Pingping Zou

Pingping Zoua,†, Yuelin Songb,†, Wei Leia, Jun Lib, Pengfei Tua,b,

Йонг Дзян,⁎

ацетат Ключова лаборатория за естествени и биомиметични лекарства, Факултет по фармацевтични науки, Пекински университет, Пекин 100191, Китай Съвременен изследователски център за традиционна китайска медицина, Училище по китайска материя медика, Пекински университет по китайска медицина, Пекин 100029, Китай

Получена на 17 май 2017 г.; ревизиран на 20 юни 2017 г.; приет на 17 юли 2017 г

Резюме: Cistanche deserticola(CD) е едно от двете авторитетни изходни растения наCistanches Herba, добре познато лечебно растение. Тук беше използвана 1H NMR спектроскопия за характеризиране на химическия профил и за разграничаване на различните части, както и за предлагане на нов работен процес за обработка на CD. Определянето на сигнала беше постигнато чрез множество едномерни и двумерни NMR спектроскопски техники в комбинация с налични бази данни и автентични съединения. Горните части на растението бяха разграничени от долните части чрез комбиниране на 1H NMR спектроскопски набор от данни с многовариантен статистически анализ. Нов метод на обработка, който свързва пропарването със сушене чрез замразяване, беше доказано, че е по-добър от обработката на пара, съчетана със сушене в пещ или директно сушене чрез замразяване чрез холистична метаболомна характеристика, базирана на 1H NMR. Фенилетаноидни гликозиди, главно ехинакозид иактеозид, бяха отсеяни и потвърдени като химически маркери, отговорни за показването на превъзходството на новия работен процес на обработка, докато серийните първични метаболити, особено въглехидратите и метаболитите от цикъла на трикарбоксилната киселина, бяха открити като първични молекули, управляващи разграничението между горната и долната част на растението. Колективно, 1H NMR спектроскопията беше демонстрирана като универсален аналитичен инструмент за характеризиране на химическия профил и за насочване на задълбочената експлоатация на CD чрез предоставяне на изчерпателна качествена и количествена информация.

КЛЮЧОВИ ДУМИ:Цистанчеdeserticola; 1H NMR базирана метаболомика; Работен процес на обработка; Различни части;Фенилетаноиден гликозид; Метаболити от цикъла на трикарбоксилната киселина;Ехинакозид; Актеозид

За повече информация моля свържете се с:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola има много ефекти, щракнете тук, за да научите повече

1. Въведение

Cistanches Herba(CH, китайско име: Roucongrong), първоначално архивиран вКитайската Materia Medica на Шен Нонг, широко се смята за едно от най-известните ядливи тонизиращи и лечебни растения и е почитано като „Женшен на пустините“^1,2. Като едно от двете официални растения източник на CH,Cistanche deserticola(CD, Orobanchaceae) е холопаразитно растение и разпространено главно в северната и северозападната част на Китай^2,3. Той е бил широко използван за лечение на бъбречна недостатъчност, характеризираща се с импотентност, болки в слабините и коленете, женски стерилитет и запек в традиционните китайски медицински практики от векове^3–5. Въпреки това, дивите източници на CD са на ръба на изчезване през последните години поради прекомерно събиране на реколтата и е посочено като едно от растенията от клас II, нуждаещи се от защита в Китай¹. Освен това CD предлага важен принос за контрола на пустините. Следователно е критично, но и предизвикателство да се използва този билков материал по-ефективно.

Научни изследвания върхуЦистанчерастения, започнати през 1980 г⁶. Фитохимичните изследвания разкриха съществуването на различни химични видове,e.g., фенилетаноидни гликозиди (PhGs), иридоиди, лигнани, мастни киселини, алдитоли и въглехидрати, в рамките на CD⁷. Сред тях най-често се споменават PhGs поради техния широк спектър от биологични дейности, включително антиоксидация, против стареене, против умора, противовъзпалителни, повишаващи имунитета на тялото, подобряващи ученето и паметта на мишки с болестта на Алцхаймер и т.н.¹. Напоследък PhGs привличат все по-голямо внимание като потенциални нови кандидати за лекарства за лечение на невродегенеративни разстройства. По-специално, амалгамация на общите PhGs, открити в CH, е разработена като ново лекарство, регистрирано като общоЦистанчегликозидкапсула (Memoregain^®) за лечение на съдова деменция⁸. Ехинакозидът, най-разпространената и ефективна съставка на общите PhG, проявява антиапоптотични ефекти върху SHSY5Y невронни клетки след TNF-индуцирана апоптоза и обръща дефицитите при мишки с болест на Паркинсон⁹. Освен това, друго основно активно съединение, актеозид (известен също като вербаскозид) е в състояние да антагонизира апоптозата в невроните¹⁰за защита срещу невротоксичност в PC12 клетки, индуцирана от 1-метил-4-фенилпиридий или глутамат¹¹и за подобряване на дефицита на паметта, предизвикан от скополамин².

Подобен наКордицепсиЖеншен, компактдискът се консумира широко и се оценява като здравословна храна. Действителните и възприеманите ползи от CD вероятно ще играят определяща роля за цената на суровото лекарство. Като се има предвид голямото тяло на суровите наркотици на CD, резените са по-популярни на пазара. Като цяло, ензимното инактивиране и лишаването от вода са двете ключови стъпки по време на обработката на медицински парчета. Конвенционалните методи за сушене на CD включват изолация, сушене в пещ, осоляване и съхранение в изба. Въпреки това, продуктите от тези процеси обикновено страдат от зле изглеждащ външен вид и ниско съдържание на PhGs, което възпрепятства широкото приложение и потребление на CD. През 2007 г. нашата група предложи нова техника за обработка на CD, която драстично запазва съдържанието на ехинакозид иактеозидна филийки¹⁴. Въпреки това, тъй като продуктите от този процес все още страдат от неприятен външен вид, понастоящем описваме методология на обработка за подобряване на външния вид и допълнително запазване на съдържанието на PhG в обработените материали.

Серийни аналитични инструменти досега са били прилагани за химичния анализ на CD, включително тънкослойна хроматография, високоефективна течна хроматография (HPLC), съчетана с различни детектори, като детектор с диодна матрица (DAD), детектор за разсейване на светлината с изпаряване (ELSD), електронен улавящ детектор (ECD) и тандемен масспектрометър (MS/MS). PhG, по-специално ехинакозид и актеозид, най-често се приемат като маркери за качество¹. Отпечатъкът на това билково лекарство също е разработен с помощта на HPLC-DAD и HPLC-DAD-MS/MS^15,16. Независимо от това, остава предизвикателство да се оцени качеството на CD поради изключително сложния му химичен профил. Най-общо казано, подходите, насочени към няколко аналита, не са в състояние да предложат холистичен химичен изглед за суровите екстракти, въпреки че изобилие от качествена и количествена информация може да бъде получена от LC-MS/MS. Освен това свързаните с HPLC аналитични стратегии могат да бъдат ограничени от големи количества разтворители, досадна подготовка на пробите и/или отнемащи време процедури. Следователно, за оптимален химичен анализ е необходим нов подходящ за целта аналитичен инструмент, способен да дава изчерпателна информация за групата от съединения. за щастие¹H NMR спектроскопията беше точно демонстрирана като атрактивен инструмент "всичко в едно", способен да предложи не само качествен набор от данни, но и количествена информация за широк спектър от първични и вторични метаболити с проста подготовка на пробата и бързо получаване^17–20. Досега широки приложения на¹1Н ЯМР спектроскопията е стартирана за едновременно определяне, химично профилиране и метаболомика на сложни матрици.

Въпреки че са проведени няколко изследвания за това ценно билково лекарство, неговият глобален химичен профил е до голяма степен неизвестен. Тъй като CD е паразитно растение, долните части трябва да са отговорни за предаването на хранителни вещества, главно първични метаболити, от гостоприемника към горните части, докато енергичният енергиен метаболизъм, като цъфтежа, обикновено се случва в горните части. Следователно е разумно да се предположи, че има разлики за метаболома на различните части. Следователно, в настоящото изследване, ние се стремим 1) да характеризираме изчерпателно химическия профил на CD, използвайки¹Н NMR спектроскопия, съчетана с различни двуизмерни (2D) NMR измервания; 2) да се изяснят разликите между горната и долната част и 3) да се предложи нов работен процес на обработка чрез¹Метаболомно изследване на базата на Н NMR. Очаква се получените открития да осигурят солидни насоки за по-нататъшното използване на тази лечебна билка по по-добър начин, по-специално за използването на различни части и техники за обработка.

2. Експериментален

2.1. Растителни материали

Дванадесет партиди свежи материали (CD1–CD12, Таблица S1, Допълнителна информация) бяха събрани от автономните региони Вътрешна Монголия, Синдзян и Нинся в Китай. Ботаническият произход на всички сурови материали беше удостоверен като

Метаболомика на базата на 1H NMRCistanche deserticola 649C. deserticolaот един от авторите, проф. Pengfei Tu. Всички екземпляри от ваучери са депозирани в хербариума на модерния изследователски център за традиционна китайска медицина, Пекинския университет (Пекин, Китай).

2.2. Химикали и реактиви

Метанол-d4 (CD3OD, изобилие на деутерий, 99,8 атомни процента D), деутерирана вода (D2O, изобилие на деутерий, 99,8 атомни процента D) и натриев 3-триметилсилил [2,2,3,3-d4 ] пропионат (TSP-d4) са получени от Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, USA). Метанолът с аналитичен клас е закупен от Beijing Chemical Works (Пекин, Китай).

Автентични съединения, включително ехинакозид, актеозид и манитол, бяха пречистени от CD в нашата лаборатория по-рано14, а захарозата, -галактозата, заедно с -глюкозата бяха доставени от Sigma–Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Чистотата на всички справки беше определена като повече от 98 процента чрез HPLC–UV и 1H NMR анализи.

2.3. приготвяне на пробата

Всички сурови материали (CD1–CD11), с изключение на CD12, бяха нарязани на горните части (GU) и долните части (GD) в средата на целите стъбла и всички части бяха нарязани на тънки резени (приблизително 6- mm -дебел всеки). Впоследствие всички срезове от CD1–CD12 бяха последователно обработени на пара за 10 min и изсушени в пещ при 6{{40}} градуса за 48 часа, за да се получат проби от тип a. Два други метода на обработка, включително директно сушене чрез замразяване и 10-мин обработка на пара, последвано от последователно сушене чрез замразяване, бяха извършени за някои избрани проби, включително CD1-GU, CD4-GU, CD4-GD, CD11-GD и CD12, за да се осигурят два допълнителни комплекта обработени проби (проби от тип b и c). Подробните описания на всички проби са илюстрирани в таблица S1. Преди екстракцията, всички обработени срезове се натрошават на прах с мелница за проби (модел YF102, Ruian Yongli Pharmacy Machinery, Китай) и се пресяват през сито 80 меша. След това пулверизираните растителни материали се претеглят точно (приблизително 200 mg за всеки) и се екстрахират с 50-кратно 50 процента воден метанол (w/v) в ултразвукова водна баня (25 градуса) в продължение на 40 минути. След това се добавя 50 процента воден метанол, за да се компенсира загубата на тегло по време на екстракцията. Всеки екстракт се центрофугира при 10,000×g при 10 градуса за 10 минути и се филтрува през 0,22 μm мембрана. Аликвотни части (2 mL) от супернатантата впоследствие се изпаряват и допълнително се изсушават с използване на вакуумно сушене при 30 градуса за 30 минути. Изсушените остатъци от всяка проба се възстановяват с помощта на 0,5 ml смес (1:1, v/v) от CD3OD и фосфатен буфер в D2O, съдържащ 0,05 процента TSP-d4 (pH 7,4), и след това разтворът се прехвърля в 5 mm (id) NMR тръба (Norell ST500-7) за NMR анализи. Всяка проба се анализира трикратно.

2.4. ЯМР измервания

Всички 1H NMR, 13C NMR и 2D NMR спектри бяха записани на Varian Unity Plus 500 MHz спектрометър (Varian Inc., Пало Алто, Калифорния, САЩ) при 499,91 MHz протонна честота, оборудван с TCI криосонда и Z-градиентна система. Бяха приложени идентични параметри както за екстрактите, така и за референтните съединения, за да се получат сравними спектри. За 1Н NMR измервания бяха получени 256 сканирания със следните параметри: ширина на спектрите, 8012.6 Hz (16 ppm); ширина на импулса, 11,05 μs (ъгъл на обръщане 90 градуса); време на придобиване, 2.04 s; забавяне на релаксация (d1), 2 s; и температура, 298 K. CD3OD беше използван за заключване на честотата на полето и химичните отмествания на всички спектри бяха подравнени с помощта на сигнала от TSP-d4 при δ 0.00. Беше приета мокра процедура за потискане на интензитета на H2O сигнала, който се намираше около δ 3.3021. Беше приложена експоненциална функция с коефициент на разширяване на линията (LB) като 0,3 Hz и данните бяха запълнени с нула, за да дадат най-малко пет точки от данни над полуширината за всеки резонанс, за да се гарантира прецизна и надеждна интеграция. Сигналите със затихване на свободната индукция (FID) бяха трансформирани на Фурие (FT) и всички спектри бяха ръчно фазирани и коригирани с помощта на автоматизирана полиномна базова програма.

За подпомагане на химическата характеристика и присвояването на сигнала,

13C NMR и различни 2D NMR анализи, като 1H–1H

корелационна спектроскопия (1H–1H COSY), хетеронуклеарна единична квантова кохерентна спектроскопия (HSQC) и хетеронуклеарна спектроскопия на корелация на множество връзки (HMBC) също бяха придобити за представителна проба (CD1-GUI) с помощта на тези програми по подразбиране. Спектралната ширина за COSY беше δ 0.5–10.0 в двете измерения и 128t1 стъпки за всеки t1. Шестнадесет преходни процеси, използващи забавяне на релаксация от 1.00 s, бяха добавени с 822 сложни данни.

Оптималните константи на хетероядрено свързване с една връзка и n-връзка за HSQC и HMBC бяха съответно 146 и 8 Hz. Диапазоните бяха зададени като –0.5–10.0 ppm в измерението F2 и съответно 0–200 ppm в измерението F1.

2.5. Многовариантен статистически анализ на NMR спектроскопски набор от данни

1Н NMR спектрите бяха обработени с помощта на софтуера MestReNova (версия 5.2.5, Mestrelab Research, Сантяго де Компостела, Испания). Всеки спектър беше мащабиран до общия интензитет и намален до интегрирани области с еднаква ширина (0.02 ppm) в областта на δ 0,50–9,50 след изключване на областите на δ 4,70–

5.02 и δ 3.26–3.36, за да пропуснете остатъчните сигнали съответно на вода и метанол. Анализ на главните компоненти (PCA) с мащабиране на Парето (Par), както и ортогонален частичен дискриминантен анализ на най-малките квадрати (OPLS-DA) с мащабиране на дисперсия на единица (UV) бяха извършени със софтуер SIMCA-P 12.0 (Umetrics, Umeå, Швеция).

2.6. Едновременно определяне на ехинакозид и актеозид чрез HPLC-UV

За кръстосано валидиране на констатациите за трите техники на обработка, HPLC система от серия Agilent 1260, състояща се от дегазатор, кватернерна помпа, автосамплер, колонна пещ и детектор с диодна матрица (Agilent Technologies, Санта Клара , Калифорния, САЩ) бяха използвани за едновременно определяне на ехинакозид и актеозид във всички a-, b- и c-тип проби. Колона Agilent Zorbax SB-C18 (250 mm × 4,6 mm, размер на частиците 5 μm, Agilent Technologies), защитена от съответната защитна колона (10 mm × 4,6 mm, размер на частиците 5 μm), беше избрана за провеждане на хроматографски разделяния. Протоколът за подготовка на пробата, мобилната фаза и програмата за елуиране следват описанията, архивирани в Китайската фармакопея (2010 издание)3 с незначителни модификации. Накратко, ултразвуковата екстракция се извършва в продължение на 30 минути, като се използва 50 процента воден метанол; 30 процента воден метанол беше приет като подвижна фаза за изократно елуиране при скорост на потока от 1,0 mL/min и колонната пещ беше поддържана при

30 градуса. Дължината на вълната на откриване е настроена на 330 nm и инжекционният обем е настроен на 10 μL.

3. Резултати и обсъждане

3.1. Оптимизиране на екстракционни и спектроскопски параметри

За да се получат висококачествени 1Н NMR спектри за всички проби, различни параметри бяха внимателно оптимизирани с помощта на представителна проба (CD1-GUI). Първо, разтворителят за екстракция беше избран измежду 30 процента воден метанол, 50 процента воден метанол и метанол. Резултатите показват, че по-голям общ отговор е осигурен от 50 процента воден метанол в сравнение с другите два, съгласувайки се добре с протокола за екстракция, удостоверен в Китайската фармакопея (издание от 2015 г.)3. Екстракцията с помощта на ултразвук беше избрана поради удобната й работа при добиви, сравними с тези на екстракция с горещ обратен хладник и екстракция на Soxhlet (данните не са показани). След това продължителността с помощта на ултразвук беше сравнена между 40 и 60 минути, а 60 минути ултразвуково водно къпане не показа по-голяма екстракционна мощност от 40 минути; следователно, 40 минути бяха определени за ултразвуковия апарат с цел спестяване на време.

От друга страна, {{0}}.5 mL CD3OD–фосфатен буфер в D2O (1:1, pH 7,4) се сравнява с 0.5 mL CD3OD–D2O (1: 1) и резултатите показват, че обогатяването с фосфатен буфер може да предотврати промените и миграцията на спектралния профил. Аликвотна част от 2,0 mL от екстракта беше последователно концентрирана, възстановена и подложена на NMR анализ, за ​​да се получи подходящ отговор за повечето сигнали. Освен това се наблюдава, че мокрият метод е по-добър от програмата за предварително насищане за намаляване на пиковия интензитет на остатъчната вода (около δ 4,8) в спектъра. Ние също така открихме, че увеличаването на броя на сканиране е от полза за подобряването на съотношението сигнал-шум (S/N), което беше доста полезно за чувствително откриване (особено за тези на следи от компоненти). Въпреки това, тъй като този подход е вреден за бързото измерване, в крайна сметка са приложени 256 сканирания за всеки 1H NMR анализ, за ​​да се постигне приемлива чувствителност.

3.2. Определяне на сигнала на 1Н NMR спектър

Идентифицирането на химичните компоненти в CD беше постигнато чрез съвместно анализиране на 1H NMR, 13C NMR и 2D NMR спектри (фиг. 1 и допълнителна информация, фиг. S1–S10) и сравняване с проби от автентични съединения, както и чрез позоваване на достъпни бази данни, като MMCD. Вероятните назначения на сигналите в 1H NMR са дадени на Фиг. 1. Стойностите на химическото отместване за предполагаемите идентичности са обобщени в Таблица S2 (Допълнителна информация).

Структурните характеристики на PhGs в рода Cistanche са описани в литературата1. Поради голямото структурно сходство между PhGs, напр. ехинакозид срещу актеозид, протонните сигнали на фенилетаноидните части се припокриват значително един с друг в 1H NMR спектъра. Това припокриване постави предизвикателен аналитичен проблем за надеждно разграничаване на тези сигнали. В настоящото изследване сигналите, принадлежащи на ехинакозид и актеозид, които са основните съставки в оригиналното растение, бяха недвусмислено определени с помощта на референтни съединения и различни NMR спектри (Таблица S2, Фигура 1 и Фигури. S1–S6). Диагностичният сигнал при δ 7.73 (d, J 16.0 Hz) показва разпределението на Castano-

страна B/D или други ферулоил заместени PhGs (Таблица S2 и Фиг. 1)22. Освен това, цис-тип PhGs (цис-тип кумароил или кофеоил заместени PhGs) също се наблюдават в екстракта въз основа на присъствието на δ 6.95 (d, J 12.0 Hz) в спектъра (Таблица S2 и Фиг. 1).

Бяха открити няколко очевидни сигнала в областта на δ 8.0–9.5. Сигналите при δ 9.15, 8.88 и 8.09 бяха условно определени за никотинамид (Таблица S2 и Фиг. 1) и 13C NMR, както и 2D

ЯМР спектрите (Фигури S4–S6) също подкрепят това назначение. Сигналът при δ 8.48 беше правдоподобно приписан на мравчена киселина, докато сигналите при δ 8.13 и 8.11 бяха генерирани съответно от аденозин и аденин (Таблица S2 и Фиг. 1). Въглехидратните сигнали обикновено се намират в областта между δ 3.00 и 5,50. Очевидно захарозата е най-разпространеният дизахарид в CD, проявяващ значителни резонанси при δ 4.04, 4.18 и 5.41 (Таблица S2 и Фигури 1 и S7). Очевидни сигнали, принадлежащи към аномерните протони на -галактоза, -глюкоза и -глюкоза, бяха резонирани съответно при 5.24, 5.20 и 4.60 (Таблица S2, Фигури 1 и S8, S9). Появата на манитол беше разкрита чрез наблюдение на сигнала при δ 4.00, както и чрез сравняване с референтното съединение (Таблица S2, Фигури 1 и S10). Диагностичният сигнал на 1-О-етил-глюкозид се наблюдава при 1,16 ppm чрез позоваване на HMDB. Аминокиселини, включително левцин (0,93 ppm), изолевцин/валин (0,98 ppm), треонин (1,27 ppm), аланин (1,49 ppm), лизин (1,71 ppm), глутамин (2,30 ppm), аспарагинова киселина (2,96 ppm), пролин (4,09 ppm), тирозин (7,12 ppm) и фенилаланин (7,33 ppm) бяха присвоени условно чрез сравняване на съответните им диагностични спектроскопски поведения с тези, архивирани в HMDB (Таблица S2 и Фиг. 1). Иридоидите и лигнаните бяха споменати по-горе като важни химически хомолози в CD. В представителния 1Н NMR спектър (Фиг. 1), сигналите на сирингарезинол (лигнаново производно) и 8-епилоганова киселина (иридоидно производно) се наблюдават съответно при δ 7,02 и 0,98. Освен това, мултиплетните сигнали, вариращи от δ 6.56–6.64, могат условно да бъдат приписани на цитрус А, алашаниозид А или дехидеодикониферил алкохол глюкозид (всички производни на лигнан), докато сигналите сред δ 6.18–6.33 могат също да бъдат генерирани от иридоиди (Таблица S2 и Фиг. 1). Освен това, появата на някои алифатни карбоксилни киселини в CD, включително фумарова киселина, малеинова киселина, ябълчена киселина, изолимонена киселина, лимонена киселина, кетоглутарова киселина, пирогроздена киселина, янтарна киселина, оцетна киселина и друга мастна киселина, бяха условно характеризирани от наблюдение на диагностичните сигнали при δ 6.54, 6.02, 4.27, 3.04, 2.73, 2.52, 2.49, 2.42, 1.97 и 1.33, последователно (Таблица S2 и Фиг. 1). Освен това, някои сигнали, като например мултиплетен сигнал около 3,80 ppm и синглет при 1,97 ppm22, се разглеждат като характеристиките съответно за метокси и ацетил групите (Таблица S2 и Фиг. 1), които са обичайните заместители на фенилови производни , особено PhG в този случай. Междувременно сигналът при 1.06 ppm може да бъде условно приписан на остатъка от рамноза. Добре известно е, че 1Н NMR спектроскопията може да осигури директна количествена информация, тъй като интензитетът на протонния сигнал е пропорционален на моларната концентрация на аналита19. Следователно, предварителното количествено сравнение може да се извърши за съставките в CD. Очевидно въглехидратите, по-специално захарозата, дават най-високи отговори в представителния спектър (фиг. 1). Като холопаразитно растение, което расте под земята в рамките на почти целия жизнен цикъл, фотосинтезата не е необходима и не е достъпна за CD; следователно не е изненадващо, че в спектъра не е открит първичен метаболит, участващ във фотосинтезата, като участник в цикъла на Келвин (известен също като цикъл С3)23. Напротив, открити са множество молекули, участващи в цикъла на трикарбоксилната киселина (цикъл на ТСА, известен също като цикъл на лимонената киселина и цикъл на Кребс), като лимонена киселина, кетоглутарова киселина, пирогроздена киселина и янтарна киселина, което показва, че енергичният централен въглеродният метаболизъм (CCM) се случва в оригиналното растение. От друга страна, PhGs се наблюдават като доминиращо химично семейство сред различни вторични метаболити, докато лигнаните и иридоидите само осигуряват незначителен принос за целия спектрален профил.

3.3. Прецизен анализ на 1H NMR спектроскопия

Спектроскопската прецизност играе ключова роля в надеждността на метаболомичното характеризиране. В настоящото проучване прецизността на цялата методология беше анализирана чрез изготвяне на представителна проба (CD1-GUI) в пет екземпляра и последващото й анализиране в два последователни дни. Получените спектри показват голямо общо сходство чрез наслагване на всички спектри, което предполага, че протоколът за приготвяне на пробата и 1H NMR измерването са възпроизводими и пробата може да се запази стабилна за поне два дни.

3.4. Разграничаване на горната и долната част на растението

Досега няма доказателства, които да показват, че горните части на CD са еквивалентни на долните части по отношение на химическия профил и фармакологичните свойства. С цел да се изясни дали натрупването на първични или вторични метаболити е настъпило в определени части на CD, целите сочни стъбла бяха нарязани на горната и долната част, като и двете впоследствие бяха обработени, извлечени и измерени с помощта на 1Н NMR спектроскопия. Фиг. 2 показва представителните спектри на двете части. Като цяло повечето сигнали в долните части бяха по-високи от тези в горните части. В диапазона от δ 6.0–9.5 не може да бъде открит уникален сигнал в нито една част; въпреки това, общият интензитет на тези сигнали в долните части е малко по-висок от тези в горните части, което предполага, че ароматните производни могат да бъдат обогатени в домейна близо до паразитната точка23. Долните части също бяха богати на мастни киселини, определени аминокиселини и някои други вещества за съхранение на енергия, тъй като цялостният сигнален отговор на алифатния регион (δ 0.5–3.{{10} }) в долните части беше по-висок от този на горните части. Освен това могат да се наблюдават някои очевидни разлики в областта на захарта (δ 3.0–5.0) и повечето от сигналите, разположени в диапазона от δ 3.0– 5.0 за горните части са по-високи от тези в долните части, което показва, че въглехидратите, забележителни олигозахариди, могат да бъдат натрупани в горните части. За да се подчертаят разликите между горните и долните части и също така да се идентифицират основните участници, отговорни за тяхната дискриминация, беше приложен многовариантен анализ на данни за обработка на спектроскопичния набор от данни на различните части. Първоначално беше приложен неконтролиран подход, наречен PCA, който използва информацията само от една матрица, за да се класифицират всички проби според характерните 1Н NMR спектри. Настъпи обаче широко припокриване за тези две различни части (данните не са показани). След това стартира OPLS-DA, контролиран подход, за да се изясни разделянето между различните групи, както и да се разберат променливите, носещи информация за разделяне на класове. OPLS-DA постигна добро разделяне на различните части на CD. Фигури 3A и B показват съответно резултатната диаграма и S-графиката на OPLS-DA. Както общата доброта на съответствие (R2Y={{30}}.910), така и общият коефициент на кръстосано валидиране (Q2Y=0.981) бяха близки до 1,0. Следователно първоначалният модел на разделяне е статистически стабилен с висока предвидимост. Очевидно горните части могат да бъдат разграничени от долните части, когато пробите са маркирани с две групи и S-графиката дава сигналите, които потенциално допринасят за диференциацията. Като цяло, повече точки бяха разпределени в областта, съответстваща на долните части в S-графиката, където бяха разпределени по-високи съдържания на мастни киселини (δ 1.32–1.35) и TCA циклични фактори (като янтарна киселина при δ 2.42); обаче, горната част (десният клъстер на Фиг. 3A) е богата на някои въглехидрати (главно δ 3.70–4.10, Фиг. 3B). Потенциалните биомаркери, осигурени от S-графиката, са силно съвместими със сравнението на спектрите на двете части чрез директно наблюдение и наслагване. Добре е дефинирано, че метаболитите се синтезират по специфични за тъканите, органите и развитието начини чрез специфични ензими за биосинтеза и след това се съхраняват, понякога във високо съдържание в продуциращите области, съответстващи на техните разнообразни функции за цялото растение. Например, двата типа и съдържанието на гинзенозидите показват значителни вариации между коренищата, корените, листата и последователите на Panax notoginseng24. По отношение на CD, от качествена гледна точка, вторичните метаболитни профили показват голямо сходство между горните части и долните части. Тъй като долните части на цялото растение играят ролята на предаване на хранителни вещества, повечето от които са първични метаболити, напр. въглехидрати, от гостоприемника, Haloxylon ammodendron до точките на енергичен метаболизъм, което показва, че по-изобилни първични метаболити трябва да се появят в долни части. Освен това, екстензивна хидролиза на полизахариди до олигозахариди и впоследствие до монозахариди, които накрая биха могли да бъдат биопрехвърлени в някои алифатни карбоксилни киселини, трябва да се случи широко в горните части. Тъй като 50 процента воден разтвор на метанол е използван за екстракция в това изследване и е способен да извлече хидрофилни ниски молекули вместо макромолекули (напр. полизахариди), не е изненадващо да се отбележи, че натрупването на TCA циклични фактори и мастни киселини е демонстрирано в по-ниските части. Установено е обаче, че някои олигозахариди, хидролитичните продукти на полизахаридите, са обогатени в горните части. От друга страна, бяха наблюдавани незначителни разлики за PhGs между различните части от количествена гледна точка и като цяло се наблюдава леко натрупване на PhGs в долните части 23, 25. Беше съобщено, че haustorium phloem вероятно е вторичният синтетичен орган за PhGs в CD23; следователно долните части, които са близо до паразитната точка, трябва да са богати на PhG.

3.5. Предложение за нов метод за обработка на CD

Очевидно медицинските резени, принадлежащи към проби от c-тип, са по-добри по отношение на добър външен вид, почти бял цвят, лека и хрупкава текстура. Фиг. 4 показва представителните 'Н NMR спектри за тези три типа проби. След паралелни измервания обаче бяха получени различни спектрални профили за тези обработени медицински резени. Чрез директно наблюдение и наслагване могат да се наблюдават очевидни разлики. Първо, в областта на δ 6.00–8.00, където основно са включени сигналите, принадлежащи на PhGs и някои други фенолни производни, отговорите на c-тип проби (фиг. 4C) са били доста по-висок от другите два вида. Второ, отговорите на повечето въглехидрати и участници в TCA в b-тип проби (Фиг. 4B) са почти еквивалентни на тези в c-тип проби (Фиг. 4C), но много по-високи от тези в a-тип проби (Фиг. 4A) . Трето, съдържанието на глюкоза (δ 5.20 за -глюкоза и δ 4.60 за -глюкоза) в b-тип проби (Фиг. 4B) е малко по-високо от това в c-тип проби (Фиг. 4C). И накрая, повече мастни киселини бяха открити в пробите от a- и c-тип, отколкото в пробите от b-тип (фиг. 4). Преди всичко, най-разпространените фенолни производни, като това, които са широко считани за ефективните съставки в CD, бяха открити в пробите, обработени по нов метод (c-тип проби), в сравнение с a- и b- типови проби. Освен това, изобилие от първични метаболити, като въглехидрати, участници в ТСА и мастни киселини също бяха открити в проби от c-тип. Впоследствие бяха извършени сравнения на всички проби чрез многовариантен анализ на данни с цел да се подчертаят приликите, както и разликите между тези три вида лекарствени парчета. PCA с парно мащабиране и OPLS-DA с UV мащабиране бяха извършени за обработка на набора от NMR спектроскопски данни, последователно (данните не са показани). Не е постигнато значително разделяне с помощта на PCA; въпреки това, графиките на резултатите на OPLS-DA за тези три групи (зелени, сини и червени точки на Фиг. 5A) показват ясна класификация, което показва, че тези три групи проби са значително различни по отношение на техните метаболитни профили. The

разграждане на PhG, инициирано или от ензимите в оригиналното растение, или от съхранение при висока температура. В резултат на това обработените срезове (с-тип проби), използващи новия метод, бяха с предимство както при приятен външен вид, така и при по-високо ефективно съдържание на съединение. За кръстосано валидиране на резултатите, споменати по-горе за трите техники на обработка, беше използван методът HPLC–UV, който беше добре разработен и удостоверен в Китайската фармакопея (издание от 2015 г.)3 за едновременно определяне на съдържанието на ехинакозид и актеозид, които играят важна роля за разграничаване на горните три вида преработени продукти. Средното съдържание на ехинакозид в проби от a-, b- и c-тип е съответно 8,33, 4,10 и 16,19 mg/g, докато съдържанието на актеозид е съответно 1,57, 1,14 и 3,66 mg/g. Очевидно съдържанието на PhG в c-тип материалите е 2–4 пъти по-високо от това в a- и b-тип проби, съгласувайки се добре с резултатите от метаболомията, базирани на 1H NMR. Сред наличните аналитични техники, които обикновено се използват в метаболомичните изследвания, методите, базирани на ЯМР и МС, обикновено се признават като благоприятни алтернативи. ЯМР спектроскопията, по-специално 1 Н ЯМР, притежава ненадминато превъзходство над други техники, като неселективност, удобна подготовка на пробите и лекотата на едновременно откриване на различни групи метаболити в сравнително кратко време на измерване. Досега базираната на 1H NMR метаболомика е била използвана за удостоверяване на растенията17 за сравняване на аналогови билки18, за разграничаване на местообитанията26 и за характеризиране на разграждането на билките26. Тук 1Н NMR беше приложен за разграничаване на различните части на CD, а също и за предлагане на нов работен процес, което показва, че 1H NMR спектроскопията е гъвкав и стабилен аналитичен инструмент, който предлага смислени насоки за експлоатацията на CD, както и някои други билкови лекарства чрез предоставяне на изчерпателна качествена и количествена информация за сложни екстрактни матрици.