Част 1 Хроничното бъбречно заболяване и стареенето по различен начин намаляват костния материал и микроархитектурата при C57Bl/6 мишки

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Хроничното бъбречно заболяване и стареенето различно намаляват костния материал и микроархитектурата при C57Bl/6 мишки

Chelsea M. Heveran1, Charles Schurman2,*, Claire Acevedo3, Eric W. Livingston4, Danielle Howe5, Eric G. Schaible6, Heather Hunt7, Adam Rauff8, Eve Donnelly7,#, R. Dana Carpenter9, Moshe Levi10, Anthony Lau5, Ted Bateman4 , Тамара Алистън2,*, Карън Б. Кинг11, Вирджиния Л. Фъргюсън1

1 Катедра по машинно инженерство, Университет на Колорадо, Боулдър, Колорадо

2 Катедра по ортопедична хирургия, Калифорнийски университет, Сан Франциско, Калифорния

3 Департамент по машинно инженерство, Университет на Юта, Солт Лейк Сити, Юта

4 Департамент по биомедицинско инженерство, Университет на Северна Каролина, Чапъл Хил, Северна Каролина

5 Департамент по биомедицинско инженерство, Колежът на Ню Джърси, Юинг, Ню Джърси

6 Усъвършенстван източник на светлина, Национална лаборатория на Лорънс Бъркли, Бъркли, Калифорния

7 Департамент по материалознание и инженерство, Университет Корнел, Итака, Ню Йорк

8 Департамент по биоинженерство, Университет на Колорадо, Денвър, Колорадо

9 Катедра по машинно инженерство, Университет на Колорадо, Денвър, Колорадо

10 Департамент по биохимия и молекулярна и клетъчна биология, Университет Джорджтаун, Вашингтон

11 Катедра по ортопедия, Медицински факултет на Университета на Колорадо, Аврора, Колорадо * Калифорнийски университет Бъркли – Дипломирана програма по биоинженерство на Калифорнийския университет в Сан Франциско, Сан Франциско, Калифорния

# Изследователски отдел, болница за специална хирургия, Ню Йорк, Ню Йорк

Cistanche може да помогне при бъбречни заболявания

Резюме

Хроничното бъбречно заболяване (CKD) е често срещано заболяване на стареенето и увеличава риска от фрактури само в напреднала възраст. Стареенето и ХБН по различен начин увреждат костния обмен и минерализацията. Следователно ние предполагаме, че загубата на качество на костта би била най-голяма при комбинацията от напреднала възраст и ХБН. Ние оценихме кост от млади възрастни (6 месеца), на средна възраст (18 месеца) и стари (24 месеца) мъжки C57Bl/6 мишки три месеца след или 5/6-та нефректомия, за да предизвикат ХБН или фалшиви процедури. ХБН изостри загубите на кортикална и трабекуларна микроархитектура, свързани със стареенето. Стареенето и ХБН водят до по-тънки, по-порести кортикули и по-малко и по-тънки трабекули. Качеството на костния материал също е намалено с ХБН и тези промени в костния материал са различни от тези, дължащи се на възрастта. Стареенето намалява здравината и модула на огъване на цялата кост, модула на нановдлъбнатина в микрометров мащаб и напрежението на тъканите и колагена в нанометров мащаб (разсейване на рентгенови лъчи с малък ъгъл (SAXS)). За разлика от това, ХБН намалява работата до счупване и вариация в модула и състава на костната тъкан (Раманова спектроскопия) и увеличава процента на колагеново напрежение. Увеличеното натоварване на колагеновото напрежение се свързва със загуба на издръжливост при ХБН. В допълнение, остеоцитните празнини стават по-малки, по-редки и по-неподредени с възрастта за Sham мишки, но тези свързани с възрастта промени не се наблюдават ясно при ХБН. Въпреки това, за ХБН, по-големите празнини корелират положително с повишените нива на серумен фосфат, което предполага, че остеоцитите играят роля в системната минерална хомеостаза. Тази работа показва, че ХБН намалява качеството на костите, включително микроархитектурата и свойствата на костния материал, и че загубата на качество на костта с възрастта се усложнява от ХБН. Тези констатации могат да помогнат да се съгласува защо костната маса не предсказва последователно фрактури в популацията на ХБН, както и защо по-възрастните индивиди с ХБН са изложени на висок риск от чупливост.

Ключови думи: ХБН; стареене; качество на костите; чупливост на костите; колаген

1. Въведение

Хроничното бъбречно заболяване (CKD) засяга около 23-36 процента от възрастното население и е свързано с повишен риск от фрактури и смъртност, свързана с фрактури (1,2). Въпреки че загубата на костна маса (измерена чрез рентгенова абсорбциометрия с двойна енергия) предсказва бъдещи фрактури на всички етапи на ХБН, по-възрастните хора с ниска костна маса и ХБН са по-склонни да се счупят в сравнение с тези с ниска костна маса и здрав бъбрек функция (3). Рискът от костни фрактури обикновено се повишава при ХБН в сравнение с ефектите само на стареенето (4,5). Например, в тригодишно проучване, индивиди на възраст 40-65 години с умерена до краен стадий на ХБН са имали 1,7-5,1-кратно увеличение на разпространението на фрактури в сравнение с контролите, съответстващи на възрастта, докато за тези на възраст над 65 години ХБН продължава да увеличава честотата на фрактура 1,8 – 4,3 пъти над контролите (4).

микроархитектурата на трабекуларната кост (10, 13), докато други не съобщават за промени в сравнение с контролата (9). Въпреки че тези проучвания се различават по вида и щама на гризачите, метода на предизвикване на ХБН и измерените резултати, тези предишни разработки предоставят съществени доказателства, че ХБН променя качеството на костите.

Остават няколко ключови въпроса за това как качеството на костта се влошава от ХБН, степента, до която намаленото качество на костта се дължи на дефекти в минералната спрямо органичната фаза, както и как промените в качеството на костта влияят върху загубата на здравина на костната тъкан. Трябва да се отбележи, че въпреки че няколко проучвания са идентифицирали промени в кръстосаните връзки на колагена и зрелостта на тъканите (т.е. времето след образуването на кост) при ХБН, не е известно дали наномащабните взаимодействия на колагеновите влакна по време на механично натоварване се променят от ХБН и дали тези промени в наномеханиката влияят върху цялото - здравина на костите (11, 12). По-общо казано, все още не е докладвана оценка на промените в качеството и механиката на костите в отговор на ХБН от скали на дължината на нано до цялата кост.

Ролята на остеоцита за повлияване на качеството на костите при ХБН и стареенето също е несигурна. Тези клетки се държат необичайно чрез значително повишаване на експресията на FGF23 в началото на прогресията на ХБН (7, 14). Остеоцитът е от съществено значение за поддържане на качеството на костния материал и за регулиране на съпротивлението на костни фрактури (15–17). Здравето на остеоцитите се показва отчасти чрез лакунарната морфология. Лакунарната морфология на остеоцита се променя, когато остеоцитът участва в минералната хомеостаза, както при лактация (18, 19) и x-свързана хипофосфатемия (20). Лакунарните геометрии също могат да станат по-малки, по-редки и по-неподредени както с остаряването, така и с неизползването (21-23). Промените в лакунарната морфология на остеоцитите с ХБН имат потенциала да повлияят на деформациите на костната тъкан, структурната цялост и механочувствителността на остеоцитите (24). Все още не е известно дали ХБН засяга лакунарната морфология на остеоцитите и дали тази връзка може да се промени с напредване на възрастта.

Въпреки че по-често срещаните популации с ХБН включват по-възрастни хора, комбинираните ефекти на стареенето и ХБН върху качеството на костите все още не са проучени. Предишна работа е установила, че стареенето намалява модула на цялата кост, силата и работата до счупване при огъване (25), устойчивостта на счупване (26), микроархитектурата на кортикалната и трабекуларната кост (27–29) и увеличава минералното съдържание и зрелостта (30, 31). Тези промени в костта със стареенето са объркващи и се появяват в множество мащаби на дължина, като механиката на цялата кост се влияе от промените в материала на костната тъкан, както и от структурата. Свързаните с възрастта промени в костния материал и обема на костта са отчасти повлияни от намален обмен на костна тъкан (т.е. по-висока зрялост на тъканта) и съответно отрицателен баланс в костната многоклетъчна единица (30,32). Такива промени, свързани с възрастта, противопоставят анормалния костен обмен и минерализация, които често се появяват при ХБН. Загубата на микроархитектура е свързана с отрицателен баланс, който се очаква с напредването на възрастта и може да възникне при ХБН (9, 10, 13). Въпреки това, зрелостта на тъканите нараства с напредване на възрастта и намалява в контекста на ХБН с висок оборот. Съществуват значителни пропуски в разбирането на основата на крехкостта на костите при ХБН, както и как стареенето и ХБН, когато се комбинират, намаляват качеството на костите и устойчивостта на фрактури. Изясняването на комбинираните ефекти на стареенето и ХБН върху качеството на костите би запълнило тези пропуски в знанията.

Целта на това проучване беше да се изследват комбинираните влияния на стареенето и ХБН върху качеството на костите, от нано-през мащабите на дължината на цялата кост, в хирургичен модел на ХБН при стареещи мишки. Ние предположихме, че ХБН и стареенето намаляват качеството на костите, но че тези два фактора биха повлияли по различен начин и отрицателно на свойствата на материала на костната тъкан. Освен това предположихме, че комбинираните ефекти от старостта и ХБН са най-вредни за качеството на костите. За да оценим тези хипотези, ние оценихме качеството на костите, включително кортикална и трабекуларна микроархитектура и свойства на кортикалния костен материал, при млади възрастни чрез стари мишки с ХБН, предизвикана от 5/6-та нефректомия (5/6 Nx) или фалшиви операции.

Относно цистанче

2. Методи

2.1 Животински модел и подготовка на пробата

Мъжки мишки C57Bl/6 бяха получени от колония на Националния институт за стареене на възраст 3, 15 и 21 месеца. Мишките бяха държани на цикъл 12-h светло/12-h тъмно, настанени индивидуално в поликарбонатни клетки със стандартна постелка, хранени с храна Harlan Teklad 2920X и им беше разрешен свободен достъп до вода. За всяка от трите възрасти, мишките бяха разпределени на случаен принцип в CKD или Sham групи. Групата с CKD е подложена на двуетапна нефректомия. Тези процедури бяха описани по-рано (33). Накратко, левият бъбрек беше достъпен чрез среден разрез, декапсулиран, за да се избегне увреждане на уретера и надбъбречните жлези, и след това отстранен. Една седмица по-късно десният бъбрек беше декапсулиран и горният и долният полюс бяха частично резектирани, за да се постигне 2/3 намаление на бъбречния обем. Контролната група получи фалшиви процедури (т.е. разрез по средна линия без увреждане на бъбреците) в рамките на същия период от време. Мишките бяха анестезирани с 1,5 процента изофлуран по време на процедурите. Следоперативна доза бупренорфин (0,5 mg/kg) се прилага след тези процедури и преди възстановяването, както и на всеки 12 часа през следващите два дни. Мишките бяха евтаназирани след три месеца чрез CO2 и цервикална дислокация. В крайната точка на проучването мишките са били 6 (млад възрастен; фалшиво: n=6, ХБН: n=7), 18 (на средна възраст; фалшиво: n=8; ХБН: n { {25}}) и 24 (стари; фалшиво: n=8; ХБН: n=8) месечна възраст. Всички процедури за животни бяха одобрени от Комитета за институционална употреба и грижа за животните към Университета на Колорадо в Денвър.

Лявата бедрена кост, тибия, раменна кост, радиус и лакътна кост бяха запазени за анализи на качеството на костите. Лявата тибия се съхранява в 70 процента етанол при 4 градуса С. Всички други кости се увиват с навлажнена с фосфат марля и се съхраняват при -20 градуса С до анализа.

2.2 Химични изследвания на серума и урината

Серумните биохимични анализи са извършени на кръв и урина, събрани в крайната точка на изследването. Уреята в серума и урината, както и серумните концентрации на фосфат, калций и ПТХ, бяха измерени съгласно указанията на производителя (съответно BioAssays Systems и Immunotropics).

2.3 микроКТ

Микроархитектурата беше оценена за кортикалната кост на средната бедрена кост и трабекуларната кост на проксималната тибия с помощта на microCT за всички изследвани мишки (μCT, Scanco 80, Scanco AG, Basserdorf, Швейцария). Бедрените кости се размразяват за една нощ при 4 градуса С преди сканиране. Сканирането беше извършено с размер на воксела 10 µm, следвайки методите за придобиване и анализ, описани по-горе (10). Кортикалните параметри включват костен обем/общ обем (BV/TV), костна площ/обща площ (BA/TA), кортикална порьозност (Ct. Po), кортикална дебелина (Ct. Th), обща минерална плътност (TMD), момент на инерцията около медиално-латералната ос (IML), разстоянието между центроида и повърхността на костта в предно-задна посока (C) и полярния момент на инерция (pMOI) (34). Трабекуларните параметри включват трабекуларен брой (Tb.N), трабекуларно разстояние (Tb.Sp), трабекуларна дебелина (Tb.Th), костен обем (BV), общ обем (TV), костен обем/общ обем (BV/TV), обемна костна минерална плътност (vBMD) и плътност на свързаност (Conn.D). След microCT, бедрените кости отново се увиват в навлажнена с фосфат марля и се съхраняват при -20 градуса C за последващо механично характеризиране на цялата кост.

2.4 Механични и материални свойства на цялата кост

След microCT, левите бедрени кости претърпяха триточково огъване (Insight II Material Testing System, 250 N load cell, MTS Systems Corporation, Eden Prairie MN). Бедрените кости бяха отстранени от марля, навлажнена с фосфатен буфер и физиологичен разтвор, и тествани до повреда, използвайки скорост на отклонение от 5 mm/min върху персонализирана наковалня с 8 mm разстояние. Кривите на натоварване-изместване бяха анализирани за механични свойства, включително твърдост, максимално натоварване, изместване при максимално натоварване, енергия при максимално натоварване, натоварване при провлачване, изместване при провлачване, енергия при провлачване, изместване след провлачване, натоварване при счупване, изместване при счупване, и енергия при счупване. Точката на провлачване се определя като пресечната точка на секуща линия, начертана с 10 процента намаление на наклона от първоначалната допирателна коравина и кривата натоварване-преместване. Използвайки IML и C от µCT, ние оценихме свойствата на материала, включително модул на огъване, напрежение на провлачване, крайно напрежение и якост от данните за триточково огъване, използвайки стандартни уравнения за огъване на лъча, приложени към бедрената кост на мишката (35).

2.5 Анализ с крайни елементи на твърдостта на проксималната тибия

За да се изследва механичното поведение на костта, беше използвано изчислително моделиране с крайни елементи (FE) за симулиране на аксиална компресия на проксималната тибия във всеки модел. Проксималната тибия е избрана, тъй като пищяла е носеща структура при мишки и е често срещано място за анализ на костните свойства с помощта на microCT. Данните за изображения на MicroCT на проксималната тибия (кортикална и трабекуларна кост) бяха експортирани като 16-битови срезове на DICOM изображение за по-нататъшно сегментиране и конструиране на специфичните за субекта модели с крайни елементи. Данните за изображения DICOM бяха импортирани в Mimics Innovation Suite 18 (Materialise, Leuven Белгия) за обработка и сегментиране на изображения, за да се създаде съответен FE модел за същата проксимална област на пищяла на костта, анализирана с microCT. Костната тъкан беше отделена от другите тъкани в изображението чрез използване на праг на сегментиране от 313 mg/cm3 (36,37). След като костната област беше сегментирана, специфичната за субекта FE мрежа беше изнесена, която съдържаше както кортикалните, така и трабекуларните отделения. FE моделът използва хексаедрична FE мрежа с размер на изотропния елемент 10 µm.

FE мрежите, експортирани от Mimics, бяха импортирани в ABAQUS CAE 6.9 за присвояване на свойствата на материала, прилагане на гранични условия и симулиране на аксиално механично натоварване. Свойствата на материала на костта бяха посочени като хомогенни, изотропни и линейно еластични (модул на Юнг, E= 10 GPa и съотношение на Поасон, v= 0.3). За да се симулира аксиална компресия, фиксирано гранично условие беше приложено към възлите на долната повърхност на костта и изместване надолу от 5 μm (0.5 процента от височината на костния сегмент) беше приложено към възлите на горната повърхност на костта. Костната структурна твърдост се изчислява като силата на реакция (N) върху приложеното изместване.

2.6 Рентгеново разсейване под малък ъгъл

Деформацията на колагеновите фибрили по време на тестване на едноосно напрежение на комбинирани лакътни кости и радиуси беше измерена с помощта на синхротронно рентгеново разсейване с малък ъгъл (SAXS) при лъчева линия 7.3.3 при Advanced Light Source (LBNL, Berkeley, CA) (38). Костите бяха закрепени с лепило и шкурка между скобите в дисталния и проксималния им край. Тестовете за устойчивост на опън бяха проведени с TST350 етап за изпитване на опън (Linkam Scientific Inc.) върху хидратирани проби при скорост на изместване от 2,5 µm/s. По време на тестването диафизата на костта беше изложена на рентгенови лъчи от 10 keV за 0,1 s на всеки 5 s. Общата радиация беше ограничена до 30 kGy, за да се смекчат всякакви ефекти на експозиция върху механичните характеристики (39). Колагеновото d-разстояние, представително за повтарящите се области на празнини в суперструктурата на колагена, се появява като виден Bragg дифракционен пик в модела SAXS. Специфичната за колаген деформация по време на изпитването на опън беше измерена чрез проследяване на изместването в позициите на пика на Bragg при нарастващи количества натоварване. Използвайки персонализирана програма LabVIEW, тази прогресивна промяна в модела на разсейване беше преобразувана в напрежение на колагенови фибрили чрез нормализиране към d-разстоянието при нулеви натоварвания, както беше обсъдено по-рано (40). Тъканното напрежение се изчислява от силите, записани на етапа на тестване, разделени на измерванията на площта на напречното сечение на тестваните кости. Сумираните площи на напречното сечение на лакътната кост и радиуса бяха измерени от средната точка на дължината на лакътната кост с помощта на отразяващо изображение в светло поле (Leica DM, 20x обектив) и количествено определени с ImageJ (41). Щамовете на цялата костна тъкан бяха получени с персонализиран пакет MATLAB за корелация на цифрови изображения (DIC), който проследяваше и измерваше разстоянията между мрежа от точки, насложени върху костния образец по време на тестването. Получените DIC щамове бяха комбинирани с напрежения на ниво тъкан, за да се генерират стандартни криви напрежение-деформация. Линейният еластичен модул беше извлечен от тези криви, както и напрежението на провлачване и деформацията на провлачване, както е определено от 0,2 процента отместена точка на провлачване. Щамът на тъканта беше съпоставен по време с щамовете на колаген от SAXS при добив и максимално напрежение, за да се направят сравнения на компоненти, носещи напрежение, с кост по време на деформация.

Контролиран анализ на композита улна/радиус по време на теста за опън беше извършен чрез съпоставяне на напрежението на ниво тъкан от изображенията на цифровата камера с напрежението, изчислено от моделите на разсейване на рентгеновите лъчи. Цифровите видеоклипове бяха прегледани независимо от двама обучени наблюдатели за счупване и приплъзване на тъкан (напр. приплъзване между лакътната кост и радиуса). След това тези събития бяха съпоставени във времето с кривите на деформация и всички данни за напрежение-деформация бяха съкратени до първото счупване. В анализа са взети предвид само данните до първата фрактура. Пробите бяха изключени, ако имаше приплъзване между хващанията на опън и костите или ако имаше приплъзване между радиуса, настъпило преди първата фрактура. Пробите също бяха изключени, ако имаше лошо съответствие между кривите на деформация на тъканта и SAXS, което показва, че петното на лъча е фокусирано върху лакътната кост, но по-голямата част от напрежението е прехвърлено към радиуса.

2.7 Съответстваща на място оценка на състава и модула на костната тъкан в микромащаб

След триточково огъване бедрените кости бяха хистологично дехидратирани в градуирана серия от етанол, изчистени в ацетон и вградени в PMMA. Вградените кости бяха разрязани в средната част на бедрената кост с помощта на нискоскоростен диамантен трион (Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Образците бяха шлифовани с помощта на мокра хартия от силициев карбид (60{{10}} и 1200 песъчинки) и след това полирани с пасти от алуминиев оксид (9, 5, 3, 1, 0.1, 0.05 µm) и фини дрехи от коприна (South Bay Technologies, Сан Клементе, Калифорния) до крайно покритие от 0,05 µm. Пробите се обработват с ултразвук между всяка стъпка на полиране.

Рамановата спектроскопия беше извършена в карти, обхващащи кортикалната дебелина с персонализирана система: система за конфокална микроскопия Renishaw inVia (Renishaw, Wotton-under-Edge, Gloucestershire, UK), използваща лазерна светлина с дължина на вълната 785 nm, която беше насочена през фиброоптични кабели към 5{ {4}}x обектив (NA 0,75), монтиран на Z-стъпало на наноиндентор (TI 950, Hysitron, Minneapolis, MN). За всяко местоположение бяха събрани 10 натрупвания на 10-втори експозиции. Редове от три вдлъбнатини, разположени на 15 µm една от друга, се простираха на всеки 10 µm през кортикалната дебелина.

Флуоресцентната базова линия беше извадена с полиномно напасване от 11-ти ред и космическите лъчи бяха отстранени с помощта на софтуера Renishaw WIRE. Референтен PMMA спектър беше изваден от всяка точка с помощта на персонализиран MATLAB код. След това тези коригирани спектри бяха анализирани за пролин (855 cm-1), ν1 фосфат (961 cm-1) и ν1 карбонат (1071 cm-1). След това се изчисляват съотношенията на площите за минерал: матрица (фосфат: пролин),

карбонат: фосфат и кристалност (обратна на полуширината при пълна максимална височина на v1 фосфатния пик).

След това се извършва наноиндентация на места, съответстващи на места, оценени с Раманова спектроскопия. Сферичен връх от 5 µm вдлъбна костта при 30 nm/s, докато се получи максимална дълбочина от 500 nm. Тази дълбочина се поддържа в продължение на 120 s, за да се позволи разсейване на вискоеластична енергия. Намаленият модул (Er) беше изчислен с помощта на анализа на Oliver-Pharr, като се вземат предвид първите 45 процента от кривата на разтоварване (42, 43).

2.8 Високоефективна течна хроматография

Раменната кост беше дисектирана от всички меки тъкани и костният мозък беше отстранен с вода. Humeri бяха C и след това центрофугирани, за да се изпари излишната HCI. Филтрираните проби бяха разредени 1:5 в 10 процента ацетонитрил и 0.05 процента хептафлуормаслена киселина (HFBA), заредени в Gemini-NX C{{7} с обратна фаза } колона (Phenomenex, Torrance, CA) и анализирани за напречни връзки хидроксилизилпиридинолин (НР), лизил пиридинолин (LP) и пентозидин в съответствие с методите, описани от Bank etal (44). Подробности за HPLC системата (модел 126, Beckman-Coulter, Fullerton, CA) са описани подробно в Oren etal(45). Разделянето на колагеновите омрежвания включваше следния протокол: 15 минути. от разтворителя, съдържащ 24 процента метанол и 0.15 процента HFBA, 10 min. от разтворителя, съдържащ 40 процента метанол и 0,05 процента HFBA, и 10 минути. от разтворителя, съдържащ 75 процента ацетонитрил и 0,1 процента HFBA. Колоната се уравновесява в 24 процента метанол и 0.15 процента HFBA за най-малко 10 минути. между пробите. Пиковете на омрежване на колаген се измерват с флуоресцентен детектор (FP1520, JASCO; Easton, ML). Дължините на вълните на възбуждане и излъчване бяха съответно 295 nm и 400 nm за HP и LP. Пентозидинът се открива при 328 nm възбуждане и 378 nm излъчване. Калибрационните криви бяха генерирани от измерените интензитети на пет разреждания на калибратор, съдържащ пречистени HP и LP (Quidel Corporation) и пентозидин (L. Sayre, Case Western Reserve University, Cleveland, OH).

След това концентрациите на омрежване се нормализират до концентрацията на колаген. Колагенът се оценява от концентрацията на хидроксипролин в пробата, анализирана за напречни връзки. Аликвотна част от пробата, анализирана за омрежване, се разрежда 1:50 и се дериватизира с 9-флуоронилметил хлороформат (46). Следните разтвори бяха използвани за аминокиселинния протокол (1) 20 mM лимонена киселина, 5 mM тетраметиламониев хлорид и 0.01 процента натриев азид, рН 2,85; (2) 20 mM натриев ацетат, 5 mM тетраметиламониев хлорид и 0,01 процента натриев азид, рН 4,5, и (3) 100 процента ацетонитрил. Профилът на градиентно елуиране е следният: от 0–11,5 min. градиент от 75 процента (1) / 25 процента (3) до 60 процента (1)/40 процента (3), на 13 минути. превключете на 64 процента (2) / 36 процента (1), от 13,1 −18 минути. градиент от 64 процента (2) / 36 процента (3) до 62 процента (2) / 38 процента (3), след това на 18 мин. преминаване към 25 процента (2) / 75 процента (3) до края на цикъла на 23 минути. Колоната беше уравновесена в 75 процента (1) / 25 процента (3) за най-малко 10 минути. между пробите. Пиковете на аминокиселините се наблюдават при 254 nm възбуждане и 630 nm излъчване. Създава се калибровъчна крива от пет разреждания на аминокиселинен стандарт, приготвен от колагенов хидролизат (Sigma-Aldrich #A9531, St. Louis, Missouri). Колагенът има постоянна концентрация на хидроксипролин, като по този начин концентрацията на хидроксипролин се преобразува в концентрация на колаген (285 mol хидроксипролин на mol колаген).

2.9 Измерване на флуоресцентни AGEs

Флуоресцентните AGE във всеки образец бяха определени чрез флуорометричен анализ, който сравнява общата ендогенна флуоресценция на костната тъкан с хининов стандарт. Аликвотна част от хидролизираната кост, ресуспендирана с вътрешния стандарт за HPLC, се разрежда с DI вода до концентрация от 1.6 ug кост/ml разтвор. Флуоресценцията на разредения хидролизат и серийно разреден изходен разтвор на хинин (изходен разтвор: 10 ug хинин/ml 0,1 N H2SO4) бяха измерени в 96-плака с ямки (Продукт #3370, Corning) с помощта на многорежимен четец на микроплаки (Synergy H1, BioTek) при възбуждане от 360 nm и емисия от 460 nm.

Масовите флуоресцентни AGEs се нормализират до съдържанието на колаген в костната тъкан, като се използва колориметричен анализ на хидроксипролин. Накратко, хидролизатът беше допълнително разреден до μ/ed изходен разтвор на хидроксипролин (200 µg L-хидроксипролин/ml 0,001 N HCI). Хлорамин-Т се добавя към разредения хидролизат за иницииране на реакцията и разтворите се инкубират в продължение на 20 минути. при стайна температура. Реакцията се спира чрез добавяне на 3.15 М перхлорна киселина и след 5- min. инкубационен период при стайна температура, беше добавен р-диметиламинобензалдехид. След това разтворът се инкубира във водна баня при 60 градуса за 20 минути, след което се охлажда в студена вода на тъмно до стайна температура. Абсорбцията на пробите и стандартите се измерва при дължина на вълната 570 nm с помощта на четец на микроплаки. Флуоресцентните AGEs се отчитат в единици ng хининова флуоресценция/mg колаген.

2.10 3D остеоцитни лакунарни геометрии

Лявата тибия беше хистологично дехидратирана в градуирана серия от етанол и оцветена с 1% основен фуксин (47). След това тибиите се изчистват с ацетон и се поставят в поли(метил)метакрилат (PMMA). Вградените проби бяха напречно нарязани на 1 mm проксимално на кръстовището тибия-фибула с нискоскоростен трион (Buehler Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). От дисталния участък се приготвя шлифован участък с целева дебелина 200 um (Exakt 400 CS, Exakt Technologies Inc, Оклахома Сити, OK).

Изобразяването на наземни участъци се извършва при предаване с Zeiss LSM 710 конфокален лазерен сканиращ микроскоп, с 555 nm възбуждане, 568–1000 nm лентов филтър и 40x маслен имерсионен обектив. Разделителната способност в посоки x, y и z беше съответно 0,447 и 0,493 µm. Вертикални z-стекове бяха получени през видимия диапазон на остеоцитни лакуни (50–100 µm дълбочина на изображението). 3D изображения на остеоцитни лакуни бяха конструирани и анализирани за лакунарни геометрии с помощта на програмата с отворен код 3D Osteocyte Lacunae Analysis и MATLAB v17 (21 ). Накратко, всяко 2D изображение в рамките на z-стека беше автоматично сегментирано, за да се дефинират празнини, които след това бяха реконструирани в 3D. Въз основа на най-подходящи елипсоиди, лакуните бяха анализирани за обем, повърхностна площ, най-близък център на масата, сферичност (съотношение на най-малкия към най-големия лакунарен радиус, където 1=сфера), обхват тита (абсолютна стойност на разликата на 3D вектор, описващ посоката на главната ос от средната посока на всички празнини), сплесканост (−1=перфектно изпъкнало, 1=перфектно сплескано) и лакунарна числена плътност (брой остеоцити/обем на изображението).

2.11 Анализ на данни

Данните са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност. За всеки масив от Раманова спектроскопия и наноиндентация бяха осреднени, така че всяка кост да има една стойност за всяка микромащабна мярка. По подобен начин, стандартно отклонение беше изчислено за всеки масив, за да се оцени пространствената вариабилност на костната тъкан в микромащаб. Ефектите от стареенето и ХБН, както и тяхното взаимодействие, бяха тествани с двупосочен ANOVA за всички параметри. Зависимите променливи бяха трансформирани, ако е необходимо, за да се удовлетворят предположенията за остатъчна нормалност и хомоскедастичност. Значимостта за основните ефекти беше зададена априори на p < 0.05.="" в="" случай="" на="" значително="" взаимодействие="" между="" възрастта="" и="" хбн,="" беше="" извършено="" пост-хок="" тестване,="" за="" да="" се="" тества="" ефекта="" на="" хбн="" във="" всяка="" възраст.="" семейна="" грешка="" беше="" контролирана="" за="" тези="" пост-хок="" анализи="" с="" помощта="" на="" алфа,="" коригирана="" с="" bonferroni,="" което="" доведе="" до="" критична="" алфа="" от="" 0.05="" 3="0.017." резултатите,="" при="" които="" сравненията="" на="" прости="" ефекти="" имат="" p-стойности="" между="" 0,017="" и="" 0,05,="" се="" тълкуват="" като="">

Беше извършена линейна регресия, за да се провери дали измерванията на качеството на костите в наномикромащаб предсказват механичната издръжливост на цялата кост. Тъй като механичните свойства на цялата кост показват силна зависимост от възрастта, тази линейна регресия включва възрастта като ковариата. Корелациите на Spearman също бяха оценени за геометрията на лакунарните остеоцити и измерванията от химията на серума и урината, както и за PTH и мерките за качество на костта в микромащаб. Значимостта за линейни регресии и корелации беше определена на p < 0.05.="" minitab="" (v17)="" беше="" използван="" за="" всички="">

Отклоненията бяха идентифицирани чрез тест на Grubbs (ниво на значимост=0.05). Няколко отклонения бяха изключени от анализите на серумния калций и урея. Отклонение за всеки 24-месец Sham и CKD беше изключено за всички анализи на кортикална и трабекуларна микроархитектура, както и FEA анализ. Една извънредна стойност беше изключена от 24-месечната група CKD за анализ на LP и една извънредна стойност беше изключена за 24-месечната група на Sham за якост, работа до счупване и изместване след провлачване. Открит е един отделен 24--месечен отклонение на Sham за стандартното отклонение на модула на наноиндентация и стандартното отклонение на кристалността.