Част 2: Интегрирана мрежова фармакология и модел на рибка зебра за изследване на компоненти с двоен ефект на Cistanche Tubulosa за лечение както на остеопороза, така и на болестта на Алцхаймер
Mar 30, 2022
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
НАТИСНЕТЕ ТУК ЗА ЧАСТ 1
3. Резултати
3.1 Кандидат съединения и Poпотенциални цели
При изследването на химическите съставки на CT са получени общо 75 съставки от TCMSP. След това се провежда PCA, за да се визуализира химическото разпределение на CT. Както е показано на Фигура 1, съставките на CT са многообразни в химическото пространство и 28 от тях отговарят на правилото за пет на Липински (Lipinski, 2003). Интересното е, че имаше много припокриващи се части между съставките на CT и одобрените лекарства с малка молекула за OP/AD. Той илюстрира, че много съединения в CT имат потенциална лекарствена способност при OP/AD. За по-нататъшна оценка на тяхната лекарствена способност, 43 съединения бяха скринирани от DL. След прогнозиране на целите, 26 кандидат съединения бяха избрани за последващия анализ. И те могат да бъдат свързани с общо 847 целеви протеина.
cistamcheима ефект срещу болестта на Алцхаймер.
Генните записи, свързани с OP или AD, бяха събрани от базите данни DisGeNET и GeneCards. В резултат на това бяха събрани съответно 3052 и 8042 генни записа. Приехме двата резултата от базите данни на DisGeNET и GeneCards като резултати за оценка, отсявайки горната пета от целите. Съотношението една пета беше определено чрез предварителни експерименти. След това 211 OP-ED общи мишени бяха запазени, за да съответстват на мишените на 26 кандидат съединения. И накрая, общо 81 протеинови мишени (допълнителна таблица S2), свързващи се с 22 кандидат-съединения (допълнителна таблица S3), бяха избрани за анализ на молекулярните механизми на действие, образувайки мрежа за взаимодействие протеин-протеин (PPI), показана на фигура 2.
22-те съединения бяха разделени в 11 категории: 5 фенилетаноидни гликозиди (PhGs) (декафеоилактеозид, цистанозид Е и др.), 3 фенилакрил олигозахариди (цистанозид Н, цистанозид F и др.), 3 иридоида и иридоидни гликозиди (леонурид, генипозидова киселина, и др.), 3 лигнани и лигнанови гликозиди (Янгамбин, (плюс)-пинорезинол-О- -D-глюкопиранозид и др.), 2 флавоноида (кверцетин, генистеин), 1 алкалоид, 1 терпен, 1 стерол, 1 мастен алкохол, 1 мастна киселина и др. Според предишни доклади, тези съединения са основните компоненти или активни функционални съставки на CT (Fu et al., 2018).
На фигура 2 е установено, че общо 81 общи цели имат корелации с OP и AD. Степента на PPI беше приета като характерен параметър за определяне на значимостта на потенциалните цели. Първите 5 предполагаеми целеви протеини, свързани с OP и AD, са албумин (ALB), инсулин (INS), интерлевкин 6 (IL6), TNF-алфа (TNF) и епидермален растежен фактор (EGF).
Фигура 1.Химично разпределение на базата на анализ на главните компоненти (PCA).
3.2 Интегриран и класифициран мрежов анализ
81 предполагаеми целеви протеини в таблица S2 бяха избрани за иницииране на анализ на обогатяване на пътя на GO и KEGG. След филтриране по p-стойност (прекъсване на GO по-малко от или равно на 0.05, прекъсване на пътя на KEGG по-малко от или равно на 0,01), 15 термина GO и 66 KEGG бяха върнати термини на пътя, както е показано на фигури 3 и 4. Включени са общо 16 GO термина: 5 за молекулярна функция, 5 за биологични процеси и 6 за клетъчните компоненти. Тъй като това проучване имаше за цел да открие потенциалната обща патогенеза на OP и AD, ние премахнахме термините на пътя, пряко свързани с други заболявания, и класифицирахме останалите в различни функционални категории. Той предполага, че 22-те активни съставки на CT могат да регулират общо 66 пътя, които основно корелират със сигналната трансдукция, ендокринната система, имунната система, клетъчния растеж и смъртта, за да играят конфронтационна роля срещу OP и AD.
За да се разкрият разликите в действието на различните видове съединения, PPI мрежата, конструирана на Фигура 2, беше анализирана според техните категории в Таблица S3. Фигура 5 илюстрира, че 5 PhGs, 2 флавоноида, 1 терпен и 1 стерол, особено флавоноиди, може да са по-важни от други съставки на CT срещу OP и AD. След това тези 4 серии от активни съединения бяха избрани, за да разкрият техните компресирани пътища. Както може да се види от Фигура 6, PhG, флавоноиди, терпен и стерол работят заедно или самостоятелно по 27 пътя, съдържащи 11 модула: клетъчен растеж и смърт, ендокринна система, имунна система, сигнална трансдукция, развитие и други. Резултатите предполагат, че тези съединения могат да играят синергична роля в положителните ефекти на CT върху OP и AD. Струва си да се отбележи, че защитните ефекти на PhG могат да бъдат по-забележителни от флавоноидите при невродегенеративни заболявания, тъй като PhG имат директни взаимодействия с пътя на болестта на Алцхаймер, докато флавоноидите са свързани със сигналните молекули и взаимодействието. Само стеролът и терпенът са свързани с липидния метаболизъм и отделителната система. В допълнение, PhG, терпен и флавоноиди показват потенциална връзка с ендокринни и метаболитни заболявания.
Според илюстрацията на PPI, 2 флавоноида (GE, QU), 1 терпен (AA) и 1 стерол (BSS) са приети като ценни съединения за по-нататъшно изследване на молекулярните механизми. Интересното е, че открихме, че всички те са взаимосвързани с MAPK сигналния път и TGF-бета сигналния път. И p-стойността на двата пътя също беше много по-висока. Предполагаемите цели на 4 ценни съединения и разпределението на техните засегнати протеини в двата пътя бяха демонстрирани на Фигура 7.
3.3 Валидиране на ефикасността на ценни съединения
В този мрежов анализ, установен в 3.2, ние уловихме 4 ценни съединения за валидиране на фармакологичната активност. Чрез метода на топологично структурен анализ в това проучване открихме, че генистеин (GE, C9, DL=0.21), кверцетин (QU, C11, DL=0.28), абиетинова киселина (AA, C19, DL=0.28) и -ситостерол (BSS, C20, DL=0.21) показаха възможно взаимодействие срещу OP и AD. В тази част бяха установени in vivo модели на ларви на риба зебра, индуцирани от Pre или AlCl3 съответно, за да се оценят защитните ефекти на 4 съединения срещу OP и AD.
3.3.1. Ефект на 4 съединения върху OP
За да се установи дали 4 съединения имат защитни ефекти срещу OP, Pre беше използван за установяване на OP модел на рибка зебра. Развитието на остеобластите първо беше изследвано чрез оцветяване с червено ализарин, за да се изследват преките ефекти на 4 съединения върху образуването на кост. В сравнение с контролната риба зебра, Pre очевидно предизвиква промяна в костната морфология и костната плътност на черепите на риба зебра в моделната група (Фигура 8). Намаляването на площта на оцветяване и IOD в групата Pre и обратната тенденция в групата Ed също демонстрират визуално успеха на OP модела. Нещо повече, площта на оцветяване и 2 IOD на черепи на риба зебра в BSS/GE/QU/AA групите бяха значително увеличени в сравнение с моделната група (Фигура 9). Типичните маркери на костно образуване и резорбция като ALP и TRAP бяха анализирани за допълнителна оценка на антиостеопорозния ефект на 4-те съединения. Както е показано на Фигура 10, Pre значително намалява активността на ALP и повишава активността на TRAP в контраст с контролната група. Обратно, Ed и 4 съединения значително показаха обратната тенденция спрямо Pre групата в ALP и TRAP активностите на рибките зебра. Тези резултати, комбинирани заедно, потвърждават, че BSS, QU, GE и AA могат да играят положителна роля в образуването на кост при предварително индуцирани OP рибки зебра.
3.3.2. Ефект на 4 съединения върху AD
За да се оценят защитните ефекти срещу AD на 4 съединения, е използван добре познатият AlCl3-индуциран модел на AD рибка зебра. За този модел на AD дискинезия анализаторът на поведението беше използван за проследяване на движението на рибата зебра. Както е показано на фигура 11, AS на групата AlCl3 е значително по-ниска от тази на контролната група, докато за DPZ и всичките 4 съединения AS е близка до контролната. DRR и RE бяха изброени в Таблица S4. Резултатите показват, че различните концентрации на GE, BSS, QU и AA повишават DRR с 2.37-37.64 процента, 60.18-103.92 процента, 70.{{14 }}.61 процента, 2.37-42.64 процента, съответно с частична значимост (p-стойност < 0.001-0.01).="" ∆ss="" в="" контролна="" група,="" alcl3="" група="" и="" dpz="" група="" допълнително="" подкрепят,="" че="" конструкцията="" на="" ad="" модела="" е="" успешна.="" re="" за="" ge,="" bss,="" qu="" и="" aa="" бяха="" 13.12-50.45="" процента,="" 11.41-63.09="" процента,="" 1.63-66.89="" процента,="" 13.{{34}="" }.09="" процента,="" съответно.="" тези="" резултати="" със="" значителни="" разлики="" показват,="" че="" ge,="" bss,="" qu="" и="" aa="" могат="" до="" известна="" степен="" да="" подобрят="" дискинезията="" на="" рибките="" зебра.="" определянето="" на="" активността="" на="" маркерите="" за="" нервна="" проводимост="" (ache="" и="" chat)="" в="" групите="" е="" показано="" на="" фигура="" 12.="" alcl3="" значително="" повишава="" активността="" на="" ache="" и="" намалява="" активността="" на="" chat="" в="" сравнение="" с="" контролната="" група.="" но="" dpz="" и="" 4="" съединения="" показаха="" способността="" да="" възстановят="" частично="" промените,="" причинени="" от="" alcl3="" в="" активностите="" на="" ache="" и="" chat.="" това="" е="" в="" съответствие="" с="" резултатите="" от="" оценката="" на="" рехабилитационния="" ефект="" на="" дискинезия.="" в="" заключение,="" ge,="" bss,="" qu="" и="" aa="" може="" да="" имат="" потенциала="" да="" станат="" видни="" агенти="" против="">
3.4 Валидиране на предполагаемите цели
За да се проверят предполагаемите цели, които бяха предвидени в тази работа, бяха избрани цели, свързани с MAPK и TGF-бета сигнални пътища за qRT-PCR анализ. Техните относителни нива на експресия на иРНК в OP модела са показани на Фигура 13. В сравнение с Pre групата, GE повишава нивата на mapk14a, fgfr1b, tgfb1, bmp2 и намалява нивата на tp53, TNF-, jun, tgfbr1 и c-fos . QU повишава нивата на mapk14a, fgfr1b, tgfb1, bmp2 и намалява нивата на tp53, jun и il1b. BSS показва само редуциращи ефекти върху tp53, TNF- и mapk3. Както е показано на фигура 14, в AD модела, GE, QU, BSS и AA намаляват нивото на експресия на иРНК на tp53. GE и QU намаляват нивата на TNF-, bmp2, tgfbr1, sp1, tgfb2 и ifn и повишават нивата на jun, докато GE и AA повишават нивата на mapk3. Само GE изглежда обърна възхода на mapk14a, fgfr1b, fgfr1a и igf1ra. Освен това, QU намалява високите нива на il1b и EGF. Относителните нива на експресия на иРНК на гени, включително tp53, TNF-, mapk14a, mapk3, fgfr1b, bmp2, jun, il1b и tgfbr1, значително се променят в сравнение с контролната група във всеки модел. Тези резултати предполагат, че те могат да служат като връзка между двете заболявания. В допълнение, тези резултати също предполагат възможността за синергични ефекти на 4 съединения.
4. Обсъждане
OP и AD са най-честите клинични заболявания, свързани със стареенето. Техните сложни патофизиологични механизми ограничават ефективното лечение на две заболявания в продължение на години. Рисковите фактори за OP и AD показват, че податливата група на двете заболявания е частично сходна, като възрастни жени (Abraham et al., 2013; Patel, 2017), диабетици (Vieira et al., 2018; Xia et al., 2012), дългогодишни пушачи (Franic и Verdenik, 2018; Zhong et al., 2015) и неактивни лица (Koedijk et al., 2017; Sofi et al., 2011). Освен това, настоящите проучвания са установили, че някои ключови протеини в AD също имат функции в костния метаболизъм (Li et al., 2016; Pan et al., 2018). Има причини да се смята, че OP и AD не са напълно независими, дори имат някои потенциални връзки. Това предполага потенциална хомотерапия за хетеропатия, което означава лечение на OP и AD с една и съща терапия.
Въз основа на терапевтичните цели и принципите на TCM, неправилното приспособяване при дадено заболяване може да се класифицира в няколко „модели“. Така че множество заболявания като OP и AD могат да споделят един „модел“ и да бъдат лекувани от едни и същи TCM (Jiang, 2005). Като билка за тонизиране на бъбреците, CT се използва широко при лечение на OP и AD. Съвременните проучвания предоставят някои компактни доказателства, че КТ има положителни фармакологични действия върху скелета и нервната система. Въпреки това, все още се нуждае от по-подробни изследвания, за да разкрие механизмите на КТ.
цистанче и тонгкат алииматположителни фармакологични действиянаскелет и нервна система.
В настоящото проучване, за ясно разбиране на ефектите на CT върху OP и AD, беше създаден мрежов фармакологичен подход за прогнозиране на възможни активни съставки и анализ на свързани пътища. Различно е от предишни мрежови фармакологични проучвания на CT (Liu et al., 2017). Молекулярната мрежа "едно лекарство - две болести" беше проведена за първи път, вместо да се фокусира само върху едно заболяване. От една страна, интегрираният мрежов анализ откри общо 22 активни съединения на CT с двойни ефекти за лечение както на OP, така и на AD. От друга страна, моделите на двете заболявания предоставиха подкрепа за разкриване на техните връзки. Класифицираният анализ показа, че тези активни съединения могат да имат синергични ефекти върху много биологични функционални модули и PhG, флавоноидите, терпенът и стеролът показват по-добра ефикасност. За да се провери осъществимостта и пригодността на тази проведена мрежа, рибките зебра бяха използвани за конструиране на OP и AD модели in vivo и се оцени ефикасността на четири съединения. И беше приложено валидиране на предполагаеми цели, за да се разкрият техните потенциални синергии. Тези комбинирани проучвания in silico и in vivo предоставиха нова отправна точка за разкриване на защитния ефект на CT върху две заболявания. Това може да предостави нови улики за връзката между патогенезата на OP и AD, както и да помогне за бъдещото развитие на терапевтични стратегии за две заболявания. Независимо от това, методът все още се нуждае от подобрение и усъвършенстване, за да проучи изцяло синергичните механизми на КТ за лечение на ОП и AD. В това проучване само определени съединения бяха избрани за валидиране. Необходимо е допълнително да се проверят другите 18 активни съставки с основните цели и пътища чрез експерименти. А общите черти между ОП и БА все още трябва да бъдат допълнително проучени и открити, особено от гледна точка на лечението.
къде да купя цистанче
В нашето проучване беше доказано, че BSS, GE, AA и QU имат защитни ефекти върху OP и AD при рибки зебра. По-възхитителното е, че тези ценни съставки също са експериментално потвърдени в друга литература и показват фармакологична активност, съответстваща на тази в тази статия (Ayaz et al., 2017; Chauhan et al., 2018; King et al., 2015; Ramnath et al. , 2018; Thummuri et al., 2018; Vargas-Restrepo et al., 2018; Wang et al., 2019; Yuan et al., 2018). Той допълнително доказа ефективността и рационалността на тази мрежа и посочи двойните ефекти на останалите 18 съединения. Що се отнася до валидирането на предполагаемите цели, 9 ефективни цели, състоящи се от TP53, JUN, TNF, IL1B, MAPK14, MAPK3, FGFR1, BMP2 и TGFBR1, бяха скринирани като общи цели на OP и AD накрая. TP53 е ключов туморен супресор и неговото активиране може да индуцира невронална апоптоза (Xiao et al., 2019). TP 53, JUN и SP1 са активни транскрипционни фактори в първичния OP (Xie et al., 2015). TNF и IL1B са често срещани възпалителни цитокини с функции за насърчаване на остеокластогенезата (Geissler et al., 2018) и костна загуба (Sang et al., 2017). Освен това и двете са терапевтични цели за AD чрез инхибиране на невровъзпалението за защита на невроните (Liu et al., 2017). TGFB1, TGFB2, TGFBR1 и TGFBR1 имат сложни ефекти върху невронално възпаление (Lippa et al., 1998) и остеолиза (Quinn et al., 2001). Костните морфогенетични протеини (BMP) са един от факторите, участващи в глиалната диференциация на невралните прогениторни клетки (Kwak et al., 2014). Доказано е, че повишената експресия на BMP2 играе съществена роля в диференциацията на остеобластите (Li et al., 2017). В допълнение към тези експериментално потвърдени цели, 81 общи цели, изброени в таблица S2, също се очаква да бъдат терапевтични цели, но не са били изследвани или са имали предварителни проучвания в други изследвания.
Особено забележително е, че всички тези ценни цели са свързани с MAPK и TGF-бета сигнални пътища въз основа на анализа на обогатяване на KEGG. MAPK сигналният път регулира клетъчната пролиферация, диференциация, оцеляване или апоптоза, възпаление и вроден имунитет. Съобщава се, че компрометираният сигнален път на MAPK е допринесъл за патологията на невродегенерация като AD (Kim and Choi, 2015), както и директно инхибиране на остеобластите (Xiao et al., 2019). Що се отнася до членовете на TGF-семейството, те играят различни роли в скелета с директен ефект върху увреждането на костите (Sun et al., 2016), докато активирането на невроналното TGF-бета сигнализиране увеличава невродегенеративните разстройства и подобно на AD заболяване (Tesseur et al. ., 2006). По този начин може да се очаква MAPK и TGF-бета сигналните пътища да станат споделени механизми за разкриване на патогенезата на OP и AD или забавяне на прогресията. Освен двата пътя, 22-те активни съединения регулират общо 66 пътя, особено пътищата с най-висока p-стойност, като сигналния път на пролактин, сигнален път FoxO и диференциация на Th17 клетки също ще бъдат достойни за внимание и изследване и като ключ към разкриване на връзката между OP и AD. И накрая, обобщените открития могат да предполагат връзката между двете заболявания в имунната система и ендокринната система.
5. Заключение
В тази работа предложихме мрежов фармакологичен подход, комбиниращ PCA анализ, DL скрининг, събиране и прогнозиране на множество цели, изграждане на PPI мрежа, както и анализ на пътя на GO и KEGG за изследване на ефективността на CT за лечение на OP и AD. Нашите резултати предполагат, че 22-те активни съставки на CT могат главно да регулират сигналната трансдукция, ендокринната система, имунната система, клетъчния растеж и смъртта, за да играят важна роля в лечението на OP и AD. За да се разбере по-добре механизмите на CT, тази мрежа беше дълбоко разкопана и анализирана в зависимост от вида на съединенията. В крайна сметка ние приложихме OP и AD моделите на зебрата поотделно, за да идентифицираме 4 ценни съединения и свързани мишени, предоставяйки осъществим метод за свързване на генома с фармакодинамиката и намиране на съединения с двоен ефект.
