предизвикване

Всички птици в контролните групи Hatch, BHI и rHVT-ND показват повишени (повече от два пъти) титри на HI-антитела при 14 DPC (над log2 10) в сравнение с титрите преди предизвикване при 13 DPH (log{ {6}}.7). Разликите в титрите в тези три групи преди и след провокацията бяха значителни (p-стойност<0.0001) (Figure 3, solid bars). In contrast, the post-challenge HI titers in all experimental rNDV vaccine groups and the LS control group did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups. In all groups, the differences between pre-and post-challenge antibody titers were within a log (except LS-ILR4 103.5, in which the difference was log2 1.8).

3.7. Инокулирани SPF контролни групи

Преживяемостта в контролните групи с SPF след излюпване е 66,7 процента в групата, инокулирана с ZJ1*L 103,5, и 57,1 процента в групата, инокулирана с ZJ1*L-IL4R 103,5 (допълнителна фигура S3A). Активно отделяне на вируси беше открито при птиците в SPF контролните групи и по двата пътя, с по-високи титри, открити в пробите от орофарингеален тампон (вижте допълнителна фигура S3B). HI титрите след ваксинация на инокулираните SPF контролни птици бяха по-високи от титрите в контролните групи Hatch, BHI и rHVT-ND и достигнаха средни стойности от log2 7.08 и log2 7. 58 при 13 DPH в групите ZJ1*L-IL4R 103.5 и ZJ1*L-IL4R 103.5, съответно (вижте допълнителна фигура S3C). Не са наблюдавани клинични признаци или смъртност след провокация в двете инокулирани SPF контролни групи (вижте допълнителна фигура S3D за кривите на преживяемост). Птиците от инокулирани SPF контролни групи отделят значително по-малко вирус по орален път при 2 DPC и 4 DPC в сравнение с контролните групи (p стойности от<0.0001 to 0.009) (see Supplementary Figure S3E). The post-challenge antibody titers in both inoculated SPF control groups did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups (see Supplementary Figure S3C).

For more information:1950477648nn@gmail.com