Част 1 Доксорубицин парадоксално облекчава индуцираното от тумор възпаление при млади мишки
Mar 11, 2022
Контакт: ali.ma@wecistanche.com
Ibrahim Y. Abdelgawad и др
Cistanche tubulosa предотвратява бъбречни заболявания, щракнете тук, за да получитепродукти и Cistanche herba
Резюме:
Доксорубицин(DOX) е един от най-широко използваните химиотерапевтични средства в детската онкология. DOX предизвиква възпалителен отговор в множество органи, което допринася за индуцирани от DOX неблагоприятни ефекти. Самият рак причинява възпаление, водещо до множество патологични състояния. Настоящото проучване изследва възпалителния отговор на DOX итумориизползвайки EL{0}}лимфом, имунокомпетентен модел на млада мишка. Четириседмични мъжки C57BL/6N мишки бяха инжектирани подкожно с EL4 лимфомни клетки (5 × 104 клетки/мишка) в хълбочната област, докатотумор-свободни мишки бяха инжектирани с носител. Три дни след имплантирането на тумора мишките без тумор и носещите тумор бяха инжектирани интраперитонеално с DOX (4 mg/kg/седмица) или физиологичен разтвор за 3 седмици. Една седмица след последната DOX инжекция, мишките бяха евтаназирани и сърцата, черния дроб,бъбреции серумът беше събран. Генната експресия и серумната концентрация на възпалителни маркери бяха количествено определени с помощта на PCR в реално време и съответно ELISA. Лечението с DOX е значително потиснатотуморрастеж при мишки с тумор и причинява значителна сърдечна атрофия при мишки без тумор и мишки с тумор. Туморите EL4 предизвикват силен възпалителен отговор в сърцето, черния дроб ибъбрек. Поразително е, че лечението с DOX облекчава индуцираното от тумор възпаление, което е парадоксално за ефекта на DOX при мишки без тумор, демонстрирайки широко различен ефект на лечението с DOX при мишки без тумор спрямо мишки, носещи тумор.
Ключови думи:доксорубицин; тумор; възпаление
1. Въведение
Доксорубицин (DOX), известен също като адриамицин, е един от най-широко използваните химиотерапевтични средства в педиатричната клинична онкология. Въпреки неговата ефективност при широк спектър от ракови заболявания, включително лимфом, левкемия и други педиатрични ракови заболявания, клиничната полезност на DOX е ограничена поради неговата токсичност за множество органи. В допълнение към изразената си кардиотоксичност [1], DOX е доказано, че причинява нефротоксичност [2–5] и хепатотоксичност [6]. Близо 50 процента от педиатричните пациенти с рак получават DOX като част от техния протокол за лечение [7]. Благодарение на ефективното лечение на рак, включително DOX, 5-годишната преживяемост на децата, диагностицирани с рак, се е увеличила от по-малко от 60 процента през 70-те години на миналия век до повече от 80 процента сега [8,9]. Това води до голяма популация от деца, преживели рак (CCSs), които се оценяват на около 400, 000. За съжаление CCS са изложени на висок риск от развитие на дългосрочни неблагоприятни ефекти, дължащи се на лечение на рак и/или самия рак.
Доказано е, че DOX предизвиква системно възпаление [10–12] и възпалителен отговор в множество органи, включително сърцето [13],бъбрек[14] и черен дроб [15]. Доказано е, че този възпалителен отговор насърчава DOX-индуцирани неблагоприятни ефекти [16,17]. Повечето от тези проучвания, съобщаващи за индуцирано от DOX възпаление, са проведени втумор-свободни животински модели, които не имитират клиничния сценарий, при който педиатрични пациенти с рак получават лечение с DOX след диагностициране на рак. Освен това е доказано, че ракът сам по себе си причинява възпаление, което допринася за множество патологични състояния, които могат да изострят индуцираната от DOX токсичност [18,19]. Следователно има критична необходимост от установяване на клинично значими животински модели за изследване на механизмите на индуцирана от DOX множествена органна токсичност при млади,тумор-раждащи мишки, за да изследват взаимодействието между лечението с DOX и самия рак, за да причини такава токсичност.
В настоящото проучване изследвахме възпалителния отговор към DOX и тумора в клинично значим сингенен EL{0}}лимфом, имунокомпетентен, ювенилен модел на мишка. Този модел е добре установен в изследванията на рака [20] и е клинично приложим за педиатрични пациенти с рак, тъй като лимфомът е един от най-често срещаните видове рак при деца [21]. Използването на сингенни мишки е критично за изследване на възпалителния отговор както на DOX, така и на тумора поради критичната роля на имунната система в патогенезата на възпалението [22]. Възрастта на мишките е била 5 седмици след прилагане на DOX, което е еквивалентно на юношеската възраст от 10–12 години при хора [23]. Освен това, приложените DOX дози са клинично значими за дозите, получавани от педиатрични пациенти с рак [24]. Първо определихме ефектите на DOX върху сърдечната функция при мишки без тумори и мишки, носещи тумор, тъй като индуцираната от DOX кардиотоксичност се счита за най-клинично значимия неблагоприятен ефект на DOX, наред с други токсичности за множество органи. След това определихме ефекта на DOX, тумора и тяхната комбинация върху няколко възпалителни маркера в сърцето, черния дроб ибъбрекв допълнение към серумните маркери за системно възпаление. Открихме, че наличието на тумор EL4 предизвиква силен възпалителен отговор в множество органи. Поразително е, че лечението с DOX облекчава индуцираното от тумор възпаление, което е парадоксално спрямо докладвания по-рано ефект на DOX при мишки без тумор.
2. Резултати
2.1. Ефекти на DOX върху телесното тегло и растежа на тумора
Настоящото проучване е проведено при млади мишки, за да имитира клиничния сценарий при педиатрични пациенти с рак, както е описано на Фигура 1А. Не е наблюдавана значима заболеваемост или смъртност нито при мишки без тумор, нито при мишки с тумор след излагане на DOX (4 mg/kg/седмица за 3 седмици), което е в съгласие с предишното ни проучване, използващо същата доза [25]. Излагането на млади хора на DOX обаче води до значително намалено наддаване на телесно тегло в сравнение с мишки, третирани с физиологичен разтвор (Фигура 1B). За да оценим противораковия ефект на DOX в този модел на EL4 лимфом, ние измерихме теглото на тумора след аутопсия на мишки. Хроничното приложение на DOX при мишки, носещи тумор, значително инхибира растежа на тумора EL4, демонстрирайки противораковия ефект на този режим на дозиране на DOX (Фигура 1C).
2.2. Ефект от прилагането на DOX върху сърдечната функция и морфометрията при мишки без тумор и мишки с тумор
DOX причинява сърдечна атрофия, както се вижда от значително намаляване на теглото на сърцето до дължината на тибията (HW/TL) (Фигура 1D). Забележително е, че сърдечната атрофия, причинена от DOX, е увеличена при мишки, носещи тумор (Фигура 1D). Ефектите на DOX, тумора и комбинацията от двете върху сърдечната функция и морфологията бяха оценени с помощта на трансторакална ехокардиография. Представителни изображения в M-режим от всяка група са показани на фигура 2A. Нито DOX, нито туморът са причинили значителни промени във фракцията на изтласкване (Фигура 2B), сърдечния дебит (Фигура 2C), фракционното скъсяване (Фигура 2D), масата на лявата камера (LV) (Фигура 2E), дебелината на задната стена на LV в диастола (LVPW' d) (Фигура 2F) или дебелина на задната стена на LV в систола (LVPW's) (Фигура 2G).
2.3. Ефект от прилагането на DOX върху генната експресия на възпалителни маркери в сърцето на мишки, носещи и свободни от тумор
Сърцата бяха събрани както от свободни от тумор, така и от носещи EL4 лимфом тумор млади C57BL/6N мишки една седмица след прилагането на 4 mg/kg/седмично DOX или еквивалентен обем стерилен физиологичен разтвор за 3 седмици (n=8 на група). След екстракцията на тоталната РНК, сърдечна иРНК експресия на възпалителни маркери интерлевкин-1 алфа (IL-1), интерлевкин-1 бета (IL-1), интерлевкин{{12} } (IL-6), тумор некрозис фактор-алфа (TNF-), възпалителни хемокини моноцитен хемоатрактантен протеин-1 (Mcp-1) и CX C мотив хемокини (Cxcl1, Cxcl9 и Cxcl10) се определят чрез PCR в реално време. Генната експресия на множество възпалителни маркери в сърцето е значително повишена при мишки, носещи тумор, в сравнение с мишки без тумор, включително провъзпалителните цитокини IL-1 (Фигура 3A), IL-1 ( Фигура 3B), IL-6 (Фигура 3C) и TNF- (Фигура 3D) и възпалителните хемокини Mcp-1 (Фигура 3E), Cxcl1 (Фигура 3F) и Cxcl10 (Фигура 3H). Докато приложението на DOX при мишки без тумори не доведе до значителни промени в експресията на възпалителни маркери в сърцето, приложението на DOX значително отмени индуцираната от тумора регулация на IL-1 (Фигура 3B), Mcp{{44} } (Фигура 3E), Cxcl9 (Фигура 3G) и Cxcl10 (Фигура 3H). Важно е, че двупосочната ANOVA демонстрира значителен ефект на взаимодействие във всички маркери с изключение на Cxcl1, Cxcl9 и Cxcl10, демонстрирайки различните ефекти, които DOX има върху сърдечните възпалителни маркери при носещи тумори мишки в сравнение с мишки без тумор.
2.4. Ефект от приложението на DOX върху генната експресия на възпалителни маркери в черния дроб на свободни от тумор и носещи тумор мишки
Черните дробове се събират както от свободни от тумор, така и от носещи EL4 лимфом тумор млади C57BL/6N мишки една седмица след прилагането на 4 mg/kg/седмично DOX или еквивалентен обем стерилен физиологичен разтвор за 3 седмици (n=8 на група). След екстракцията на тоталната РНК, чернодробната иРНК експресия на възпалителни маркери IL-1, IL-1, IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 и Cxcl10 бяха определени чрез PCR в реално време. Мишките, носители на тумори, имат значително повишена чернодробна експресия на провъзпалителните цитокини IL-1 (Фигура 4A), IL-1 (Фигура 4B), TNF- (Фигура 4D), Cxcl9 (Фигура 4G), и Cxcl10 (Фигура 4H) в сравнение с мишки без тумор. Макар и по-малко забележителен, двупосочната ANOVA демонстрира значителен ефект на тумора върху експресията на чернодробния ген на IL-6 (Фигура 4C). Двупосочната ANOVA демонстрира значителен ефект на взаимодействие между тумора и DOX в Cxcl10 (Фигура 4H). Приложението на DOX намалява индуцираното от тумора регулиране нагоре на IL-1 и TNF- (Фигура 4B, D). Нито DOX, нито туморът имат значителен ефект върху чернодробната експресия на възпалителни хемокини Mcp-1 и Cxcl1 (Фигура 4E, F).
2.5. Ефект от приложението на DOX върху генната експресия на възпалителни маркери в бъбрека на свободни от тумор и носещи тумор мишки
Бъбреците се събират от млади C57BL/6N мишки без тумори и EL4 лимфом, носещи тумор, една седмица след прилагането на 4 mg/kg/седмично DOX или еквивалентен обем стерилен физиологичен разтвор за 3 седмици (n=8 на група). След екстракцията на тоталната РНК, бъбречната иРНК експресия на възпалителни маркери IL-1, IL-1, IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 и Cxcl10 бяха определени чрез PCR в реално време. В съответствие с наблюдаваните промени в сърцето и черния дроб, носещите тумори мишки имат значително повишена бъбречна експресия на провъзпалителните цитокини IL-1 (Фигура 5A), IL-1 (Фигура 5B), TNF- (Фигура 5D) и Mcp-1 (Фигура 5E) в сравнение с мишки без тумор. Освен това, двупосочната ANOVA демонстрира значителен ефект на тумора върху експресията на бъбречен ген на Cxcl1 (Фигура 5F), Cxcl9 (Фигура 5G) и Cxcl10 (Фигура 5H). Прилагането на DOX при мишки, носещи тумор, значително подобрява индуцираната от тумора регулация на IL-1 (Фигура 5B), IL-6 (Фигура 5C), TNF- (Фигура 5D) и Mcp{{43} } (Фигура 5E). В рамките на тези маркери, двупосочната ANOVA също демонстрира значително взаимодействие между DOX и тумора, демонстрирайки различните ефекти, които DOX има върху бъбречните възпалителни маркери при носещи тумор в сравнение с мишки без тумор.
2.6. Ефект от прилагането на DOX върху хистопатологичните характеристики на сърцето, черния дроб и бъбреците на свободни от тумор и носещи тумор мишки
Сърцата, черния дроб и бъбреците бяха събрани от една кохорта ювенилни C57BL/6N мишки без тумор и EL4 лимфом, носещи тумор, една седмица след прилагането на 4 mg/kg/седмица DOX или еквивалентен обем стерилен физиологичен разтвор за 3 седмици ( n=4 на група). Хистопатологичната оценка не показва големи патологични промени в сърцето (Фигура 6А). Само минимална възпалителна клетъчна инфилтрация, демонстрирана като редки огнища на минимално клетъчно смесено (мононуклеарно и неутрофилно) възпаление, се наблюдава в чернодробните тъкани, събрани от третирани с DOX тумори без тумори (три от четири мишки), третирани с физиологичен разтвор, носещи тумор ( две от четири мишки) и третирани с DOX мишки, носещи тумор (три от четири мишки) (Фигура 6В). Хистопатологичната оценка на бъбреците не демонстрира големи патологични промени във всички групи, с изключение на третирани с DOX мишки, носещи тумор (Фигура 6C), като две от четирите мишки в тази група демонстрират области на тубулна регенерация с пълна дебелина, фиброза и лек интерстициален възпаление, засягащо приблизително 5 процента от общата тъканна площ.
2.7. Различни ефекти на DOX върху серумни възпалителни цитокини при свободни от тумор спрямо мишки, носещи тумор
По-рано сме докладвали, че острото прилагане на DOX е предизвикало системен възпалителен отговор при възрастни C57BL/6N мишки [11]. Тук ние определихме ефекта от хроничното прилагане на DOX върху серумните нива на възпалителните маркери IL-6 и TNF-, при ювенилни мишки без тумор и носещи тумор. Мишки, носещи тумор, третирани с физиологичен разтвор, демонстрират подчертано, макар и статистически незначимо, увеличение на серумния IL-6 (Фигура 7A) и TNF- (Фигура 7B) в сравнение с мишки без тумор. Важно е, че двупосочната ANOVA демонстрира значително взаимодействие между прилагането на DOX и тумора върху серумните нива на IL-6 и TNF-. Наистина, прилагането на DOX нормализира индуцираната от тумор регулация на IL-6 до подобно ниво като контролните мишки без тумор (Фигура 7А).
