Част Ⅱ: Насочвано от дерепликация изолиране на нови фенилпропаноид-заместени дигликозиди от Cistanche Salsa и тяхната инхибиторна активност върху производството на NO в макрофаги
Mar 04, 2022
Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com
3-метилбутенилова група, агликонова субструктура, беше предложена от COSY корелациите на H-2 с H-1a и H-1b и HMBC корелациите между H{{ 4}} и H-5 и олефиновите въглероди, при kC 120.7 (C-2) и 136.4 (C-3). Две захарни части бяха установени чрез анализа на NMR спектрите и HPLC спектралния анализ на киселинния хидролизат, с модел на MS фрагменти. Абсолютната им конфигурация беше определена като D-глюкоза и L-рамноза с помощта на HPLC анализ на киселинния хидролизат [17]. Тези захарни части са дефинирани като -глюкоза и а-рамноза чрез константи на свързване на аномерните протони. 1H-1H COSY спектърът показва последователни корелации от H-13 към H-63 и от H-133 към H-633 (Фигура 4).
Глюкозен протон с понижено изместване при kH 4,70 (H -43) предполага ацил-заместител на глюкозата. От HMBC спектъра, корелацията между H-43 и C-9333 потвърждава позицията на кафеоилния заместител. HMBC корелациите между H-13 и C-1 (kC 64,5) и между H-33 (kH 3,68) и C-133 (kC 101,2) предполагат позициите на всеки заместител . Съответно, структурата на 6 се определя като 3-метилбутенил-О- -L-рамнопиранозил-(1→3)-4-О-(Е)-кафеоил- -D- глюкозо-пиранозид и наречен цистансалсид В.
Cistansalside C (12), кафяв аморфен прах, беше определено с молекулна формула C26H38O13 чрез (плюс)-HR-ESI-QTOF-MS, което показва пик при m/z 581.2213 [M плюс Na] плюс (изчислено за C26H38O13Na, 581.2205). Характерен йон при m/z 163 предполага, че в структурата съществува кафеоилов заместител. Фрагментните йони при m/z 325 и m/z 471 предполагат съществуването на рамнозна единица и глюкозна единица.
Сравнението на ЯМР спектрите на 12 с тези на 6 показа, че те са подобни с изключение на агликоновата структура. В ЯМР спектрите на 12 се наблюдават два парафинови въглерода при kC 38.0 (C-2) и 24.4 (C-3) вместо два олефинови въглерода при kC 12{{16 }}.7 (C-2) и 136.4 (C-3) в агликона на 6. Зародишните метилови групи (kH 0.88) в агликона на 12 бяха изместени нагоре по отношение на H-4 и H-5 (kH 1.71 и 1.63) в агликона на 6 (Таблица 2). Предполага се, че агликонът на 12 е 3-метил бутилова група, което се потвърждава от 1H и COSY NMR спектрите. Пикове на 3-метил бутиловата група се наблюдават при 3.81 (1H, m, H-1a), 3.48 (1H, m, H-1b), 1.71 (1H, m , Н-3), 1.44 (2Н, m, Н-2) и 0.88 (Н-4, 5).
Две захарни части бяха потвърдени отново чрез HPLC анализ на киселинния хидролизат и анализ на NMR спектрите, както и модел на MS фрагменти. Абсолютните конфигурации на захарите бяха идентифицирани като D-глюкоза и L-рамноза с помощта на HPLC анализ на киселинния хидролизат [17]. А-глюкозна част и а-рамнозна част бяха потвърдени чрез константи на свързване на аномерните протони. Спектърът 1H-1H COSY показва последователни корелации от H-13 до H-53, от H-133 до H-333 и от H{{11} } към H-433 (Фигура 4).
Позицията на заместителите се потвърждава с помощта на HMBC анализ. В спектъра на HMBC, корелациите между H-13 и C-1 (kC 67,2), между H-33 (kH 3,68) и C-133 (kC 101,2) и между H-43 (kH 4.70) и C-9333 (kC 165.7) бяха открити. Следователно структурата на 12 е установена като 3-метил бутил-OaL-рамнопиранозил-(1→3)-4-O-(E)-кафеоил- -D-глюкоза-пиранозид и наречен цистансалсид C.
Cistansalside D (17), аморфен кафяв прах, беше определено, че има молекулна формула C31H38O14 чрез ESI-QTOF-MS с висока разделителна способност в положителен режим, който показва аддуктен йонен пик при m/z 657,2147 [M плюс Na] плюс (изчислено за C31H38O14Na, 657.2154). Фрагментни йони, включително [M плюс H x Aglycone x Rha x Acetyl Glc] плюс йон при m/z 147, [M плюс H x Aglycone x Rha] плюс йон при m/z 351 и [M плюс H x Aglycon] плюс йон при m/z 497 също бяха открити. Характерен йон при m/z 147 предполага, че в структурата му присъства кумароилов заместител. Фрагментните йони при m/z 351 и m/z 497 предполагат съществуването на рамнозна единица и ацетил-заместена глюкозна единица.
Cistansalside отбилка цистанче
13C-NMR спектърът разкрива наличието на 31 въглеродни атома. Два аномерни протона при kH 4.61 (1H, m, H-13) и 4.60 (1H, s, H{{10}}) се наблюдават в 1H и HSQC спектрите . 1H-NMR спектърът показва наличието на метилова група при 1.97 (3H, s, ацетил-CH3), транс-олефин при kH 7.55 (1H, d, J=15.9 Hz, H{{ 25}}) и 6.34 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8333) и два пара-заместени бензенови пръстена при kH 7.53 (2H, d, J=6. 9 Hz, H-3333, 5333) и 6,79 (2H, d, J=6.9 Hz, H-2333, 6333)/ kH 6,98 (2H, d, J {{5) 0}}.0 Hz, H-2, 6) и 6,65 (2H, d, J=8.0 Hz, H-3, 5) (Таблица 2) . От HMBC NMR спектъра, корелациите между карбонилния въглерод при kc 165,5 (C-9333) и H-8333 и между H-2333, 6333 и C-7333 (kc 145.4) предполага (Е)-кумароилова група. HMBC корелацията между метил протонен пик и карбонил въглерод при kc 169.0 потвърждава наличието на ацетилова група.
Предложена е 4-хидроксифенилова група въз основа на HMBC корелациите между H-3, 5 и кватернерни ароматни въглероди при kC 155.6 (C-4) и 128.6 (C-1) . Хидроксилирана етилова група се потвърждава от COSY NMR сигналите при kH 2.66 (2H, t, J=6.1 Hz, H-7), 3.90 (1H, m, H-8a ) и 3.54 (1H, m, H-8b). HMBC корелациите между H-7 и C-1 (kC 128.6) и C-2, 6 (kC 129.7) предполагат 4-хидроксифенилетилова група като агликонова подструктура.
Две захарни части, предложени от модела на MS фрагменти, бяха потвърдени отново чрез HPLC анализ на киселинния хидролизат и NMR спектри. D-глюкоза и L-рамноза бяха изяснени с помощта на HPLC анализ на киселинния хидролизат [17]. А-глюкозна част и а-рамнозна част бяха установени чрез константи на свързване на аномерните протони. 1H-1H COSY спектърът показва последователни корелации от H-13 към H-53 и от H-133 към H-633 (Фигура 4).
От 1H-NMR спектъра отместването на полето надолу на H-23 (kH 4,69) и H-43 (kH 4,80) предполага ацил-заместената позиция върху глюкозата. Връзките между глюкозата и две ацилни групи бяха потвърдени от HMBC корелациите между H-43 (kH 4.80) и C-9333 и между H-23 и карбонилния въглерод на ацетилна група (kC 169.0 ). Позициите на агликон и рамноза са дадени от HMBC корелациите между H-33 (kH 3,95) и C-1333 и между H-8 и C-13. Съответно, структурата на 17 е определена като 4-хидроксифенилетил-2-О-ацетил-О- -L-рамнопиранозил-(1→3)-4-O-(E)- кумароил- -D-глюкопиранозид и наречен цистансалсид D.
Цистансалсид Е (18) се изолира като аморфен кафяв прах. Неговата молекулна формула е определена като C31H38O14 чрез 13C-NMR данни и ESI-QTOF-MS пик на положителен режим с висока разделителна способност при m/z 657.2166 [M плюс Na] плюс (изчислено за C31H38O14Na, 657.2154). Освен това бяха открити и йони на фрагменти, включително кафеоилов йон при m/z 163, [M плюс H x Aglycone x Rha] плюс йон при m/z 367 и [M плюс H x Aglycone] йон при m/z 513. Фрагментните йони предполагат съществуването на рамнозна единица и ацетил-заместена глюкозна единица.
1H-NMR спектърът предполага наличието на два аномерни протона при kH 4.63 (1H, d, J=8.2 Hz, H-13) и 4.60 (1H, s, H-133 ) и два ацил-заместени глюкозни протона при kH 4.71 (1H, dd, J=8.9, 8.2 Hz, H-23) и 4.81 (1H, dd, J=9.7 , 9,5 Hz, H-43). Спектрите 1H и HMBC предполагат съществуването на ацетилова група при kH 1.94 (3H, s, ацетил-CH3), (E)-кафеоилова част при kH 7.48 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7333), 7.02 (1H, d, J=1.6 Hz, H-2333), 6.98 (1H, dd, J=8.1, 1.6 Hz, H-6333), 6.76 (1H,d, J=8.1 Hz, H-5333) и 6.21 (1H, d, J=15.9 Hz, H{ {67}}) и моно-заместен бензенов пръстен при kH 7.29 (2H, m, H-3, 5), 7.21 (2H, m, H-2, 6) и 7.20 (1H, m, H-4) (Таблица 2). Фенилметилова група, агликонова подструктура, беше предложена от корелациите на HMBC между H-7 (2H, kH 2.80, m) и C-1 (kC 138.8) и между H-7 и C -2, 6 (kC 128.9) и COSY NMR сигналите на H-7 с H-8a (1H, kH 3.99, m) и H-8b (1H, kH 3,63, m).
Две захарни части бяха потвърдени отново чрез HPLC анализ на киселинния хидролизат и NMR спектрален анализ. Абсолютните конфигурации на захарите бяха изяснени с помощта на HPLC анализ на киселинния хидролизат, за който беше потвърдено, че е D-глюкоза и L-рамноза [17]. -глюкозна част и -рамнозна част бяха установени чрез константи на свързване на аномерните протони. Спектърът 1H-1H COSY показва последователни корелации от H-13 до H-53, от H-133 до H-233 и от H{{11} } към H-333 (Фигура 4).
От спектъра на HMBC, корелациите между H{{0}} и C-8 (kC 69.4), между H-23 и карбонилния въглерод на ацетилна група (kC 169.1), между H-33 (kH 3.95) и C-133 (kC 102.0) и между H-43 (kH 4.81) и C-9333 (kC 165.6) потвърждават позицията на заместителите в структурата. Следователно структурата на 18 беше определена като фенилетил-2-O-ацетил-OaL-рамнопиранозил-(1→3)-4-O-(E)-кафеоил- -D-глюкопиранозид и наречен цистансалсид Е.
Повечето от транс-цинамоилните заместители са изомеризирани до цис-изоформата in vitro. Съобщава се, че светлината превръща производни на транс-канелена киселина в цис-изоформи [18,19]. Наблюдава се, че равновесието на транс-цис конверсията на цинамоилните заместители поддържа приблизително 70 процента от изолатите в транс-изоформата. За олефиновите протони на цис формата, пикове при приблизително 6,90 ppm (d, J=12~13 Hz, H-7333) и 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) могат да бъдат определени в 1H-NMR спектрите, докато пикове при приблизително 7,55 ppm (d, J=15.8 Hz, H-7333) и 6,40 ppm (d, J { {28}}.8 Hz, H-8333) са наблюдавани за трансформация [20]. В 1H-NMR спектъра на транс-цис смеси се наблюдават пикове за два олефинови протона (Н-7333 и Н-8333) в съотношение 7:3 (транс:цис). 13C-NMR пиковете на цис формата са подобни на тези на трансформацията.
Ефективни съставки от цистанхе: актеозиди
Всички изолати бяха тествани за техните инхибиторни ефекти върху LPS-индуцираното производство на NO в RAW
Всички изолати бяха тествани за техните инхибиторни ефекти върху LPS-индуцираното производство на NO в RAW 264.7 клетки. Дексаметазон беше използван като положителна контрола и неговият IC50 беше 7.0 uM. От тестваните съединения, съединения 5 (IC50 42.7 o 6,6 uM), 11 (IC50 37.3 o 2,2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) и 18(IC50 27.9 o 0,8 uM) показват умерени инхибиторни активности върху индуцируемата NO синтаза, докато другите съединения са неактивни в този анализ (IC50 стойности > 100 uM). За да се провери дали тези съединения имат цитотоксичност, клетъчната жизнеспособност се измерва с помощта на МТТ анализ. В резултат нито един от тях не показва значителна цитотоксичност (допълнителна фигура S6-1). Тези четири съединения бяха избрани, за да се оцени тяхната инхибиторна активност срещу NF-λB пътя в LPS-стимулирани RAW 264.7 клетки. Стимулирането на RAW 264.7 клетки с LPS индуцира фосфорилирането на I入B и NF-入B (p65) след 0.5 часа инкубация. Фосфорилирането на NF-入 B (p65) беше значително намалено чрез предварително третиране със съединения 11, 13 и 18, както е показано чрез Western blot анализ (Фигура 5). Следователно, съединения 11, 13 и 18 могат да проявят противовъзпалителни ефекти чрез инхибирането на NF-入B в макрофагите.
Фигура 5.Ефект на четири съединения върху фосфорилирането на I入B и NF-入B (p65) в LPS-стимулирани RAW 264.7 клетки. (A) Уестърн блотовете бяха проведени в LPS и третирани с проба RAW 264.7 клетки; (B, C) Сигналите на имуноблот се определят количествено с помощта на софтуер за денситометрия Molecular Analyst/PC (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Докладва се денситометричен анализ на фосфорилирани изоформи. NF- 入 B в клетка RAW 264.7 се нормализира до съдържанието на -актин.
3. Материали и Методи
3.1. Общ експеримент Процедура
Оптичните ротации бяха измерени с цифров поляриметър Jasco P-2000 (Jasco, Токио, Япония). UV спектрите бяха записани на спектрометър Chirascan plus Circular Dichroism (Chirascan, APL, UK). IR спектрите бяха записани с помощта на Jasco FT/IR-4200 спектрофотометър. Електроспрей йонизираща квадруполна времепролетна масспектрометрия с висока разделителна способност (HR-ESI-qTOF-MS) беше извършена на Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS, оборудван със серия Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc. , Пало Алто, Калифорния, САЩ), а използваната колона беше колона Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id 150 4.6 mm, 5 um). За събиране на данни е използван софтуерът MassHunter Workstation.
1D (1H и 13C) и 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR спектри са получени с Jeol LA 300 (Jeol, Токио, Япония), Bruker AVANCE-400, Bruker Спектрометри AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 и Bruker AVANCE 800 HD, съчетани с криосонда (Bruker, Ettlingen, Германия). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, In Cistanche Andover, MA, USA) се използва като NMR разтворител и референтни пикове (kH 2.50 и kC 39.5). Колонна хроматография (CC) се извършва с помощта на Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Швеция) или Kieselgel 60 силикагел (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck, Darmstadt , Германия). Тънкослойна хроматография (TLC) се провежда върху предварително покрити Kieselgel 60 силикагел F254 плаки (арт. 5715; Merck). Петна върху TLC бяха открити с помощта на UV лампа при 254 nm и 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Франция). Течна хроматография със средно налягане (MPLC) се извършва на RediSep 120 g флаш колона със силициев диоксид (Isco, Lincoln, NE, USA) и Kiesegel 60 силикагел (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck), като се използва Комбиниран флаш компаньон (Isco). Системата за течна хроматография под високо налягане (HPLC) беше Gilson HPLC, оборудвана с помпа Gilson 321 и UV.VIS 151 детектор (Gilson, Middleton, WI, САЩ), използвайки полупрепаративни ODS колони (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, САЩ; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Германия; Inno C18 колона 120 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Корея). Аналитичната RP-HPLC система беше система Waters 2695 alliance с детектор a996 Photodiode Array (PDA) (Waters Corp, Milford, MA, USA), а използваната колона беше Hypersil™ BDS C18 колона (130 Å, id 150: 4.6 mm, 5 um, Thermo Scientific™). Мравчената киселина е закупена от Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Сеул, Корея). Разтворителите с клас HPLC бяха закупени от Fisher Scientific Korea Ltd. (Сеул, Корея). H2SO4, Na2CO3 и първокласни разтворители за екстракция, фракциониране и изолиране бяха закупени от Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Сеул, Корея). L- и D-цистеин метилов естер хидрохлорид и о-толилизотиоцианат са закупени от Tokyo Chemical Industry (Токио, Япония).
3.2. Завод Материал
Целите растения наЧистанче салса, които са събрани от Shinjang Uyghur, са внесени чрез Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Корея). Те бяха идентифицирани от проф. д-р Джехюн Лий (Университет Донгук, Сеул, Корея). Образецът на ваучера (SNUPH2016-03) е депозиран в Хербариума на градината на лечебните растения, колеж по фармация, Национален университет в Сеул.
3.3. Екстракция и Изолация
Изсушените цели растения наЧистанче салса(5,7 kg) се нарязват и екстрахират три пъти с МеОН (20 L) при стайна температура с ултразвук за 99 минути. След отстраняване на разтворителя във вакуум, суровият екстракт (1.35 kg) се суспендира във вода (5 L), след което се разделя с EtOAc (5 L). Остатъкът от EtOAc (55.3 g) се разделя на 16 фракции (E01-16) върху силикагелна хроматография, елуиране с CHCl3/MeOH (50:1–0:1, система със степенен градиент).
E08 (611.7 mg) се подлага на течна хроматография със средно налягане със силикагел (25 g) и се елуира с CHCl3/MeOH (18:1–0:1, система със стъпков градиент) и даде 11 дроби (E08a-k). От E08g, съединения 13 (0.7 mg) и 18 (0.6 mg) се пречистват с помощта на Luna 5 um HPLC колона и изократно елуиране с 28 процента aq. MeCN. HPLC пречистване (Hypersil GOLD, 25 процента воден разтвор на MeCN) на E08h (138,5 mg) дава съединения 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) и 17 (4,9 mg).
E09 (1,15 g) се пречиства допълнително на колона със силициев диоксид-MPLC (20 g) елуиране с CHCl3/MeOH (10:1–0:1, стъпка- градиентна система), за да се получат 11 подфракции (E09a-k). E09e (398,7 mg) се подлага на Sephadex LH-20 (MeOH) и се получават осем субфракции (E09e1-8). E09e6 впоследствие се пречиства с помощта на Hypersil GOLD HPLC колона (22 процента воден MeCN), за да се получи съединение 11 (0.4 mg). От E09e7, съединение 5 (0.6 mg) се пречиства чрез изократно елуиране от Luna 5 um HPLC колона с 40 процента aq. МеОН.
E10 (1.20 g) се разделя на девет фракции (E10ai) на Sephadex LH-20 колона, елуирана с МеОН. От E10g (147.5 mg), съединения 4 (13.4 mg), 9 (8.0 mg) и 15 (5.0 mg) бяха изолирани чрез HPLC разделяне (Inno, 23 процента воден MeCN). Фракция E10h (470.0 mg) се пречиства на Hypersil GOLD колона чрез изократно елуиране (40 процента воден метанол) до получаване на съединения 1 (3.8 mg), 10 (42.1 mg) и 16 (3.0 mg).
E11 (2.96 g) се подлага на Sephadex LH-20, елуиран с МеОН, за да се получат девет фракции (E11a-i). E11e се разделя с патрон Sep-Pak C18, като се елуира стъпаловидно с 10 процента, 20 процента, 30 процента, 50 процента и 100 процента воден разтвор. МеОН, за да се получат седем фракции (E11e1-7), последвани от Luna 5 um HPLC (28 процента воден MeCN), за да се получат съединения 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) и 12 (1,2 mg).
E12 (19.0 g) се подлага на MPLC със силициев диоксид (120 g), използвайки CHCl3/MeOH стъпаловидна градиентна система, за да се получат шест фракции (18:1–0:1 , E12a-f). E12f се хроматографира върху колона Sephadex LH-20 (MeOH), като се получават седем фракции (E12f1-7). HPLC пречистване (Hypersil GOLD, 25 процента воден разтвор на MeCN) на E12f7 даде съединение 2 (3.3 mg). Всички разтворители, използвани за HPLC, бяха 0,05 процента буфер от мравчена киселина. Общата скорост на потока за HPLC и MPLC хроматография е съответно 3 и 40 mL/min.
3.4.Охарактеризиране
Цистансалсид А (5): кафяв аморфен прах; [ |20 х33.7 (с 0.1, МеОН); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3.18); IR (чист) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmxl; 1H-NMR (800 MHz) и 13C-NMR (200 MHz) данни, виж Таблица 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M плюс Na] плюс 645.2146 (изчислено за C30H38O14Na, 645.2154).
Цистансалсид В (6): кафяв аморфен прах; [ |20 х72.9 (с 0.1, МеОН); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3.32); IR (чист) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; 1H-NMR (500 MHz) и 13C-NMR (125 MHz) данни, виж Таблица 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M плюс Na] плюс 579.2054 (изчислено за C26H36O13Na, 579.2048).
Цистансалсид С (12): кафяв аморфен прах; [ |20 х61.6 (с 0.1, МеОН); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3.25); IR (чист) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) и 13C-NMR (200 MHz) данни, виж Таблица 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M плюс Na] плюс 581.2213 (изчислено за C26H38O13Na, 581.2205).
Цистансалсид D (17): кафяв аморфен прах; [ |20 х51.1 (с 0.1, МеОН); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3.53), 315 (3.52); IR (чист) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmxl; 1H-NMR (400 MHz) и 13C-NMR (75 MHz) данни, виж Таблица 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M плюс Na] плюс 657.2147 (изчислено за C31H38O14Na, 657.2154).
Цистансалсид Е (18): кафяв аморфен прах; [ |20 х59.2 (с 0.1, МеОН); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3.22); IR (чист) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) и 13C-NMR (200 MHz) данни, виж Таблица 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M плюс Na] плюс 657.2166 (изчислено за C31H38O14Na, 657.2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Анализ
Хроматографско-масспектрометричен анализ беше извършен на Agilent 1260 Infinity серия LC система (Agilent Technologies, Inc., САЩ). Аналитичната колона беше колона SFCpak Crest C18T-5 (id 15{{10}} : 4,6 mm, 5 um, Jasco, Япония). Подвижната фаза се състоеше от 0.1 процента (v/v) мравчена киселина в MeCN (A) и вода (B), като се използва градиентно елуиране от 0–35 минути (23 процента A), 35–45 минути ( 23–28 процента A), 45–75 минути (28 процента A) и 75–80 минути (90 процента A). Скоростта на потока се поддържа при 0.3 mL/min. Абсорбцията се измерва при 320 nm. Условията на източника на ESI бяха както следва: дебит на изсушаващ газ (N2), 10 L/min; температура на изсушаващия газ, 350 градуса; пулверизатор, 30 psig; скорост на потока на обвивния газ, 12.0 L/min; температура на обвивния газ, 350 градуса; капилярна, 4000 V; скимер, 60 V; октаполюс RF, 750 V; напрежение на фрагмента, 180 V; положителен режим. Системата се управляваше от софтуера за работна станция Masshunter. Масовият обхват беше зададен на m/z 50–1000.
3.6.Киселина Хидролиза
Съединенията се хидролизират с помощта на 1 N H2SO4 (100 uL), нагрят с водна баня при 90 градуса за 2 часа, след което се неутрализират с наситен воден разтвор на Na2CO3. След като разтворите бяха изсушени под поток от N2, продуктите и стандартните захари (D-Glc, L-Glc, L-Rha) бяха разтворени в пиридин (100 uL), съдържащ L-цистеин метилов естер хидрохлорид (0.5 mg). Проба от L-рамноза се разтваря в пиридин (100 uL), съдържащ D-цистеин метилов естер хидрохлорид (0.5 mg). След това те се нагряват при 60 градуса за 1 час. Разтворите се третират с 1 uL (1.11 mg) о-толилизотиоцианат, които се нагряват отново при 60 градуса за 1 час. Всяка крайна смес се анализира директно чрез аналитична RP-HPLC (колона Hypersil™ BDS C18, 17 процента воден разтвор на MeCN, 0.8 mL/min, 40 минути, 35 градуса). tR на пика при 21,9 и 40,4 минути съвпада с този на тиокарбамоил тиазолидиново производно на D-глюкоза и L-рамноза, съответно.
3.7. клетка култура
Миши макрофаги, RAW 264.7, бяха получени от Корейския изследователски институт по биологични науки и биотехнологии (Daejeon, Корея) и отгледани в RPMI среда, съдържаща 10 процента фетален говежди серум и 100 U/mL пеницилин/стрептомицин сулфат. Клетките се инкубират в овлажнена атмосфера с 5 процента CO2 при 37 градуса.
3.8.Лекарства и химикали
RPMI, пеницилин и стрептомицин бяха закупени от HyClone (Logan, UT, USA). Говежди серумен албумин и LPS са закупени от Sigma (St. Louis, MO, USA).
3.9. Измерване на производството на NO
Концентрацията на нитрит в хранителната среда се измерва като индикатор за производство на NO съгласно реакцията на Griess. Клетките се посяват в съотношение 2:105 клетки/ямка в 96-плаки за култура на ямки. След предварително инкубиране на клетките RAW 264.7 за 18 часа, клетките бяха предварително третирани със съединения (50 uM, 10 uM, 5 uM или 1 uM) и стимулирани с LPS (500 ng/mL) за 24 ч. Тестваните съединения, разтворени в DMSO. Клетките също бяха третирани с 0,05 процента DMSO като контролен носител. RAW 264.7 клетки (2: 105 клетки/ямка) се култивират в 96-плаки с ямки, като се използва RPMI без фенолно червено и се третират предварително с проби за 0,5 часа. Клетъчното производство на NO се индуцира чрез добавяне на 500 ng/mL LPS с крайна концентрация и 24 часа инкубация. След инкубиране, 100 uL кондиционирана среда се смесва със същия обем реагент на Griess и се инкубира в продължение на 15 минути. Абсорбцията на сместа при 540 nm се измерва с ELISA четец на микроплаки (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, СА, САЩ). Получените стойности бяха сравнени с тези на стандартните концентрации на натриев нитрит, разтворен в RPMI, и бяха изчислени концентрациите на нитрит в кондиционираната среда на третирани с проба клетки.
3.10.3-(4,5-Диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT) Анализ за клетъчна жизнеспособност
Клетките се посяват в {{0}}плаки с ямки при плътност 5:104 клетки/ямка и се инкубират със среда без серум в присъствието на проби. Тестваните съединения, разтворени в DMSO. Клетките също бяха третирани с 0,05 процента DMSO като контролен носител. След инкубиране в продължение на 24 часа се добавят 10 uL МТТ (5 mg/mL във физиологичен разтвор) и инкубирането продължава още 4 часа. Митохондриалната сукцинат дехидрогеназа в живи клетки превръща МТТ във видими формазанови кристали по време на инкубация. Кристалите формазан след това се солюбилизират в диметилсулфоксид и абсорбцията се измерва при 540 nm, като се използва ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) четец на микроплаки (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). Относителната клетъчна жизнеспособност се изчислява в сравнение с абсорбцията на нетретираната контролна група. Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра.
3.11.Имуноблот анализ
Експресията на протеин се оценява чрез Western blotting съгласно стандартни процедури. Накратко, RAW264.7 клетки се култивират в 6{{20}} mm културни блюда (2: 106/mL), последвано от предварителна обработка на 50 uM съединения . Клетките се промиват два пъти в ледено студен PBS (рН 7.4), клетъчните пелети се ресуспендират в лизисен буфер върху лед за 15 минути и след това клетъчните остатъци се отстраняват чрез центрофугиране. Концентрацията на протеин се определя с помощта на реагент за анализ на протеин Bio-Rad съгласно инструкциите на производителя. Протеинът (20-30 ug) се смесва 1:1 с 2: буфер за проба (20 процента глицерол, 4 процента SDS, 10 процента 2- ME, 0,05 процента бромофенол синьо и 1,25 М Tris [рН 6,8]), заредени върху 8 или 15 процента SDS-PAGE гелове и работещи при 150 V за 90 минути. Клетъчните протеини се прехвърлят върху мембрани от поливинилиден дифлуорид на Immunoblot (Bio-Rad), като се използва система за полусух трансфер Bio-Rad съгласно инструкциите на производителя. След това мембраните се инкубират за една нощ със съответните първични антитела p-NF-入B, NF-入B, pI入B и -актин (Abcam, Cambridge, UK) в Tris-буфериран физиологичен разтвор, съдържащ 5 процента обезмаслено мляко и 0,1 процента Tween 20. На следващия ден блотовете се промиват три пъти с Tris-буфериран физиологичен разтвор (0,1 процента Tween 20) и се инкубират в продължение на 1 час с HRP-конюгирано вторично анти-IgG антитяло (разредено 1:2000–1 :20 000). Петната се промиват отново три пъти с Tris-буфериран физиологичен разтвор (0,1 процента Tween 20) и се развиват имунореактивни ленти с помощта на хемилуминесцентния субстрат ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).
3.12.Статистически анализ
Експерименталните данни са представени като средна стойност на SEM. Нивото на статистическа значимост се определя чрез анализ на дисперсията (ANOVA), последван от t-теста на Dunnett за множество сравнения.p Стойности по-малки от 0.05 се считат за значими.
Екстракт от цистанче салса
4. Изводи
В това изследване ние изолирахме и изяснихме структурите на пет нови фенилпропаноид-заместени гликозиди, наречени цистансалсид AE (5, 6, 12, 17 и 18), в допълнение към изолирането и идентифицирането на 13 известни съединения, използвайки стратегия за дерепликация. Установено е, че известните съединения са липедозид AI (1) [21], 23-ацетилактеозид (2) [22], изоцистанозид С (3) [15], османтузид В (4) [21], епимеридинозид А ( 7) [15], цистанозид D (8) [23], салсазид В (9) [6], тубулозид Е (10) [16], цистанозид М (11) [15], изомартинозид (13) [24], салсасид С (14) [6], джионозид С (15) [25] и салсасид F (16) [6]. Техните структури са установени чрез анализ на обширни спектроскопски данни и чрез сравнение с докладваните данни в литературата. Беше потвърдено, че условно предвидените структури на фенилпропаноид-заместени гликозиди са правилно съвпадащи с техните реални структури.
Полза от екстракта от Cistanche salsa
Препратки
1. Шимамура, Х.; Миядзава, М.; Еномото, К.; Накамура, С.-И.; Kameoka, H. Потискане на SOS-индуцираща активност на Trp-P-1 от мастни киселини от Cistanche salsa в Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu Test. Нац. произв. Лет. 1997, 10, 261–265. [CrossRef]
2. Джеон, Е.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Антипролиферационни ефекти на Cistanches salsa върху прогресията на доброкачествена простатна хиперплазия. Мога. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]
3.Xu, C.; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Джоу, Q.; Sun, S. Бърза дискриминация на Herba Cistanches чрез многоетапно инфрачервено макро-пръстово отпечатване, комбинирано с меко независимо моделиране на класова аналогия (SIMCA). Spectrochim. Acta част A Mol. Biomol. SpectrosCistanche 2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]
4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Чен, XJ; Tu, PF Диференциране на Herba Cistanches чрез пръстов отпечатък с високоефективна течна хроматография-диодна матрица за откриване-масспектрометрия. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Кобаяши, Х.; Карасава, Х.; Миясе, Т.; Фукушима, С. Изследвания върху съставките на Cistanchis Herba. V. Изолиране и структури на два нови фенилпропаноидни гликозида, цистанозиди Е и F. Chem. Pharm. Бик. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]
6. Лей, Л.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Ту, П.-Ф.; Wu, L.-J.; Чен, Ф.-К. Нови гликозиди от Cistanche salsa. Helv. Чим. Acta 2007, 90, 79–85. [CrossRef]
7. Картбаева, Е.Б.; Сакипова, З.Б.; Ибрагимова, Л.Н.; Капсалямова, Е.Н.; Ternynko, II Изследване на състава на фенолни съединения на Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck, растящи в Република Казахстан. J. Chem. Pharm. Рез. 2015, 7, 120–122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Подобрено натрупване на фенилетаноидни гликозиди чрез захранване на прекурсор към суспензионна култура на Cistanche salsa. Biochem. инж. J. 2007, 33, 88–93. [CrossRef]
9. Маруяма, С.; Акасака, Т.; Ямада, К.; Екстрактът от Tachibana, H. Cistanche salsa действа подобно на свързания с протеини
полизахарид-К (PSK) върху различни видове клетъчни линии. J. Tradit. Med. 2008, 25, 166–169.
10. Тиан, X.-F.; Pu, X.-P. Фенилетаноидни гликозиди от Cistanches salsa инхибират апоптозата, индуцирана от 1-метил-4-фенилпиридиниев йон в невроните. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]
11. Мишел, Т.; Халабалаки, М.; Skaltsounis, AL Нови концепции, експериментални подходи и стратегии за дерепликация за откриване на нови фитоестрогени от естествени източници. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]
12.De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ингмар, Х.; Ларсен, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Насочвано от дерепликация изолиране на depsides theaflavins ST и lecanora DF от ендофитната гъба Setophoma sp. Фитохимия 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]
13. Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Слебодник, C.; Броуди, PJ; Blasiak, LC; Хил, Р.; TenDyke, K.; Шен, Й.; et al. Антипролиферативни и антиплазмодиални съединения от избрани видове Streptomyces. Bioorg. Med. Chem. Лет. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]
14. Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Насочвано от дерепликация изолиране на нови хепатопротективни тритерпеноидни сапонини от спермата на Celosiae чрез високоефективна течна хроматография, съчетана с електроспрей йонизираща тандемна квадруполна масспектрометрия с време на полет. J. Pharm. Biomed. анален 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]
15. Джан, Дж.; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ма, З.; Tu, P. Стратегия, базирана на LTQ-Orbitrap за традиционна китайска медицина, насочена към откриване на класове, идентификация и нейни omics изследвания: Казус върху фенилетаноидни гликозиди в три различни вида Herba Cistanches. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]
16. Йошизава, Ф.; Деяма, Т.; Takizawa, N.; Усмангани, К.; Ахмад, М. Съставните части на Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Изолиране и структури на нов фенилетаноиден гликозид и нов неолигнанов гликозид. Chem. Pharm. Бик. 1990, 38, 1927–1930. [CrossRef]
17. Танака, Т.; Накашима, Т.; Уеда, Т.; Томий, К.; Kouno, I. Лесна дискриминация на алдозни енантиомери чрез HPLCistancheChem с обърната фаза. Pharm. Бик. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, WS; Гуо, Д.; Уанг, XL; Ин, ZQ; Xia, B.; Li, N. Изследване на цис-канелена киселина в Arabidopsis thaliana. Физиология на растенията. Biochem. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]
19. Kahnt, G. Транс-цис-равновесие на хидроксиканелени киселини по време на облъчване на водни разтвори при различно рН. Фитохимия 1967, 6, 755–758. [CrossRef]
