Част 1: Създаване на Едновременния експериментален модел на остеопорозата, комбиниран с болестта на Алцхаймер при плъх и двойно-ефектите на Ехинакозид и Acteoside от Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yi Chen, Ying-Qi Li, Джия-И Фанг, Пинг Ли, Фей Ли
АБСТРАКТЕН
Етнофармакологично значение: Цистанче тубулозае скъпоценно традиционно китайско лекарство, което е широко използвано при лечение на остеопороза иБолестта на Алцхаймер.Ехинакозиди acteoside са основните активни съставки в Cistanche tubulosa, които имат фармакологични дейности с изследователска стойност. Съобщава се, че ехинакозидът иактеозидниби могло да подобри способността за учене и памет, да насърчи разпространението и диференцацията на остеобласт. Цел на проучването: Ехинакозид и актеозид отЦистанче тубулозаса показали значителни дейности на анти-остеопороза и анти-Алцхаймерова болест, докато тези ефекти не са изследвани едновременно в модел плъх. Целта на това проучване е да установи и провери модела на остеопороза, комбиниран сБолестта на Алцхаймерпри плъхове и да се изследват двойните ефекти наехинакозиди acteoside по този едновременен модел.
Материали и методи:Три моделни групи овариектомия (OVX), измамни операция с D-галактоза и AlCl3 (D), овариектомия с D-галактоза и AlCl3 (OVX+D) са определени по едно и също време. Плъховете в групите за лечение на наркотици са овариектомизирани. Докато провежда интраперитонеалното инжектиране на D-галактоза и интрагастрично приложение на AlCl3 при плъховете на групите за лечение на наркотици, плъховете се прилагат пероралноехинакозид(90 mg/kg/d),актеозидни(90 mg/kg/d), и положителните контролни лекарства на естрадиол валерат (съответно 0,6 mg/kg/d), donepezil HCl (0,8 mg/kg/d). След лечението на наркотици от 8 седмици, Морис Вода Лабиринт (MWM) тест за 6 дни е извършена за първи път. Плъховете след това са били жертвани за прибиране на кръвта, утери, фемора, пищяла, и мозъчните тъкани. Серумът е използван за биохимични тестове. Утерите са използвани за хистомерфометрия. Дясната фемора е използвана за Микро-CTи хистомерфометрия, съответно. За биомеханичното изпитване са използвани правилните пищяли. Хипокампусът, събран на ледената кутия, е използван за биохимични тестове. Мозъкът 41, събран от перфузията, е използван за хистомерфометрия.
Резултати:В сравнение с групата Sham, групата OVX+D може значително да намали способността за учене и памет чрез причиняване на оксидативни увреждания, увреждане на невроните в хипокампуса, и засяга хидролизата и синтеза на ацетилхолин. Междувременно дейността на BALP и TRAP в групата OVX+D се е увеличила значително (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">ехинакозидиактеозидни, типичните патологични особености на остеопорозата иБолестта на Алцхаймерса били амелиорирани.
Заключения:Моделът на остеопороза, комбиниран сБолестта на Алцхаймерпри плъхове е осъществимо и успешно установено.Ехинакозиди acteoside показаха и някои значителни ефекти върху този едновременен модел, като те биха могли да бъдат потенциални 56 кандидати отЦистанче тубулозас двойни ефекти за по-нататъшно проучване.
Ключови думи:остеопороза; Болестта на Алцхаймер; двойно-ефекти; ехинакозид; acteoside; Цистанче тубулоза
Cistanche изгубени империя билки амелиорати болестта на Алцхаймер
1. Въведение
Остеопорозата е дегенеративно костно заболяване, характеризиращо се с прогресивна загуба на костна маса и разрушаване на микроархитектурата, което може да увеличи риска от крехкост фрактура (Rachner et al., 2011).Болестта на Алцхаймер(AD) е често невродегенеративно заболяване при възрастни хора, което се характеризира с непрекъснат умствен упадък, когнитивни увреждания, и загуба на независима жизнена способност в клинични (Reitz 76 et al., 2011). Образуването на сенилна плака,индуцирана от β-амилоидно отлагане, неврофибриларни заплитания, причинени от тау хиперфосфорилиране, и невронална дегенерация в мозъка са типичните патологични характеристики на АД (Serrano-Pozo et al., 2011). Повърхностно, ОП и АД са напълно независими заболявания с различна патология и клинични особености. Оп и АД обаче често се наблюдават да се срещат съвместно в клиничната практика (Zhang et al., 2001; Луи и др., 2003; Лъкхаус и др., 2009). Разпространението на двете заболявания се увеличи с възрастта, особено при жени след менопауза (Li et al., 2017; Стърн, 2012). Все повече доказателства сочат, че хората, диагностицирани с АД, имат повишен риск от ОП (Zhou et al., 2014).
Необходимо е да се проучат и изяснят отношенията между остеопорозата иБолестта на Алцхаймерин витро и ин виво. Преди проучванията да се извършат in vivo, важно е да се изберат приложимите животински модели на остеопороза или болестта на Алцхаймер. Моделът на остеопорозата би могъл да бъде установен чрез няколко вида методи като интрагастрично приложение на ретиноева киселина, овариектомия хирургия, и интрамускулно инжектиране на глюкокортикоиди (Wei et al., 2007; Комори, 2015 г.). Особено, постменопаузалният остеопороза модел, предизвикан от овариектомия при плъхове, е класически ие бил широко използван в повечето от проучванията (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).Спорадични болестта на Алцхаймер е основният вид на болестта на Алцхаймер. Животнотомодели на СпорадичБолестта на Алцхаймербиха могли да бъдат предизвикани чрез различни методи катоинжектиране на D-галактоза илиβ-амилоид, интрагастрик приложение на AlCl3,и така нататък(Багери и др., 2011 г.; Гао и др., 2015; Джъстин Тогавамози и др., 2017). Освен товаконюнкционен модел на болестта на Алцхаймер, предизвикан от дългосрочна интраперитонеалнаинжектиране на D-галактоза, комбинирана с овариектомия, също е проучена много (Liuet al., 2010 г.; Жао и др., 2012). За да се разкрие уместността на остеопорозата иБолестта на Алцхаймер е необходимо да се установи моделът на остеопороза, комбиниранс болестта на Алцхаймер за проучване на общите механизми на лекарствата върхуостеопороза иАлцхаймер дисеасе.
Цистанче тубулоза(Шенк) Wight е паразитно растение, което се разпространява главно в пустините в Северозападен Китай. Сушените сукулентни стъбла наЦистанче тубулоза(CT) се използват като известно тоник лекарство, наречено Cistanches Herba със своето китайско име на Roucongrong в китайската фармакопея (2015). Той е бил почетен като "женшен на пустините" и се използва широко за лечения на болки в кръста и коляното, женска стерилност, и запек в традиционната китайска медицина (Jiang и Tu, 2009). Основните активни съставки на КТ са фенилетаноидни гликозиди (PhGs), ехинакозид (ECH) иактеозидни(ACT) са представителните съединения в ДГ (Morikawa et al., 2014). По-специално, ECH и ACT обикновено се избират като маркери за контрол на качеството в КТ поради високото им съдържание и различни фармакологични дейности като ефектите на невропротекцията, костната защита,
антиоксиданти, анти-стареене, и подобряване на способността за учене и памет (Wang et al.,2012; Li et al., 2016). Въпреки това, ефектите на ECH и ACT върху остеопорозатакомбиниран сБолестта на Алцхаймервсе още не са изследвани заедно в модел на плъх.По този начин целта на това проучване е да се установи плъхов модел на остеопороза, комбиниранс болестта на Алцхаймер и да изследват ефектите наехинакозиди актеозиди по тозиедновременния модел, така че да се предоставят експериментални доказателства за по-нататъшномолекулярен механизъм на ехинакозид или актеозид при следните изследвания.
cistanche фарма специалензаРЕКЛАМА
2. Материали и методи
2.1. Животни
Осемдесет 8-седмични женски плъхове Wistar (Номер на сертификата: SCXK 2018-0006), с тегло 180 ~ 200 г, Бяха придобити от Sino-British SIPPR/BK Lab. Animal Ltd (Шанхай, Китай) и отгледани в Експериментален център на фармацевтични животни в Китай Фармацевтичен университет.
2.2. Химикали и реагенти
Хлорален хидрат, пеницилин G натрий, D-галактоза, алуминиев хлорид хексахидрат, естрадиол валерат, donepezil HCl са закупени от Aladdin Индустриална корпорация (Шанхай, Китай).Ехинакозид(HPLC 94%) е получен от Ченгду Wecistanche Био-технология Ко, ООД (Чънду, Китай).Актеозиди(HPLC 98%) е закупен от Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Баоджи, Китай). Костно-специфична алкална фосфатаза (BALP), резистентна на тартарат киселина фосфатаза (ТРАП), супероксид дисмутаза (СОД), малоналдехид (MDA), ацетилхолинестераза (AChE ), и холин ацетилтрансфераза (CHAT) ензимно-свързани имуносорбентни assay (ELISA) комплекти са закупени от Шанхай Ензим свързани Биотехнологии Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Универсална тъканна фиксатива е получена отЧенгду Wecistanche био-технология Ко ООД (Чънду, Китай).
ехинакозид
2.3. Животински модели и лечения
Всички експерименти с животни бяха разрешени и под надзора на Комитета по етика на животните на Китайския фармацевтичен университет. Плъховете се поддържаха с 12 h лек/тъмен цикъл в помещение с контролирана температура (22±2°C) и хранени със стандартни пелетирани формации и чешмяна вода.
След адаптирането на една седмица моделът на остеопорозата е бил достижим чрез провеждане на операция по овариектомия (френски et al., 2008). След приключване на операцията пеницилинът G натрий е поръсен върху конците на раната за един път, за да се предотврати инфекцията. Плъховете след това са били хранени нормално в продължение на три седмици. Според препратката (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017), моделът наБолестта на Алцхаймерможе да се предизвика чрез дългосрочно интраперитонеално инжектиране на D-галактоза, комбинирано с овариектомия или дългосрочно интрагастрично приложение на AlCl3. За проучване на осъществимостта на модела на остеопорозата, комбиниран с болестта на Алцхаймер, три моделни групи овариектомия (OVX група), измамни операция с интраперитонеална инжекция от 150 mg/kg/d D-галактоза и интрагастри Приложението на 30 mg/kg/d AlCl3 (D група), овариектомия с интраперитонеална инжекция от 150 mg/kg/d D-галактоза и интрагастрично приложение на 30 mg/kg/d AlCl3 (OVX+D група) са определени в това проучване.
Следователно плъховете са били случайно разделени на осем групи (n=9 за всяка група) след 3 седмици и перорално лекувани с лекарства в продължение на 8 седмици: Sham group; OVX група; Г група; OVX+D група; група на лечение с естрадиол валерат (EV група, OVX+D+0,6 mg/kg/d естрадиол валерат); групата на лечение с Donepezil HCl (група на DPZ, OVX+D+0,8 mg/kg/d донепезил HCl);ехинакозидлечебна група (група ECH, OVX+D+90 mg/kg/d ехинакозид);актеозиднигрупата на лечение (група ACT, OVX+D+90 mg/kg/d актеозид). Според Човешки-плъх еквивалент доза преобразуване принцип и дозата от свързани справка (Li et al., 2013; Gao et al., 2014), дозите на групите за лечение на наркотици в това проучване са приети.
Телесното тегло на всеки плъх се измерваше всяка седмица. След цялото лечение с лекарства с продължителност 8 седмици, За първи път е извършен тест на Morris Water Maze (MWM) в продължение на 6 дни. След това 6 плъха от всяка група бяха пожертвани, за да прибират материалите. Плъховете са анестезирани с интраперитонеална инжекция от 3,0 mL/kg 10% хлорален хидрат, а кръвта е събрана от абдоминалите на аортата. Кръвта е поставена на стайна температура, за да се съсирва и центрофугира при 3500 r/min за 10 мин. Серумът е добит в центрофужна тръба от 1,5 mL (NEST Биотехнологии) и се съхранява при -80°C, докато се използва за биохимични тестове. След това бяха събрани утерите, фемората, тибията, и мозъчните тъкани. Утерите са използвани за хистомерфометрия. Дясната фемора са използвани съответно за Микро-КТ и хистоморфометрия. За биомеханичното изпитване са използвани правилните пищяли. Хипокампусът, събран на ледената кутия, е използван за биохимични тестове. След това, другите три плъхове от всяка група са били парфюмирани от сърцето с физиологичен разтвор и универсална тъкан фиксатив за прибиране на мозъка за хистомурфометрия.
2.4. Тест на Морис Уотър Лабиринт (MWM)
Плъховете са били подложени на пространствено референтно обучение и тестване на паметта в теста MWM след 8 седмици намеса. Тестът MWM е извършен, следвайки методите, съобщени преди това (Morris, 1984; Гао и др., 2016). Накратко, 5 последователни дни с четири изпитвания на ден, Плъховете бяха обучени да използват разнообразни визуални знаци, разположени на стената на басейна, за да намерят скрита потопена платформа (диаметър 11 см, височина 29 см) в кръгъл басейн (диаметър 130 см, височина 50 см), изпълнен с нетоксична вода, тонирана с въглеродно мастило. Басейнът беше въображаемо разделен на четири квадранта, а четири стартови позиции бяха разположени на кръстовищата на квадрантите. Платформата се намираше в центъра на един от квадрантите и позицията беше постоянна по време на изпитанията. Във всяко изпитание плъховете бяха поставени произволно на избрани места, насочени към стената на басейна. Всяко изпитание е прекратено, когато плъхът достига платформата или след 60 s, а изминалото време е записано като латентност на бягството. Плъхът, който не успя да стигне до платформата, беше напътстван към нея. След всеки скрит платформен пробен период плъхът остана на платформата за 10 s. Средното време на латентност от четири изпитания на ден се изчисляваше като резултати от обучението. На 6-ти ден всички плъхове бяха подложени на пробна проверка, в която плуваха за 60 s в басейна без платформа. Часовете на пресичане на местоположението на платформата и времето за пътуване в целевия квадрант бяха записани като крайни резултати. Плъховете бяха наблюдавани от камера, монтирана в тавана директно над басейна, и всички опити са записани и анализирани с помощта на програмата MORRIS MAZE, която се доставя от Пекин zhongshidichuang науката и развитието на технологиите Co., Ltd. (Пекин, Китай)
2.5. Биохимично изпитване от ELISA
Съгласно инструкциите на производителя на комплектите ELISA, Активността на алкалната фосфатаза (BALP) за костна фосфатаза, резистентната на тартатрат киселина фосфатаза (Трап) активност, активността на супероксид дисмутазата (СОД) и съдържанието на малондиалдехид (MDA) в серума бяха тествани от BioTek Synergy 2 многомоден четец на микроплати (BioTek, САЩ). Хипокампусните тъкани от всяка група са измити с PBS (0,01 M, pH 7,4) за отстраняване на кръвта или примеси, останали върху тъканната повърхност. Хипокампусните тъкани от едната страна бяха претеглени и след това нарязани на парчета възможно най-малки. Хипокампусните тъкани са хомогенизирани според съотношението 1: 9 (тъканно тегло: PBS обем). Хомогенатът е центрофугирал при 4°C, 3000 r/min за 15 мин. Супернатантата е събрана и разредена, за да се измери концентрацията на протеин по метода на BCA. Активността на ацетилхолинестеразата (AChE), холин ацетилтрансфераза (CHAT) дейност, супероксид дисмутаза (СОД) дейност, и malondialdehyde (MDA) съдържание в хипокампус тъкан след това са били тествани чрез ELISA методи.
2.6. Хистомерфометрия на хипокампуса
Мозъчните тъкани (n=3/група) са фиксирани в универсална тъкан фиксатив. След това пробите от мозъчната тъкан са измити, дехидратирани с градиентен етанол, вградени с парафинов восък, и се нарязват на коронални секции от 5 μm. Секциите са оцветени с хематоксилин и еозин (HE). След това короналните участъци на мозъчните тъкани са снимани от обърнат флуоресцентен микроскоп (Nikon, Япония). Особено се наблюдават морфологичните промени на CA1, CA2, CA3 и ГД в хипокампуса.
2.7. Маточна хистоморфометрия и морфометрия
Избраните утери (n=3/група) са фиксирани в универсална тъкан фиксативна. След това пробите от матка тъкани са измити, дехидратирани с градиентен етанол, вградени с парафинов восък, и се нарязват на напречни участъци от 5 μm. Секциите са оцветени с хематоксилин и еозин (HE). Напречните участъци на утерите са наблюдавани и снимани. Пет зрителни полета бяха произволно избрани, диаметърът на маточната напречна секция и маточната лигавица епителна дебелина след това беше измерен с помощта на image-Pro Plus 6.0 софтуер. Броят на маточните жлези в ламина проприя също са били преброени.
2.8. Микро-CT
Избраната дясна фемора (n=3/група) е сканирана в положение с разстоянието на обекта до източника на 121 mm и разстоянието на фотоапарата до източника на 171 mm с помощта на компютърна томография SkyScan 1176 микро рентгенова (Micro-CT) скенер (Брюкер, Германия). Плочата за дистален растеж е избрана за референтна повърхност. С разстояние 1 мм под еталонната повърхност за обем на интерес (VOI, 100 слоя) е избрана област с дебелина 1,8 мм). Получените изображения в сивото са с размер на пиксела 17,76 μm от костната реконструкция (65 kV, 385 μA). За избор на трабекула от кортикален кост е нает полуавтоматичен метод за контуриране. За оценка на процента от костния обем (BV/TV), плътността на костната повърхност (BS/TV), трабекуларната сепарация (Tb) са използвани директни 3D методи за измерване. Sp), трабекуларно число (Tb. N), трабекуларна дебелина (Tb. Th), индекс на модела на структура (SMI), коефициент на трабекуларен модел (Tb. Pd) и средна костна минерална плътност (средна BMD) за същия VOI с помощта наCTПрограма анализатор (Брюкер, Германия). 3D визуализация на VOI с помощта на адаптивен алгоритъм за изобразяване е направено със софтуера CTvol (Брюкер, Германия).
екстракт от растение цистанш
2.9. Костна хистопорфометрия
Избраната дясна фемора (n=3/група) е фиксирана в универсална тъкан фиксативна и след това се декалцира в разтвор от 10% EDTA-2Na в продължение на 3 седмици. Декалцифицираните проби бяха измити, дехидратирани с градиентен етанол, вградени с парафинов восък, и се нарязваха на надлъжни участъци от 5 μm. Секциите са оцветени с хематоксилин и еозин (HE). Заснети са надлъжните участъци на фемората. Наблюдавани са структурите на костната тъкан на всяка група, особено трабекуларните костни структури.
2.10. Биомеханично изпитване
Десният пищял (n=4/група), избран на случаен принцип, е оценен за триточковия тест за огъване с помощта на универсална машина за тестване (SHIMADZU, Япония). Диаметрите на тези проби са измерени чрез верние-калипер в диапазона от 2,16-2,38 mm (d). След това пробата е поставена върху две опорни напречни ленти с разстояние 25 мм (L) между двете релси и физиологичната кривина на образеца е била нагоре. Товарният прът на товара се е намирал в центъра на образеца и е спаднал с постоянна скорост 1,5 mm/min, докато образецът не бъде счупен. Данните за силата (F) и изместването са били записвани автоматично в компютър, който е бил взаимосвързан към изпитвателната машина и кривата на натоварване-деформация е била начертана едновременно. Стойностите на максимално натоварване (N) и енергопоглъщане (mJ) са записани от софтуер за тестване на материали TRAPEZIUM X едновременно. Стойностите на максимален стрес (MPa) бяха изчислени по следната формула: Стрес (σ) = момент на огъване (M) / Фактор на секцията (Z) = (8×L×F) / (π×d3 )
2.11. Статистически анализ
Резултатите от групите модели са сравнени с групата Sham, а тези на лекуваните с наркотици групи са сравнени с групата OVX+D. Данните са анализирани с помощта на еднопосочна ANOVA, последвана от множествения тест за сравнение на Bonferroni с помощта на софтуер Graph Pad Prism 5.0. Данните са изразени като средни ± SD, а стойностите на P по-малко от 0,05 са счетени за статистически значими.
мирицетиницистанш
