Част 1: Цистанозид от Cistanche Herba облекчава причинените от хипоксия репродуктивни увреждания при мъжете чрез потискане на оксидативния стрес
Mar 26, 2022
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Резюме:Все повече доказателства показват, че хипоксията е причина за мъжко безплодие и хипоксията може да е свързана с оксидативен стрес (ОС). Цистанозид (Cis) е фенилетаноиден гликозид, който може да бъде извлечен от CistanchesHerba и притежава различни биологични функции. Това проучване имаше за цел да изследва защитните ефекти на Cis върху репродуктивните увреждания, предизвикани от хипоксия, и да изследва специфичните основни механизми. Бяха конструирани експериментални модели на клетъчна и животинска хипоксия и защитните ефекти на различни подтипове на Cis върху мъжката репродуктивна система бяха оценени както in vitro, така и in vivo. Резултатите показват, че хипоксията значително намалява жизнеспособността на GC-1 клетките чрез спиране на клетъчния цикъл и активиране на апоптоза, които са свързани с повишена ОС. Освен това, Cis показва силни антиоксидантни ефекти както in vitro, така и in vivo, значително възстановявайки активността на антиоксидантните ензими и понижаване на нивата на реактивни кислородни видове (ROS), като същевременно повишава жизнеспособността на клетките и намалява апоптозата. Важно е, че подтиповете Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C и Cis-H), изследвани тук, всички показват определени антиоксидантни ефекти, сред които ефектите на Cis-B са най-значими. Това проучване демонстрира, че Cis значително отслабва вредните ефекти на индуцираната от хипоксия OS чрез повлияване на активността на антиоксидантните ензими в тестисите и GC-1клетките.
Ключови думи: цистанозид, хипобарна хипоксия, мъжко безплодие, оксидативен стрес, репродуктивна защита
прясно растение цистанче
Въведение
Понастоящем приблизително 48,5 милиона (15 процента) двойки в репродуктивна възраст по света са засегнати от безплодие [1], сред които 40-50 процента от случаите се приписват на мъжко безплодие [2], състояние, което е силно свързано с околната среда и начина на живот фактори. Доказателствата сочат, че чувствителността на mammaliantestis към ниско кислородно налягане е причинен фактор за някои форми на мъжко безплодие [3]. Както е показано в предишни проучвания, сперматогенезата е нарушена и намалена при излагане на хипобарна хипоксия [4-7].
За да се изследва основният механизъм, проучванията показват, че излагането на хипобарна хипоксия увеличава производството на реактивни кислородни видове (ROS) [8, 9]. ROS играе важна роля в мъжката репродуктивна система. При ниски нива те са необходими за капацитета на спермата, акрозомната реакция и сливането на сперматозоиди и яйцеклетки [10]. Въпреки това, прекомерният ROS може да предизвика увреждане на ядрената/митохондриалната ДНК на сперматозоидите и пероксидативно увреждане на плазмената мембрана, които от своя страна са основни етиологични фактори за повишен риск от мъжко безплодие [11, 12]. По този начин натрупването на ROS, предизвикано от хипоксия, може да бъде една от причините за мъжкото безплодие.
Cistanches Herba, многогодишно паразитно лечебно растение, е широко разпространено в сухите райони [13] и се използва широко поради своите фармакологични дейности [14-17]. Сред всички ефективни съставки на Cistanches Herba, PhGs се считат за основен активен компонент. Към днешна дата 34 PhG са изолирани от растения Cistanches [13]. Цистанозид (Cis), активен PhG, изолиран от Cistanches Herba, е получил внимание заради антиоксидантните си ефекти.
Като се имат предвид антиоксидантните ефекти на Cis и ролята на ROS при мъжко безплодие, предизвикано от хипоксия, Cis се счита за потенциален кандидат за лекарство за лечение на мъжко безплодие, предизвикано от хипоксия. Въпреки това, малко доклади са насочени към антиоксидантните ефекти на Cis, извлечен от Cistanches Herba при лечението на индуцирано от хипоксия мъжко безплодие или включените сигнални пътища. В това проучване бяха конструирани in vitro и in vivo експериментални модели на хипоксия и бяха оценени компонентите на ефектите на различни Cis.
Cistanche има aрепродуктивен производствен ефект.
Материали и методи
Клетъчна култура и реактив
Клетъчната линия на сперматогония на мишка GC-1spg(GC-1) е закупена от American TypeCulture Collection (ATCC) и е култивирана в DMEM (Invitrogen, САЩ), допълнена с 10 процента fetalbovine серум, 1 процент L- глутамин (100 mM), пеницилин (100 U/mL) и стрептомицин (100 ug/mL) при 37 градуса в овлажнен инкубатор с 5 процента CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) е закупен от Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Китай).
Анализ на клетъчната жизнеспособност
Клетъчната жизнеспособност беше тествана чрез анализ на комплект за броене на клетки{{0}}(CCK-8). Накратко, GC-1 клетки се посяват в 96-плаки с ямки при 1,5×103 на ямка и се култивират при 37 градуса за 24 часа. След това клетките бяха третирани с различни концентрации (20 процента, 15 процента, 10 процента, 5 процента) кислород или различни концентрации (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) на Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C , Cis-H) за необходимото време. След това супернатантата беше изхвърлена и клетъчната жизнеспособност беше открита с помощта на комплект CCK-8 (DojindoJapan). Абсорбцията на всяка ямка се измерва при 450 nm с помощта на четец на микроплаки (BioRad USA). Накрая жизнеспособността на клетките се изчислява по следната формула:
Клетъчна жизнеспособност=(ODекспериментална група - OD празна група)/(ODконтролна група - OD празна група) × 100 процента.
Western blot анализ
Събраните клетки или тъкани се хомогенизират в RIPA буфер за извличане на протеини (RIPA BeyotimeКитай; Коктейл Рош Швейцария). Супернатантите бяха събрани и концентрацията на протеини беше тествана чрез BCA метода (Beyotime). Приблизително 40 ug от извлечените протеини от всяка проба бяха разделени чрез SDS-PAGE и електротрансферирани върху нитроцелулозна (NC) филтърна мембрана (BeyotimeChina). NC филтърните мембрани се блокират с 5 процента обезмаслено мляко за 1,5 часа и се инкубират със специфични антитела (анти-PARP 1:1000, анти-Caspase-3 1:1000, анти-Bcl-2 1:1000, анти-Bax1: 1000, анти-GAPDH 1:1000; всички антитела са закупени от Cell Signaling Technology, САЩ) за една нощ при 4 градуса. След това всички NC мембрани се инкубират със съответното вторично антитяло, конюгирано с пероксидаза от хрян, за 1, 5 часа при стайна температура и се изобразяват със система за изображения (Tannon, Китай).
прахообразни добавки с екстракт от цистанче
Откриване на клетъчен цикъл
Проведен е поточен цитометричен анализ (FCM) за анализ на клетъчния цикъл. Клетките се третират при различни условия в продължение на 72 часа и се събират. След това клетките се промиват с PBS, фиксират се в 75 процента етанол и се оцветяват с пропидиумйодид (PI). За всяка проба, 1 × 104 клетки бяха събрани и анализирани чрез поточна цитометрия (FACSCalibur, BD Biosciences). След това бяха изчислени съотношението на G1/S/G2 фазови клетки и индексът на пролиферация [Фаза (S плюс G2)/Фаза (G1 плюс S плюс G2) × 100 процента].
Ki{0}} оцветяване
Клетките се култивират в конфокална чиния и се третират с хипоксия или различни подтипове на Cis за 72 часа. След фиксиране на всички клетки с 4 процента параформалдехид, те бяха инкубирани с анти-Ki-67 антитяло (1:200, Cell Signaling Technology). След това всички клетки бяха инкубирани със съответното CY-3-конюгирано анти-заешко IgG антитяло (1:200, Boster, Китай) и DAPI разтвор (1.0ug/mL, Beyotime). Флуоресценцията се наблюдава с конфокален микроскоп Fluoview FV1000 (Olympus, Япония).
Откриване на ROS
FCM беше въведен за измерване на вътреклетъчните нива на ROS с помощта на DCFH-DA. Суспендираните клетки се посяват в 6-плаки с гнезда и се подлагат на различни обработки. След 72 часа лечение, клетките се суспендират в DMEM без серум с 10 μM DCFH-DA (Beyotime). След това съдържанието на ROS се определя чрез флуоресцентно-активирано клетъчно сортиране на Beckman Coulter Flow CytometrySystem с дължина на вълната на възбуждане от 488 nm и дължина на вълната на излъчване от 525 nm [18].
Определяне на липидна пероксидация (LPO)
Тестът за реактивни вещества с тиобарбитурова киселина (TBARS) беше извършен за откриване на LPO. Всички работни стъпки бяха извършени в съответствие с инструкциите (Sigma USA). Концентрациите бяха изчислени с помощта на моларен коефициент на екстинкция от 1,56 × 105/(M·cm), който беше получен с използване на малондиалдехид като стандарт. Резултатите се изразяват като nmol MDA еквиваленти/mg протеин.
Определяне на ензимните активности
Ензимните активности бяха тествани с помощта на комплекти за анализ, включващи глутатион редуктаза (GR), глутатион пероксидаза (GPx) и супероксид дисмутаза (SOD). Всички оперативни стъпки бяха извършени в съответствие с приложените инструкции (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).
Животни и експериментален протокол
Зрели мъжки плъхове Wistar (180-220 g, 8 w) бяха получени от центъра за животни на Четвъртия военномедицински университет, Сиан, Китай. Разрешение за използване на животните беше получено от Комитета по етика на университета (Референтен номер : 20190506). Експериментът с животни е проведен в съответствие с университетските насоки за грижа и използване на лабораторни животни.
Всички плъхове бяха оставени да се адаптират приблизително една седмица преди началото на експеримента. След аклиматизация, плъховете се разпределят на случаен принцип в 6 групи с 5 животни във всяка група. Плъховете в контролната група бяха отгледани при нормално налягане (PO2: 20 процента; въздушно налягане: 101,3 kPa), докато плъховете в модела и третираните с Citret групи бяха отгледани в кислородна камера с ниско налягане (вътрешно налягане от 61,6 kPa, еквивалентно на височина от 4000 метра над морското равнище; PO2: 14,55 процента), за да симулира хипоксична среда на голяма надморска височина. Всички плъхове имаха свободен достъп до храна и вода в пластмасови клетки при 22±2 градуса и условия на влажност с автоматичен 12-h цикъл светлина/тъмнина. Плъховете в модела и групите, третирани с Cis, остават при хипобарични условия, но се прехвърлят в нормобарични условия на всеки 96 часа, по което време им се предоставя храна и вода и клетките се почистват. Продължителността на прехода от хипобарна към хипобарна е приблизително 2 часа. Всички третирани групи бяха третирани със съответния Cis (8 mg/kg/d) чрез орална сонда за 8 седмици, докато контролните и моделните плъхове бяха третирани с равен обем вода.
След 8 седмици плъховете бяха умъртвени под анестезия. Тестисите, епидидимисът и семенните мехурчета се отделят и претеглят и органният индекс се изчислява съгласно следната формула: (тегло на орган/тегло на животно) × 100 процента. Впоследствие бяха събрани сперматозоиди в епидидима и тяхната подвижност и акрозоменензимна активност бяха тествани. По подобен начин бяха събрани тестикуларни тъкани за хистопатологични изследвания и откриване на ROS, LPO и антиоксидантна ензимна активност.
Оценка на броя на живите сперматозоиди
Епидидимът се разрязва с хирургическа ножица и суспензията от сперма се приготвя в нормален физиологичен разтвор. За да се оцени скоростта на живите сперматозоиди, 5 μL от сперматозоидната суспензия се смесват внимателно с равен обем еозин-Ystain. След това спермата се преброява под светлинен микроскоп. Степента на живи сперматозоиди беше оценена чрез изчисляване както на оцветени (мъртва сперма), така и на неоцветени сперматозоиди (жива сперма).
Cistanche tubulosa прахувеличава нанива на живи сперматозоиди.
За повече информация, моля, щракнете тук.
Определяне на ензимната активност на акрозомата на спермата
Анализът на ензимната активност на акрозомата на сперматозоидите беше използван за оценка на акрозомеензимите на спермата [19]. Резултатите във всяка група бяха изчислени по следната формула: Акрозомна ензимна активност (μIU)=(ODExperimentgroup - ODBlank група)/(247.5×10) × 106.
Статистически анализ
Всички количествени данни са изразени като средна стойност ± SD и са анализирани с помощта на софтуера SPSS 22.0. Независимият t-тест на Student беше използван за сравняване на данните между две групи. *П< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">
