Фенилетаноидни гликозиди от Paraboea Martinii защитават клетките на феохромоцитома на плъх (PC12) от клетъчно увреждане, предизвикано от водороден пероксид

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Xue Gong†a, Yan Xu†b, Kai Renc, Xiaorong Baid

Известно е, че оксидативният стрес играе съществена роля в патогенезата на няколко заболявания. Свързва се с етиологията на болестта на Алцхаймер (AD), болестта на Паркинсон (PD), епилепсията и други заболявания [1–3]. Понастоящем е постигнат непрекъснат напредък в изследването на патогенезата на AD, PD и други заболявания. Въпреки това, поради ограниченото познаване на молекулярните механизми, лежащи в основата на AD, PD и други заболявания, не са реализирани ефективни превантивни или лечебни стратегии за тези заболявания [4]. H2O2 е важен компонент на реактивните кислородни видове (ROS). Съответно, индуцираното от H2O2- PC12 клетъчно увреждане е най-често използваният модел на оксидативен стрес и се използва широко в експериментални изследвания на невропротективни ефекти [5]. Хем оксигеназа 1 (HO -1) и глутамат-цистеин лигаза-каталитична субединица (GCLC) са важни клетъчни антиоксидантни ензими и двата гена се регулират надолу по веригата на ядрения фактор еритроид 2 (Nrf2), който се очертава като обещаващо терапевтично средство цел за невропротекция [6,7]. Фенилетаноидните гликозиди, получени от единицата C-6-C-3, съдържат много фенолни хидроксилни групи и имат значителна антиоксидантна активност и активност против стареене. През последните няколко години проучванията показват, че много лечебни растения съдържат фенилетаноидни гликозиди, които показват значителна антиоксидантна активност. Например фенилетаноидни гликозиди, получени отHerba cistancheса известни, че упражняват защитни ефекти върху когнитивните дефицити при AD. Това проучване изследва свързания защитен механизъм, използвайки модел на склонна мишка 8 (SAMP8) с ускорено стареене на AD. Резултатите показват, че способността на фенилетаноидните гликозиди да подобряват когнитивните дефицити при SAMP8 мишки може да бъде свързана с насърчаването на синаптичната пластичност, включваща антиоксидантни процеси [8]. В това изследване два фенилетаноидни гликозида бяха отделени и пречистени от чепове от Tectona grandis (тиково дърво); тези съединения показват забележими антиоксидантни ефекти, които са определени с помощта на амперометричен метод [9]. Освен това, кафеоил фенилетаноидни гликозидни съединения от Lindernia ruellioides упражняват зависими от дозата антиоксидантни и супероксидни анионни ефекти на освобождаване на свободните радикали in vitro [10]. Механизмите на действие на фенилетаноидните гликозиди са свързани с регулирането на Nrf2/ARE сигналния път, който влияе върху синтеза на SOD, CAT, GSH-PX и други антиоксидантни ензими [11]. Семейство Gesneriaceae, което съдържа 150 рода и приблизително 3700 вида, е разпространено предимно в тропическите и умерените региони на Източна и Южна Азия, Океания, Южна Америка, Африка, Южна Европа и Мексико [12].

Herba cistanche

Gesneriaceae в Китай. Съобщава се, че приблизително 100 вида имат медицинска ефикасност и повечето от тях са разпространени главно в провинциите Гуанси и Гуейджоу [13]. През последните години изследванията върху растенията Gesneriaceae постепенно се увеличиха в различни части на света и бяха открити някои нови съставки с физиологична активност [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt принадлежи към Parabola (Gesneriaceae) и е тревисто растение. Въз основа на "The Chinese Traditional Medicine Resource Records" е записано, че цялото растение се използва като лекарство. Освен това, той може да упражнява много фармакологични действия при състояния като хематемеза, оток, дизентерия, травматично нараняване и фрактура [15]. Бай доказа, че фенилетаноидните гликозиди са една от основните химични съставки на растенията Gesneriaceae [16]. Някои изследователи също са открили, че фенилетаноидните гликозиди имат значителна антиоксидантна активност [17]. Li демонстрира, че фенилетаноидните гликозиди наCistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 процента) от осем фенилпропаноидни гликозида се измерва чрез метода за нормализиране на площта на пика HPLC. Като пример, хроматографските диаграми на парабозид B и парабозид II са показани на Фигура 1 и тяхното относително съдържание е установено, че е съответно 98,23 процента и 99,20 процента. Слабо диференцираната клетъчна линия на надбъбречен феохромоцитом на плъх (PC12) е закупена от клетъчната банка в Китайската академия на науките (Шанхай, Китай). Модифицираната на Dulbecco среда на Eagle (DMEM) и конски серум бяха закупени от Gibco (Gaithersburg, MD, USA). Фетален говежди серум (FBS) беше закупен от Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, USA). H2O2 беше получен от Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Китай). Trizol е закупен от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, САЩ). PrimeScriptTM RT реагентен комплект (Perfect Real Time) е получен от TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, Китай). Праймерите за HO-1, GCLC и GAPDH са синтезирани от Sangon Biotech (Шанхай, Китай). Комплектът CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) беше получен от Promega Corp. (Madison, USA). Инхибитори на HO-1 цинков протопорфирин (ZnPP) са закупени от Sigma Chemical Co. (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Използвани са също Thermo311 CO2 Incubator (Thermo, САЩ), StepOnePlusTM Real-Time PCR Instrument Thermal Cycling Block (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo) и xCELLigence RTCA DPlus Analyzer и E-Plate 16 (ACEA Biosciences, САЩ). .

Cistanche deserticola

Клетъчна култура и лечение

PC12 клетки се отглеждат в DMEM, съдържащ 5 процента FBS и 5 процента конски серум при 37 градуса в овлажнена 5 процента CO2 атмосфера. PC12 клетките бяха разделени на три групи, както следва: контролна група, моделна група и група за лечение. Осем фенилпропаноидни гликозида бяха разтворени в DMSO (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">

Определяне на H2O2

Ние определихме подходящата концентрация на H2O2 с помощта на клетъчен анализ в реално време (RTCA). PC12 клетки се посяват в CIM-плоча-16 микроплака при обем от 100 µL и след това се инкубират в продължение на 12 часа при 37 градуса в атмосфера от 5 процента CO2. PC12 клетките бяха разделени на контролни и моделни групи. След това към моделните групи се добавят 10 μL H2O2 (50, 100, 200 и 400 μM) и контролните групи се третират с 10 μL пълен DMEM, поставен в три комплексни ямки. E-Plate 16 се поставя в xCELLigence RTCA, наблюдава се на всеки 15 минути и резултатите се записват за 32 часа. Ефектът на H2O2 върху PC12 клетки се анализира с помощта на софтуера за анализ на данни xCELLigence RTCA. Стойността на клетъчния индекс (CI) се използва за определяне на оптималната концентрация на H2O2 и продължителността на действие.

Извличане и изолиране на съединение

Фракциите се разделят въз основа на тяхната полярност, като се използват описаните по-горе методи. Изсушен на въздух прахообразен P. martini (4 kg) се екстрахира последователно три пъти със 75% воден разтвор на етанол [20]. След това получените екстракти се концентрират с помощта на ротационен изпарител за отстраняване на етанола и се получават сурови екстракти. Пробите се разтварят в дейонизирана вода и след това се екстрахират последователно с петролев етер, етилацетат, n-бутанол и вода. Екстрактът от n-бутанол (400 g) се фракционира с помощта на колона с макропореста смола AB-8 и разтвор на етанол-H2O2 (0, 1{{47} }, 30, 50, 70 и 95 процента ). Накрая бяха получени шест фракции (фракции 1–6). Фракции 3 и 4 бяха подложени на разделяне с помощта на MCI колона със стъпков градиент на MeOH-H2O2 (10-100 процента). След това продуктите се изолират с помощта на Sephadex LH-20 с 50 процента МеОН като елуент. Съединения 1 (41,0 mg) и 6 (15,6 mg) бяха изолирани от фракция 3. Съединения 2 (62,0 mg), 3 (34,7 mg), 7 (11,0 mg) и 8 (26,0 mg) бяха получени от фракция 4 с помощта на Sephadex LH-20 хроматография с 50 процента МеОН като елуент. Окончателните изолации се извършват чрез полупрепаративна HPLC с обърната фаза (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) с 50 процента МеОН и UV детекция при 280 nm, за да се получат съединения 4 (39,0 mg) и 5 ​​(9,0 mg) [20].

Анализ на клетъчната жизнеспособност

PC12 клетки се посяват в 96-плаки с ямки при плътност 2 × 1{{10}}4 клетки/ямка при краен обем от 100 µL . PC12 клетките се инкубират при 37 градуса с 5 процента CO2 в продължение на 12 часа. След това клетките бяха третирани с различни концентрации на сурови екстракти (0.025, 0.05, 0.1, 0.2 и 0.4 mg/mL) и съединения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 при пет концентрации (3.125, 6.25, 12.5, 25 и 50 μM). След предварителна обработка за 24 часа, клетъчната жизнеспособност се определя чрез MTS анализи. PC12 клетките се инкубират предварително с или без инхибитора HO-1 без ZnPP (15 μM) за 30 минути, след това се инкубират с или без калеолариозид B, парабозид B и парабозид II (3,125 μM) за 12 часа и накрая се инкубират с 400 μM H2O2 за още 6 часа. След третирането, броят на оцелелите клетки се определя чрез MTS анализ [6].

Защитни ефекти на суровите екстракти и мономерни съединения върху третирани с H2O2-PC12 клетки

Клетките се култивират в {{0}}плака с ямки при краен обем от 100 µL. Серийни разреждания на сурови екстракти (0.025, 0,05, 0,1, 0,2 и 0,4 mg/mL) бяха добавени към третираната група. След предварителна обработка в продължение на 12 часа, 400 μM разтвор на H2O2 (оптимална концентрация) се добавя към третираната група и групата H2O2 на всяка ямка за 6 часа. След това към всяка ямка се добавя MTS разтвор и плочите се инкубират в продължение на 3 часа при 37 градуса С. Плаките се люлеят при ниска скорост в продължение на 5 минути при стайна температура, докато всички кристали се разтворят напълно. Клетъчната защита се определя въз основа на резултатите от MTS анализ съгласно 2204 X на производителя. GONG ET AL. Изтеглено от https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 от гост на 27 август 2021 г. инструкции. Оптичната плътност се определя при дължина на вълната на абсорбция 490 nm. Освен това проследихме активността на съединения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8, изолирани от фракции 3 и 4. Серийни разреждания на съединения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 (3.125, 6.25, 12.5, 25 и 50 μM) бяха добавени към третираната група, за да се определят техните съответни защитни ефекти върху H2O2-индуцирани PC12 клетки.

фенилетаноидни гликозиди от Cistanche deserticola: Защитава невроните и предотвратява стареенето

Количествен PCR в реално време (qRT-PCR)

PC12 клетките бяха събрани на 12-ия час след третиране с 3.125 μM калеолариозид B, парабозид B и парабозид II. Общата РНК се екстрахира с помощта на TRIzol-реагент и аликвотни части от общата РНК се транскрибират обратно с помощта на Primescript RT Master Kit съгласно инструкциите на производителя. Следните праймери бяха използвани за експериментите в съответствие с предишен доклад [21]. HO-1: Напред 5′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG-3′, Назад 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: Напред 5′ - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3′, Назад 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: Напред 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, Назад 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3′. След това аликвотни части от получените сДНК се амплифицират чрез PCR. Реакционните условия са както следва: първоначална денатурация при 95 градуса (30 s), последвана от 40 цикъла при 95 градуса (5 s), 60 градуса (34 s) и 72 градуса (35 s). Всички праймери бяха тествани и FL флуоресцентният сигнал беше открит; след това стойността △Ct беше изчислена и относителните стойности бяха сравнени с тези на контролната група, като се използва следното уравнение: △Ct=Ct (проба) − Ct (ендогенна контрола), △△Ct {{36} } △Ct (проба) −△Ct (нетретирана) и сгънете промяна=2−△△Ct. Като вътрешен контрол се използва глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH).

Екстракция на протеини

PC12 клетки се посяват върху 100- mm блюда при 1 × 107 клетки/блюдо. След прикрепването, клетките се третират съответно с калеолариозид В, парабозид В и парабозид II (3.125 цМ) в продължение на 12 часа. След това гликозидите се отстраняват и клетките се инкубират с H2O2 за още 6 часа. След инкубиране, клетките се промиват два пъти със студен PBS и се изстъргват от блюдата с 1 mL PBS. Клетъчните хомогенати се центрофугират при 1500 rpm за 10 минути. След третиране, клетъчните протеини се екстрахират с помощта на Beyotime RIPA буфер за клетъчен лизис с 1 mM PMSF съгласно инструкциите на производителя. В допълнение, цитоплазмените и ядрените протеини бяха изолирани, както е описано в протокола за комплект за ядрена и цитоплазмена екстракция на Beyotime. Концентрациите на протеини в пробите бяха открити с помощта на комплект за анализ на протеини Beyotime BCA и всички проби бяха съхранявани при -80 градуса за Western blotting анализ [6].

Western blot анализ

SDS-PAGE електрофореза се извършва след екстракция и последваща денатурация на общия протеин от различни групи. След електрофореза, протеинът се прехвърля в PVDF мембрани, които след това се блокират с 5% обезмаслено мляко на прах в продължение на 4 часа. След промиване, първично антитяло (заешко поликлонално антитяло GAPDH (1:10, 000 разреждане), заешко поликлонално антитяло HO-1 (1:1000 разреждане) или заешко поликлонално антитяло GCLC (1:1000 разреждане) се добавя към мембраните, които се инкубират една нощ при 4 градуса. На следващия ден PVDF мембраните се промиват три пъти в TTBS. След това вторично антитяло (конюгиран афинитет чист кози анти-заешки IgG (1:1000 разреждане), белязан с пероксидаза от хрян се добавя към мембраните, които след това се инкубират при стайна температура в продължение на 2 ч. PVDF мембраните се промиват и се подлагат на ECL хемилуминесцентен реагент за откриване за сигнализиране на експозиция върху рентгенов филм, който след това се фиксира и сканира [22].

Статистически анализ

Данните бяха анализирани с помощта на SPSS 19.0 и резултатите са представени като средни стойности със стандартно отклонение (SD) от три независими експеримента. Счита се, че стойностите на p < 0.05="" показват="" статистически="" значими="">

Резултати Създаване на H2O2 модел

Както е показано на Фигура 2, H2O2 при 50, 100 и 200 μM не причинява подходящо ниво на клетъчна смърт. Въпреки това, 400 μM H2O2 действа върху PC12 клетки в рамките на 2–6 часа и окислителното увреждане на клетките има тенденция да бъде стабилно. Следователно, ние считаме, че индукцията с H2O2 при концентрация от 400 μM за 6 часа е подходяща за имитиране на увреждане, предизвикано от оксидативен стрес на PC12 клетки.

Защитни ефекти на суровите екстракти върху PC12 клетки, третирани с H2O2

В сравнение с този в моделната група H2O2 (Фигура 3), n-бутанолният екстракт при концентрации от 0.05, 0.1, {{10} }.2 и 0.4 mg/mL значително подобряват окислителното увреждане на PC12 клетките, предизвикано от H2O2 (p < 0.05)="" по="" начин,="" зависим="" от="" концентрацията.="" тези="" данни="" предполагат,="" че="" фракцията="" на="" n-бутанол="" съдържа="" по-мощна="" защитна="" активност.="" екстрактите="" от="" петролев="" етер="" и="" етилацетат="" обаче="" показват="" защитна="" активност="" само="" при="" високи="" концентрации="" (петролев="" етер:="" 0.1="" и="" 0.2="" mg/ml,="" p="">< 0.{{31}="" }5;="" етил="" ацетат:="" 0,2="" и="" 0,4="" mg/ml,="" p="">< 0,05).="" освен="" това,="" различни="" концентрации="" на="" екстракти="" от="" водна="" фаза="" не="" показват="" защитни="" ефекти="" (p=""> 0.05). Освен това добавихме данни от валидиращо проучване, използващо SH-SY5Y клетъчни линии на човешки невробластом (SH-SY5Y) в Допълнителния файл. Третирането с 250 μM H2O2 води до намалена жизнеспособност на клетките; обаче, лечението с калеолариозид B, парабозид B и парабозид II (3,125, 6,25, 12,5, 25 и 50 μM) значително намалява клетъчната смърт на SH-SY5Y. Резултатите от експеримента доказват, че калеолариозид B, парабозид B и парабозид II защитават SHSY5Y клетките от H2O2-индуцирано клетъчно увреждане.

Структури на съединения, изолирани от фракцията на n-бутанол

За да потвърдим, че екстрактът от n-бутанол съдържа активни компоненти, допълнително фракционирахме осем съединения от екстракцията. Структурите на съединения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 бяха идентифицирани чрез различни спектрални данни (1H-NMR, 13C-NMR и ESI-MS) въз основа на сравнения с публикувани данни за парабозид A , парабозид B, парабозид I, парабозид II, парабозид III, нуомиозид A, калеолариозид B и изонуомиозид A, съответно [20]. Например, данните за парабозид В са както следва: кафява гума; ½ 20 D −55.7 (c 0.05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (logε): 220 (3,61), 291 (3,54), 330 (3,66) [20]; IRKBr max cm−1 : 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm−1 [20]; за 1Н и 13С NMR спектроскопски подробни данни, показани в справка 20; HR-ESI-MS (отрицателен) m/z 741.2231 [MH]− (изчислено за C33H41O19, 741.2242) [20]. Данните за парабозид II са както следва: бели аморфни прахове; ½ 20 D -80.5 (c 0.05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (logε): 229 (3.74), 322 (3.73) [20]; IRKBr max cm−1 : 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm−1 [20]; за 1Н и 13С NMR спектроскопски подробни данни, показани в справка 20; ESI-MS (отрицателен) m/z 637

Защитни ефекти на изолирани съединения срещу H2 O2-индуцирана токсичност в PC12 клетки

Използвани са MTS анализи за изследване на ефекта на изолирани съединения върху жизнеспособността на PC12 клетки, изложени на H2O2-индуцирана токсичност. Както е показано на фигура 5, в сравнение с тези в контролната група, PC12 клетки, предварително третирани с пет различни концентрации на калеолариозид B, парабозид B, парабозид II или парабозид A (3,125, 6,25, 12,5, 25 и 50 μM) за 24 часа не показват значителни разлики в жизнеспособността на клетките (p> 0.05). По този начин, предварителната обработка на PC12 клетки с калеолариозид B, парабозид B и парабозид II не води до цитотоксичност. Както е показано на Фигура 6, 400 µM H2O2 значително намалява клетъчната жизнеспособност в сравнение с тази в контролната група. Освен това, клетъчната жизнеспособност на третирани с H2O2- PC12 клетки значително се повишава след предварителна обработка на PC12 клетки с различни концентрации на калеолариозид B, парабозид B и парабозид II; освен това, клетъчната жизнеспособност е най-висока след третиране с 50 µM калеолариозид B, 50 µM парабозид B и 12,5 µM парабозид II. Другите пет съединения не показват значителни защитни ефекти върху третирани с H2O2-PC12 клетки. За да илюстрираме това откритие, ние обсъждаме един от тях като пример, докато другите не са описани в ръкописа.

Нива на транскрипция на HO-1 и GCLC

След това тествахме нивата на транскрипция на HO {{0}} и GCLC в PC12 клетки, третирани с калеолариозид B, парабозид B и парабозид II. Общата иРНК се събира от третирани и нетретирани PC12 клетки в продължение на 12 часа и след това се подлага на експресионен анализ чрез qRT-PCR. Както е показано на Фигура 7(a,c,e), нивата на транскрипция на HO-1 значително се повишават, след като PC12 клетките са предварително третирани с посочените концентрации на калеолариозид B, парабозид B и парабозид II в продължение на 12 часа (p < 0.05).="" както="" е="" показано="" на="" фигура="" 7="" (b),="" транскрипционните="" нива="" на="" gclc="" също="" значително="" се="" повишават="" в="" pc12="" клетки,="" предварително="" третирани="" с="" посочените="" концентрации="" на="" калеолариозид="" в="" за="" 12="" часа.="" въпреки="" това,="" нивата="" на="" gclc="" в="" pc12="" клетки,="" предварително="" третирани="" с="" парабозид="" b="" в="" продължение="" на="" 12="" часа,="" намаляват="" значително="" в="" сравнение="" с="" тези="" в="" моделната="" група="" (p=""><0.05; фигура="" 7="" (d)).="" освен="" това,="" при="" лечение="" с="" парабозид="" ii,="" нивата="" на="" gclc="" в="" pc12="" клетки="" не="" се="" различават="" значително="" в="" сравнение="" с="" тези="" в="" моделната="" група="" (p=""> 0.05; Фигура 7 (f)).

Изразяване на HO-1 и GCLC

HO{{0}} и GCLC са важни клетъчни антиоксидантни ензими и двата са Nrf2-регулирани гени надолу по веригата. Протеиновата експресия на HO-1 и GCLC също се наблюдава след третиране [6]. Фигура 8 показва протеиновите нива на HO-1 и GCLC в PC12 клетки след третиране с 400 μM H2O2; резултатите показват, че флуоресцентните интензитети на FL на HO-1 в групите с калеолариозид B и парабозид B са по-големи от тези в групите, третирани с H2O2- (Фигура 8(a,c)). Въпреки това, експресията на GCLC не се променя значително от съединенията, с изключение на калеолариозид B (Фигура 8 (b)). След това бяха използвани химически инхибитори на HO -1 за допълнителна оценка на ролите на антиоксидантните ензими в регулирането на защитните ефекти, упражнявани от калеолариозид B, парабозид B или парабозид II срещу H2O2-индуцирана цитотоксичност. Калеолариозид B, парабозид B и парабозид II (3,125 µM) предотвратяват цитотоксичност, предизвикана от H2O2-, но тези защитни ефекти се обръщат от инхибитора на HO-1 ZnPP (p <0,01) при="" 15="" µm="" (фигура="" 8="">

Ползата от Cistanche: Увеличава мъжката репродукция

Дискусия

Застаряването на населението е сериозен глобален проблем. Много заболявания са свързани със сенилността, като AD и PD, които са сериозна заплаха за общественото здраве. AD и PD се очертаха като третите най-смъртоносни заболявания в световен мащаб след сърдечно-съдовите заболявания и рака. Следователно невродегенерацията се превърна в спешна изследователска тема в световен мащаб. Въпреки това, патогенезата на AD и PD, невродегенеративни заболявания на централната нервна система, остава неясна досега. Освен това има само няколко лекарства, които могат ефективно да лекуват AD или PD поради техните сложни патогенни механизми [23]. Предишни проучвания показват, че ROS, като супероксиден анион (O2−) и H2O2, са основните фактори, допринасящи за невродегенеративните заболявания. Патологичните промени по време на PD включват невронална дегенерация и смърт на субстанция нигра и стриатален допамин [24,25]. Съответно е важно да се разработят ефективни антиоксидантни лекарства за лечение на PD и такова откриване на лекарства се превърна във важна изследователска посока [26]. Понастоящем сигнализиращият път на Nrf2/ARE изглежда е най-важният път на ендогенния антиоксидантен стрес [27]. Ares се намира в 5′- изпълните класиращи региони на гени, като HO-1 и GCLC [28,29]. HO-1 и GCLC са гени, свързани с Nrf2-, които се регулират надолу по веригата на този протеин [6]. ARE могат впоследствие да повлияят на нивата на антиоксиданти и да активират експресията надолу по веригата на HO-1 и други защитни гени, което може да подобри защитните дейности на клетките [30,31]. Освен това констатациите предполагат, че защитните ефекти на ресвератрол срещу A {{2{{50}}}} индуцирана токсичност в PC12 клетки възникват чрез регулиране на експресията на HO-1 чрез активиране на вътреклетъчния Nrf2 сигнален път [32]. PC12 клетките са приет модел на невронни клетки и се използват широко в проучвания за невропротективен ефект [33]. H2O2 може лесно да премине през клетъчната мембрана и да се комбинира с желязото, за да образува високоактивни свободни радикали, които предизвикват оксидативен стрес и клетъчно увреждане [34]. H2O2 е важен ROS и свободните радикали се генерират лесно и са относително стабилни, поради което те обикновено се използват за установяване на модел на оксидативен стрес с помощта на PC12 клетки [5]. В това проучване предварителната обработка на PC12 клетки с нетоксични концентрации на растителния екстракт предпазва клетките от H2O2-индуцирана цитотоксичност чрез намаляване на генерирането на ROS. Фенилетаноидните гликозиди съдържат много фенолни хидроксилни групи, които имат антиоксидантна активност и активност против стареене. В това проучване открихме, че екстракцията с n-бутанол дава по-добра защита от фракциите с друга полярност (Фигура 3). По този начин, ние допълнително скринирахме защитните активности на осем съединения, изолирани от n-бутаноловата фракция. Резултатите показаха за първи път, че Фигура 8. Анализ на нивата на HO-1 и GCLC протеин върху PC12 клетки. ( а ) Western blotting анализ на експресията на HO-1 и GCLC и GAPDH се използва като контрола на натоварването. ( b ) Western blot анализ Експресия на GCLC протеин. (c) Western blot анализ експресия на HO-1 протеин. (d) HO -1 инхибиторът ZnPP намалява невропротективния ефект. Данните са представени като средни стойности ± SD, n=3. ***p < 0.001="" спрямо="" контролна="" група;="" #p="">< 0,05="" спрямо="" h2o2="" група="" (без="" znpp="" третирана),="" ##p="">< 0,01="" спрямо="" h2o2="" група="" (без="" znpp="" третирана),="" ###p="">< 0,001="" спрямо="" h2o2="" група="" (без="" znpp="" третирана);="" и="" p="">< 0.01,="" спрямо="" h2o2="" група="" (с="" третиран="" znpp)="" и="" &p="">< 0.001,="" спрямо="" h2o2="" група="" (с="" znpp="" третиран).="" (контролна="" група;="" моделна="" група:="" h2o2;="" znpp="" отрицателна="" група:="" калеолариозид="" b="" плюс="" h2o2,="" парабозид="" b="" плюс="" h2o2,="" парабозид="" ii="" плюс="" h2o2;="" znpp="" положителна="" група:="" znpp="" плюс="" калеолариозид="" b="" плюс="" h2o2,="" znpp="" плюс="" парабозид="" b="" плюс="" h2o2,="" znpp="" плюс="" парабозид="" ii="" плюс="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" et="" al.="" изтеглено="" от="" https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145="" от="" гост="" на="" 27="" август="" 2021="" г.="" калеолариозид="" b,="" парабозид="" b="" и="" парабозид="" ii="" имат="" значителни="" защитни="" ефекти="" срещу="" h2o2-="" индуцирано="" окисление="" увреждане="" в="" pc12="" клетки.="" резултатите="" също="" така="" показват,="" че="" лечението="" с="" h2o2="" предизвиква="" значително="" увреждане="" на="" pc12="" клетките="" и="" намалява="" жизнеспособността="" на="" клетките,="" докато="" лечението="" с="" калеолариозид="" b,="" парабозид="" b="" и="" парабозид="" ii="" значително="" смекчава="" тези="" ефекти="" (фигура="" 6).="" предишно="" проучване="" съобщава,="" че="" пътят="" на="" nrf2/are="" е="" един="" от="" най-важните="" ендогенни="" антиоксидантни="" пътища="" и="" може="" да="" регулира="" експресията="" на="" маркери="" надолу="" по="" веригата,="" като="" ho="" -1,="" за="" защита="" на="" клетките="" [7].="" резултатите="" от="" qrt-pcr="" и="" western="" blotting="" анализите="" показват,="" че="" калеолариозид="" b,="" парабозид="" b="" и="" парабозид="" ii="" значително="" повишават="" нивата="" на="" ho="" -1.="" въпреки="" това,="" транскрипционните="" нива="" на="" gclc="" значително="" се="" повишават="" в="" pc12="" клетки,="" предварително="" третирани="" с="" калеолариозид="" b,="" но="" намаляват="" в="" тези,="" предварително="" третирани="" с="" парабозид="" b,="" в="" сравнение="" с="" тези="" в="" моделната="" група.="" освен="" това,="" парабозид="" ii="" не="" променя="" експресията="" на="" този="" маркер="" в="" сравнение="" с="" тази="" в="" моделната="" група="" (фигури="" 7="" и="" 8="" (a-c)).="" в="" допълнение,="" защитните="" ефекти="" на="" калеолариозид="" b,="" парабозид="" b="" и="" парабозид="" ii="" срещу="" h2o2-индуцирано="" pc12="" клетъчно="" увреждане="" бяха="" обърнати="" от="" ho-1="" инхибитора="" znpp="" (фигура="" 8(d)).="" в="" заключение,="" фенилетаноидните="" гликозиди="" калеолариозид="" b,="" парабозид="" b="" и="" парабозид="" ii="" ефективно="" защитават="" pc12="" клетките="" от="" h2o2-индуцирано="" окислително="" увреждане.="" съответно,="" тези="" съединения,="" изолирани="" от="" p.="" martini,="" могат="" да="" представляват="" потенциални="" кандидати="" за="" лекарства="" за="" лечение="" на="" невродегенеративни="">

Ползите от Cistanche:лечение на невродегенеративни заболявания

Препратки

[1] Butterfield DA. Перспективи за оксидативния стрес при болестта на Алцхаймер и прогнози за бъдещи изследвания. J Alzheimers Dis. 2018; 64: 1–11.

[2] Chignon C, Tomas M, Bonnefontrousselot D, et al. Оксидативен стрес и амилоид-бета пептид при болестта на Алцхаймер. Redox Biol. 2018; 14: 450-464.

[3] Guo JD, Zhao X, Li Y, et al. Увреждане на допаминергичните неврони от оксидативен стрес при болестта на Паркинсон (преглед). Int J Mol Med. 2018; 41: 1817–1825.

[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH, et al. Асоциация на полиморфизми rs823128, rs1572931 и rs823156 с намалени рискове от болестта на Паркинсон. Невроотчет. 2017; 27: 936-941.

[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX и др. Антиоксидантното действие на 7,8-дихидроксифлавон защитава PC12 клетките срещу 6-индуцирана от хидроксидопамин цитотоксичност. Neurochem Int. 2014; 64: 18-23.

[6] Li MQ, Xu T, Zhou F, et al. Невропротективни ефекти на четири фенилетаноидни гликозида върху H2O2-индуцирана апоптоза върху PC12 клетки чрез Nrf2/ARE пътя. Int J Mol Sci. 2018; 19: 1135.

[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E, et al. Nrf2-ARE път: нововъзникваща цел срещу оксидативен стрес и невровъзпаление при невродегенеративни заболявания. Pharmacol Therapeut. 2016; 157: 84-104.

[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP и др. Ефектите на фенилетаноидните гликозиди, получени отHerba cistanche, върху когнитивните дефицити и антиоксидантните активности при мъжки SAMP8 мишки. J Toxicol Env Heal A. 2017; 80: 1180–1186.

[9] Цветков DE, Дмитренок AS, Цветков YE и др. Фенилетаноидни гликозиди от възли от тиково дърво и тяхната антиоксидантна активност. J Biol Active Prod Nat. 2016; 6: 272-281.

[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ и др. Антиоксидантна активност на кафеоил фенилетаноидни гликозидни съединения от Lindernia ruellioides in vitro. Cent South Pharm. 2017; 15: 1687–1690.

[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L, et al. Роля на пътя на Nrf2-ARE при увреждане от оксидативен стрес и връзката му с други сигнални пътища. Anim Husbandry Feed Sci. 2016; 37: 42-48.

[12] Zheng XK, Li J, Feng WS и др. Напредък в изследването на Gesneriaceae. Chin J Ново лекарство. 2003; 12: 261-263.

[13] Wen F, Li ZD. Напредък в изследванията върху растението Gesneriaceae. Чин Диви растителни ресурси. 2006; 25: 1–6.

[14] Yan WY, Chen L, Wang JM и др. Напредък на изследванията на тритерпеноиди от растения Gesneriaceae. Nat Prod Res Dev. 2012; 24: 698-701.

[15] Китайска компания за билкови лекарства. Ресурсни записи на китайската традиционна медицина. Китай: Science Press; 1994 г.

[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG и др. Разпределение на фенилетаноидни гликозиди в лечебни растения от Gesneriaceae. Chin J Chin Mater Med. 2013; 38: 4267-4270.

[17] He ZD, Lau KM, Xu HX и др. Антиоксидантна активност на фенилетаноидни гликозиди от Brandisia hancei. J Ethnopharmacol. 2000; 71: 483-486.

[18] Li L, Shi DF, Gui YG и др. Изследване на антиоксидантната активност нафенилетаноидни гликозиди от Cistanche deserticola. J Anhui Agri Sci. 2009; 32: 15835–15836.

[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y, et al. Защитни ефекти нагликозиди на цистанхевърху увреждането на PC12 клетки PARABOLA MARTINI ЗАЩИТАВА PC12 КЛЕТКИ ОТ H2O2-ИНДУЦИРАНО НАВРЕЖДАНЕ 2211