Фигура 4. Конкурентност на олигозахариди и НА при свързване към CD44. (А) Намаляване наефект на олигозахаридитевърху антигенността на CD44. Рекомбинантен CD44 на плъх (20 ng/mL) се смесва с или без FC, FOS или GOS за 1{{10}} min и след това се анализира с помощта на комплекта CD44 ELISA. Резултатите са изразени като средна стойност ± SD (n=4). *, p <0,05 спрямо контролната група. (B) пречи на инхибиторните ефекти на олигозахаридите върху CD44 и фосфорилираната JNK експресия. NRK-52E клетките бяха предварително третирани с 0,1 mg/mL НА за 30 минути, след това бяха приложени с 0,1 mg/mL FC, FOS или GOS за 30 минути и накрая бяха подложени на хипоксична култура. Експресията на протеин се анализира чрез Western blot. Относителните увеличения на протеиновите ленти също са представени под формата на стълбовидна диаграма. Резултатите са изразени като средна стойност ± SD (n=4).

НОВА БИЛКА ЗА ДЕЙСТВИЕ НА ЦИСТАНЧЕТО?

3.5. Олигозахаридите подобряват бъбречната функция и намаляват възпалението при мишки с AKI в ранен стадий

Беше създаден миши модел AKI с IRI, за да се оцени влиянието на олигозахаридите върхубъбречна функцияивъзпаление.Бъбречна функциябеше наблюдаван ототкриване на серумен креатинин. Мишките бяха хранени солигозахаридисамо в началния стадий на AKI, т.е. от 1 ден преди до 2 дни след операцията на IRI. След този период серумният креатинин се повишава значително при AKI мишки, но не и при третирани с олигозахариди AKI мишки, което показва, че олигозахаридите имат подобрена бъбречна функция (Фигура 5А). След това се наблюдават нивата на серумните цитокини, за да се оцени възпалението на AKI мишки. Серумните MCP-1, IL-1 и TNF- бяха значително повишени при AKI мишки (Фигура 5B–D), но бяха намалени от трите олигозахарида. IHC анализ на неутрофилен маркер Ly6G показа неутрофилна инфилтрация в бъбреците на AKI мишки, но не и при нормални мишки и третирани с олигозахариди AKI мишки (Фигура 6А). IHC анализ на макрофагов маркер F4/80 разкри инвазия на макрофаги в бъбреците на AKI мишки, но не и при нормални мишки и AKI мишки, третирани с олигозахариди (Фигура 6B). В сравнение с тези на нормални мишки и AKI мишки, хранени с олигозахариди, бъбречните тубули на AKI мишки показват висока експресия на TNF (Фигура 6C). Тези резултати показват, че FC, FOS и GOS намаляват бъбречното възпаление при мишки с AKI в ранен стадий.

Фигура 5. Намаляване на ефекта на олигозахаридите върху серумния креатинин и цитокини при AKI мишки в ранен стадий. Кръв се събира от всяка мишка 2 дни след IRI операция за измерване на серумния креатинин (A), MCP-1 (B), IL-1 (C) и TNF- (D). Резултатите са изразени като средна стойност ± SD (n=8).

3.6. Олигозахаридите насърчават възстановяването на бъбреците след AKI

На седмия ден след операцията на IRI, серумният креатинин на AKI мишки намалява, но все още е по-висок от този на нормалните мишки (Фигура 7А). Не се наблюдава значителна разлика в серумния креатинин между мишки с AKI, третирани с и без олигозахариди. Въпреки това, серумното ниво на NGAL, AKI маркер за AKI, все още е по-високо при AKI мишки, отколкото при нормални мишки и третирани с олигозахариди AKI мишки (Фигура 7B). Това откритие показва, че храненето с олигозахариди в ранния стадий на AKI може да намали увреждането на бъбреците след AKI. PAS оцветяването на миши бъбречен кортекс се провежда на 7-ия ден след IRI операцията. AKI мишки показват тежко тубулно увреждане с тубулна дилатация и интралуминални клетъчни остатъци чрез тубулна некроза, а AKI мишки, третирани с олигозахариди, показват само леко тубулно увреждане (Фигура 7C). Следователно, приемът на FC, FOS или GOS в ранния стадий на AKI подпомага възстановяването на бъбречните тъкани и бъбречната функция при AKI мишки.

Фигура 6. Инхибиторен ефект на олигозахаридите върху бъбречно възпаление при мишки с AKI в ранен стадий. Бъбреците от всяка мишка 2 дни след IRI операцията бяха събрани за IHC оцветяване. (A) Ly6G IHC оцветяване. Бялата стрелка показва Ly6G положително оцветени неутрофили. (B) F4/80 IHC оцветяване. Бялата стрелка показва F4/80 позитивно оцветени макрофаги. (C) TNF-IHC оцветяване

4. Дискусия

Исхемията е една от основните причини за AKI. Тук са създадени хипоксичен клетъчен модел и миши модел на AKI с IRI, за да се изследва влиянието на олигозахаридите върху AKI и техния основен молекулен механизъм. Индуцирана от хипоксия експресия на MCP-1, IL-1 и TNF- в NRK-52E клетки, които бяха инхибирани от JNK инхибитор SP600125. Трансфекцията на CD44 siRNA блокира индуцираното от хипоксия активиране на JNK. Тези резултати показват, че хипоксията повишава CD44, което от своя страна активира JNK и по този начин регулира цитокините в бъбречните тубулни клетки. FC, FOS и GOS намаляват CD44 антигенността и се конкурират с лиганда НА на CD44 на бъбречните тубулни клетки. Това откритие предполага, че трите олигозахарида могат директно да взаимодействат с CD44, за да потиснат индуцираната от хипоксия CD44 регулация, JNK активиране и експресия на цитокини в бъбречните тубулни клетки. Въпреки че p38 е друга важна MAP киназа за TNF и IL-1 по време на възпалителни реакции [21], фосфорилираният p38 не е регулиран нагоре в хипоксични NRK-52E клетки. Следователно, р38 не участва в експресията на цитокини в бъбречните тубулни клетки и инхибиращия ефект на олигозахаридите върху възпалителните реакции на бъбречните тубулни клетки. FC и GOS повишават фосфорилирането на p38 в хипоксични клетки, което показва тяхното потенциално влияние върху p38-свързаните възпалителни реакции. При проучвания върху животни, FC, FOS и GOS инхибират повишаването на серумните MCP-1 и IL-1 при мишки с AKI в ранен стадий и намаляват експресията на TNF в бъбречните тъкани. Цитокините са ключови ефектори на набирането на левкоцити. FC, FOS и GOS намаляват инфилтрацията на неутрофили и инвазията на макрофагите в бъбреците на мишки с ранен стадий на AKI. На 7-ия ден след операцията намаленото възпаление и неутрофилна инфилтрация при AKI в ранния стадий е от полза за възстановяването в напреднал стадий. Това проучване разкрива за първи път, че консумацията на FC, FOS или GOS в ранния стадий на AKI може да насърчи възстановяването чрез инхибиране на възпалението на бъбреците.

Към днешна дата влиянието на добавките с олигозахариди върху AKI не е проучено. Много олигозахариди се считат за пребиотици и могат да насърчат растежа на благоприятна микробиота [13,22]. Олигозахаридите от човешкото мляко регулират развитието и функцията на имунната система чрез изграждане на специфична микробиота [23,24]. Чревната микробиота е важен модификатор на резултата от AKI [20]. На теория олигозахаридите могат да повлияят на тежестта на AKI чрез регулиране на чревната микробиота. Въпреки това изграждането на микробиота от олигозахариди и имунната модерация от микробиота ще изисква повече от няколко седмици. В настоящото изследване върху животни, мишките са хранени с олигозахариди от 1 ден преди до 2 дни след IRI операция. Резултатите показват положителния ефект на олиго шарадите върху AKI на втория ден след операцията на IRI. Следователно, бъбречната защита на олигозахаридите в настоящата система не е причинена от влиянието на микробиотата. Много олигозахариди, включително FC, FOS и GOS, могат да бъдат абсорбирани от тялото, да навлязат в системното кръвообращение и накрая да бъдат елиминирани от бъбреците [14–16,22,25]. Тези олиго шаради имат шанс да взаимодействат с CD44 върху бъбречните тубулни клетки in vivo. Чрез повлияване на CD44, олигозахаридите могат незабавно да модулират имунния отговор на бъбрека при остро увреждане, като по този начин подобряват възстановяването му. В допълнение, олигозахаридите на човешкото мляко директно модулират имунните отговори локално или системно [22,25]. Следователно ефектът на олигозахаридите върху имунната и други физиологични системи се дължи на техните преки влияния и промени в микробиотата.

CD44 насърчава клетъчната адхезия и действа като сигнален рецептор в много важни физиологични явления [26]. Взаимодействието на CD44 и неговия основен лиганд HA, основна съставна част на извънклетъчния матрикс, може да подобри клетъчната адхезия, пролиферацията, миграцията и имунните отговори [27–29]. HA, свързването към CD44 инициира вътреклетъчни сигнални събития чрез модулиране на низходящите сигнални молекули на CD44, включително актинов цитоскелет [30]; протеини езрин, радиксин и моезин [31]; анкирин [32]; и нерецепторна тирозин киназа Src [33]. Тези сигнални молекули надолу по веригата са свързани с JNK активирането. Реорганизацията на актиновия цитоскелет активира многобройни сигнални каскади, по-специално JNK [34,35]. Ezrin се свързва с JNK сигнални компоненти, за да улесни активирането на JNK в В клетки [36]. Ankyrin и Src също индуцират JNK активиране [37–39]. Следователно, сигналната трансдукция на CD44 е свързана с JNK активиране. Доказано е, че свързването на НА с CD44 насърчава активирането на JNK в клетките на рака на гърдата [19]. В настоящото изследване беше установено, че олиго шарадите пречат на взаимодействието между НА и CD44, за да инхибират низходящата JNK сигнална трансдукция и следователно имунния отговор на бъбречните тубулни клетки. Въз основа на тези констатации, олигозахаридите показват потенциал да потискат други физиологични реакции, свързани с CD44, особено пролиферацията и миграцията на ракови клетки, насърчавани от CD44.

Олигозахаридите, налични в момента на пазара, включват главно FOS, GOS, FC и изомалтоолигозахариди [40,41]. FOS, GOS и FC могат да бъдат частично абсорбирани от тялото, да навлязат в системното кръвообращение и да бъдат погълнати от зеленчуци, мляко и морски водорасли [14–16,22,25]. В тази работа е изследвано влиянието на тези три анионни олигозахариди върху AKI. Въпреки че тези три олигозахарида имат различни монозахаридни състави, техните ефекти върху бъбречните тубулни клетки при хипоксия са много сходни, включително инхибиторния ефект върху CD44, фосфорилиран JNK и цитокини. Освен това добавената НА пречи на инхибиторния ефект и на трите олигозахарида. Следователно механизмът на тези три олигозахарида върху бъбречните тубулни клетки е един и същ, независимо от техния тип монозахариди. Този механизъм може да е свързан със структурните прилики между олигозахаридите и НА. Въпреки това, видовете монозахариди в трите олигозахариди все още причиняват малко по-различни ефекти в настоящата система. FC и FOS намаляват експресията на JNK в хипоксични бъбречни тубулни клетки, но GOS показва ограничен ефект. Влиянието на FOS върху антигенността на CD44 е по-слабо от това на FC и GOS. Най-ефективната доза на FOS (0.5 mg/mL) за инхибиране на индуцирания от хипоксия CD44 също е по-висока от тази на FC и GOS (0,05 mg/mL). Тези резултати предполагат, че инхибиторните ефекти на FC и GOS върху CD44 сигналната трансдукция са по-големи от тези на FOS. Експериментите с животни обаче показват подобни бъбречни защитни ефекти от поглъщането на трите олигозахарида в началния стадий на AKI. Сравняването на бъбречните защитни ефекти между трите олигозахарида при AKI мишки е трудно и включва абсорбцията на олигозахариди в червата. Повечето олигозахариди се усвояват от чревни бактерии и само малка част може да се абсорбира [42,43]. Ефективността на храносмилането в червата варира за различните олигозахариди, което от своя страна влияе върху количеството им на абсорбция. В допълнение, дължината на олигозахаридите също влияе върху ефективността на тяхното усвояване в червата. В това проучване, FC с най-малка средна степен на полимеризация теоретично би се абсорбирала по-лесно от FOS с най-голяма средна степен на полимеризация. Експериментите с животни обаче разкриха, че след като олигозахаридите (10 mg/kg/ден) се усвоят от чревните бактерии, достатъчно количество все още може да влезе в кръвообращението, за да се постигне бъбречен защитен ефект върху AKI мишки.

В обобщение, FC, FOS и GOS директно взаимодействат с CD44, за да инхибират индуцираната от хипоксия CD44 регулация, JNK активиране и експресия на цитокини в бъбречните тубулни клетки. Поглъщането на FC, FOS и GOS в ранните стадии на AKI насърчава възстановяването чрез инхибиране на възпалението на бъбреците. AKI се появява внезапно при пациенти, приети в болници и интензивни отделения, и не е разработено лечение за избягване или облекчаване на това състояние. Въз основа на тези констатации ежедневният прием на олигозахариди може да намали тежестта на AKI и да насърчи възстановяването на бъбреците при пациенти с AKI.

Референции

1. Макрис, К.; Spanou, L. Остра бъбречна травма: Дефиниция, патофизиология и клинични фенотипове. Clin. Biochem. Rev. 2016, 37, 85–98. [PubMed]

2. Силвър, SA; Harel, Z.; McArthur, E.; Nash, DM; Acedillo, R.; Kitchlu, A.; Гарг, АХ; Chertow, GM; Бел, CM; Wald, R. Причини за смърт след хоспитализация с AKI. J. Am. Soc. Нефрол. 2018, 29, 1001–1010. [CrossRef] [PubMed]

3. Йоанидис, М.; Druml, W.; Forni, LG; Groeneveld, ABJ; Оноре, PM; Хосте, Е.; Остерман, М.; Oudemans-van Straaten, HM; Schetz, M. Превенция на остро бъбречно увреждане и защита на бъбречната функция в интензивното отделение: Актуализация 2017: Експертно становище на работната група по превенция, секция AKI, Европейско дружество по интензивна медицина. Интензивно лечение Med. 2017, 43, 730–749. [CrossRef] [PubMed]

4. Бижуклич, К.; Jennings, P.; Кунчев, Й.; Hasslacher, J.; Айдън, С.; Стърн, Д.; Pfaller, W.; Patsch, JR; Joannidis, M. Миграция на левкоцити през двуслоен ендотел-епител като модел на бъбречно интерстициално възпаление. Am. J. Physiol. Physiol. 2007, 293, C486–C492. [CrossRef]

5. Бихорац, А.; Baslanti, TO; Cuenca, AG; Hobson, C.; Ang, D.; Ефрон, Пенсилвания; Майер, RV; Мур, FA; Moldawer, LL Острата бъбречна травма е свързана с ранни цитокинови промени след травма. J. Trauma Acute Care Surg. 2013, 74, 1005–1013. [CrossRef]

6. Сингбартъл, К.; Formeck, C.; Kellum, JA Бъбречно-имунна система Crosstalk в AKI. Семин. Нефрол. 2019, 39, 96–106. [CrossRef]

7. Муруган, Р.; Уен, X.; Keener, C.; Пайк, Ф.; Палевски, П.М.; Unruh, М.; Финкел, К.; Виджаян, А.; Старейшина, М.; Chen, Y.-F.; et al. Асоциации между интензивността на RRT, възпалителните медиатори и резултатите. Clin. J. Am. Soc. Нефрол. 2015, 10, 926–933. [CrossRef]