Част Ⅱ: Свръхекспресията на PKD1 причинява поликистозно бъбречно заболяване

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Каролайн Тивиерж, Алмира Курбегович, Мартин Куилард, Ричард Гийом, Оливие Коте и Мари Трудел

Патогенетичните механизми в основатаавтозомно доминантно поликистоза на бъбреците(ADPKD) остава да бъдат изяснени. Въпреки че има доказателства, че PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) хаплонедостатъчността на гена и загубата на хетерозиготност може да причини образуване на кисти при мишки, парадоксално високи нива на PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) експресия е открита в бъбреците на пациенти с ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване). За да определите дали PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) повишаване на функцията може да бъде патогенетичен процес, PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) бактериална изкуствена хромозома PKD1 (поликистоза на бъбреците 1)-BAC) беше модифициран чрез хомоложна рекомбинация, за да се насочи единствено към устойчив PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) експресия за предпочитане пред бъбреците на възрастни. Бяха генерирани няколко трансгенни линии, които специфично свръхекспресират PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) трансген в бъбреците 2- до 15-сгъване над PKD1 (поликистоза на бъбреците1) ендогенни нива. Всички трансгенни мишки възпроизводимо развиват тубулни и гломерулни кисти и бъбречна недостатъчност и умират от бъбречна недостатъчност. Този модел демонстрира, че свръхекспресията на див тип PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) сам по себе си е достатъчен, за да предизвика цистогенеза, наподобяваща човешка ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците). Нашите резултати също така разкриха поразително повишена бъбречна експресия на c-Myc при мишки от всички трансгенни линии, което показва, че c-Myc е критичен in vivo ефектор надолу по веригата на PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) молекулярен път. Това проучване не само създаде безценен и първи PKD（поликистоза на бъбреците）модел за оценка на молекулярната патогенеза и терапии, но също така предоставя доказателства, че усилването на функцията може да бъде патогенетичен механизъм при ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване).

Cistanche лекува бъбречни заболявания

НАТИСНЕТЕ ТУК ЗА ЧАСТ Ⅰ

РЕЗУЛТАТИ

Производство на PKD1 (поликистоза на бъбреците 1)-Ac-BAC чрез хомоложна рекомбинация. За да определите дали PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) усилването на функция само по себе си е достатъчно, за да произведе фенотипа на ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване), ние първо изолирахме геномен клонинг, съдържащ целия PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) ген в библиотека BAC вектор 129/Sv. Тази библиотека беше скринирана чрез PCR с два комплекта праймери за PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) ген, който обхваща екзон 1 в 5'-края и екзони 39 до 40 към 3'-края (фиг. 1). Положителен BAC клонинг за PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) беше идентифициран ген, който включва цялото съседно Tsc2 генно тяло. Вложката PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1) беше характеризирана подробно, за да се гарантира, че геномната структура съответства на тази на ендогенната PKD1 (поликистоза на бъбреците1) ген на миши щам 129/Sv, от който е получен вложката, и от инбреден щам C57BL/6J. Геномни карти на PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) локус в BAC и в тези инбредни щамове чрез Southern blot анализ, с четири смилания с рестрикционни ензими и седем сонди, покриващи целия PKD1 (поликистоза на бъбреците 1)ген, изглеждаше идентичен без доказателства за пренареждания (фиг. 1). Този BAC съдържа -121-kb вмъкване, включително ~37 kb нагоре и -39 kb надолу по веригата на PKD1 (поликистоза на бъбреците1) ген, както е определено чрез електрофореза и секвениране.

Фиг. 2.Производство на SBPkdlrAc конструкции и трансгенни мишки. (a) Последователни събития на хомоложна рекомбинация бяха проведени върху миши Pkdl-BAC, за да се въведат две модификации: SB регулаторните елементи, вмъкнати непосредствено преди иницииращия кодон Pkdl, и мълчалива точкова мутация на EcoRI (RI*), въведена в екзон(ех) 10. BAC рекомбинантният вектор съдържа R6Ky произход на репликация, резистентен на ампицилин ген, SacB ген, RecA ген и уникално място за клониране Smal, в което са клонирани "SB" регулаторните елементи (или екзон 10 мълчалива точкова мутация). с фланкиращи Pkd1 генни рамена. BAC рекомбинационният вектор беше електропориран в Е, coli (DH10B) клетки, съдържащи Pkdl-BAC див тип, и след селекция настъпи първо хомоложно рекомбинантно събитие чрез едно от двете Pkd1 рамена за получаване на BAC коинтеграти. Рекомбинационният вектор и дублираните Pkdl области на BAC коинтегратите бяха елиминирани във втори етап на селекция. Разрешените Pkdl-BAC могат или да се върнат към див тип, или да включват предвидената модификация. След това може да бъде въведена последваща хомоложна рекомбинация в новомодифицирания BAC. (b) (ienomc ДНК от SBPkd l-etransgenic mxce беше анакЗирана чрез Sou thern blot.AVicToiD1ecLon на линеаризирани фрагменти, предизвика вмъкване на трансгена в глава до глава. - към опашка и/или ориентация от опашка към опашка. 5'-краят се анализира чрез смилане на геномна ДНК с HindIII и хибридизиран със специфичната трансгенна SB сонда (ляв панел). И трите трансгенни миши линии генерират очакваните 10 .9-kb лента за вмъкване от главата до опашката; допълнителната лента, наблюдавана в ред 39, най-вероятно представлява свързващ фрагмент между SB и мишия геном. Вътрешната цялост на трансгена беше наблюдавана чрез няколко смилания с рестрикционни ензими и показано е едно представително петно ​​от геномна ДНК, усвоена с EcoRI и хибридизирана с Pkdl сондата (екзон 7-15) (среден панел).

Този SBPKD1 (поликистоза на бъбреците 1)-BAC клонингът беше модифициран чрез две последователни събития на хомоложна рекомбинация в Е. coli. Генът PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1) беше маркиран в екзон 10 чрез заместване на нуклеотид (G към A), за да се създаде ново EcoRI място на позиция 2355 на cDNA картата. Тази тиха точкова мутация е произведена, за да се разграничи PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) ген и транскрипт на BAC от този с ендогенен произход. В допълнение сме заменили 5'регулаторните елементи на PKD1 (поликистоза на бъбреците 1)-BAC ген, като се възползва от предварително идентифицирани "SB" бъбречни епителни-специфични елементи от SBM (свързан с c-Myc) или SBF, свързан с c-fos) конструкция-транс-ген за ограничаване на експресията в бъбреците (36, 38) (фиг. 2а).

Този нов SBPkdlrAG-BAC беше усвоен с NotL, уникално място, разположено непосредствено преди SB елементите, и ClaI в Tsc2 генното тяло, съкращавайки Tsc2 регулаторните елементи и 5'-половината от генното тяло, за да се гарантира липсата на T'sc2 екзогенна експресия във всички тъкани и за премахване на прокариотните BAC векторни последователности (фиг.1 и 2). Този 70-kb NotI-ClaI линеаризиран фрагмент беше изолиран, пречистен. и количествено определени за микроинжектиране на ооцити (36).

CISTANCHE ПОЛЗА: ЛЕЧЕНИЕ НА БЪБРЕЧНИ БОЛЕСТИ

Производство и анализ на SBPkdl-ac трансгенни мишки. Четирима трансгенни основатели, носещи няколко копия на трансгена SBPkdlrAc, последователно развиват PKD. От четирите SBPKD1 (поликистоза на бъбреците 1) RAC мишки основатели, определени чрез Southern анализ, три SBPKD1 (поликистоза на бъбреците 1)TAG трансгенните линии са установени с две до девет копия на трансгена (Фиг. 2b). Характеризирането на трансгенния интегритет в тези линии беше наблюдавано с 5', вътрешни и 3' сонди, както е показано чрез представителни примери на Фиг. транс-генът е интегриран в ориентация от главата до опашката и се разкрива с 3' сондата 71-kb лента (фиг.2b). В допълнение, вътрешната сонда откри лентата от 9.4-kb ендогенна PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1), както и лентите от 6.9-kb и 2.5-kb на трансгена поради мястото на вмъкване на EcoRI в екзон 10 (фиг. 2b). Тези мишки съдържат пълни копия на трансгена въз основа на анализа на структурата на геномно припокриване.

PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) повишаване на функцията при възрастни SBPkdl-Ac трансгенни мишки. Експресия на SBPkdl-AG. трансген и PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) генът е изследван в различни органи. Количественото определяне на нивата на транскрипт от трансгенния и/или ендогенния ген се извършва чрез Northern blot анализ (Фиг. 3а). Както се очакваше, трансгенните и ендогенните генни транскрипти бяха с подобна дължина (14.2 kb). Въз основа на контролната експресия на GAPDH, бъбреците от всички SBPkd 1 A миши линии имат последователно повишена експресия на транскрипт в сравнение с нормалната PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) нива в бъбреците на възрастни (n=3) на подобна възраст. Бъбречната трансгенна и ендогенна експресия за различните трансгенни линии показва диапазон от 2- до 15- пъти над контролната бъбречна ендогенна PKD1(бъбречна поликистоза 1)нива (Фиг.3а). По-специално, трансгенната линия39(n=4) показва по-висока PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) нива от редове 3 (n=3) и 41(n=4). Освен това, PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) нивата на експресия, измерени чрез Northern blot анализ, корелират с тези, получени чрез PCR в реално време, използвайки праймери в екзони 1 и 2 (Фиг. 3b).

ФИГ.3.Анализ на бъбречна експресия на SBPkdlrA мишки. ( а ) Експресионен анализ на Pkd1 ендогенни (ендо) и SBPkdlrA трансгенни (Tg) транскрипти в бъбреци от три трансгенни линии чрез Northern blotting. Две проби от всяка трансгенна линия, 3, 39 и 41 бяха сравнени с ендогенен бъбречен Pkdl транскрипт на нормални контролни мишки, съответстващи на възрастта, от същия генетичен произход (C5BI 6I × CBA/DE, проби от бъбречна РНК бяха получени от трансгенни мишки преди краен стадий на бъбречно заболяване. Транскриптите от endo и Tg са с дължина -14.2 kb. Систематична свръхекспресия на транскриптите се наблюдава в бъбреците на всички трансгенни мишки по отношение на нетрансгенните контроли. GAPDH се използва като вътрешна контрола Количественото определяне на бъбречната експресия в тези трансгенни мишки варира от 2- до 15-кратно по отношение на Pkd1ендогенните нива от контролни мишки, произволно определени на 1. (b) Схематично представяне на SBPkdl-. трансген и праймери са използван за амплифициране на общия Pkdl, включително ендогенен и трансгенен (екзон 1 и екзон 2) и само Pkd1 трансген (В. екзон 2) чрез PCR в реално време и полуколичествен RT-PCR, RT-PCR анализът на трансгенната експресия на SBPkdlAc беше количествено определен в бъбречна и екстра бъбречни тъкани. Показана е представителна полуколичествена оценка на SBPkdl.Ac трансген (Tg), която включва проба от бъбречна тъкан (K) от една мишка от всичките три трансгенни линии (3.39 и 41) и от екстраренални тъкани. H, сърце; Лу, бял дроб; Б. мозък; Li, черен дроб; и S. далак от мишка от линия 39. Експресията на трансгена е лесно откриваема в бъбреците на всички трансгенни мишки, докато тя е ниска до неоткриваема в екстрареналните тъкани. Експресията от трансгена SBPkd1rAc продуцира специфичен 307-bp ампликон, докато вътрешната контрола S16 генерира 102-bp ампликон. M,100-bp маркер; H, O, отрицателна контрола за PCR амплификация. (c) PCR експресионен анализ в реално време на SBPkdlr. Трансгенът се определя от няколко независими мишки. Трансгенът SBPkdl.Ac от трите трансгенни миши линии 3 (n=5), 39(n =7) и 41 (n=5) показва, че линии 39 и 41 имат най-висок нива на бъбречна експресия. Експресията на SBPkdlrAc трансген в екстраренални тъкани от мишки (n=3) от трите трансгенни линии беше оценена чрез PCR в реално време. В сравнение с бъбреците на всяка трансгенна линия (100 процента), анализът на извънбъбречните тъкани показва, че нивата на трансгенна експресия са постоянно по-ниски с 10- до 1,000-пъти в мозъка, сърцето, черния дроб, панкреаса , далак и бял дроб. (d) Експресия на ендогенния c-mc ген в SBPkdl.Ac бъбреците чрез полуколичествена RT-PCR. Схематична илюстрация показва праймерите, използвани за амплифициране на c-Myc. Както се очаква, експресията на c-Myc е минимална при възрастни нетрансгенни бъбреци (контроли). Обратно, повишена експресия на c-Mye се открива във всички възрастни SBPkdlrAc бъбреци от трите линии, както се наблюдава при възрастни трансгенни SBM бъбреци, използвани като положителна контрола. Ампликонът на c-Myc беше 250 bp; ампликонът на S16, вътрешна контрола, беше 102 bp.M, 100-bp маркер.

Количественото определяне на нивата на трансгенна експресия по-специално беше извършено чрез PCR в реално време и полуколичествена RT-PCR в трите трансгенни линии в зряла възраст чрез използване на праймери в 5'-нетранслираната област (В, -глобинов промотор) и в екзон 2 на PKD1 (поликистоза на бъбреците 1)(фиг.3b). SBPKD1 (поликистоза на бъбреците 1) RAC експресията в трансгенни мишки се сравнява с S16 рибозомния протеинов генен продукт като вътрешен стандарт. Условията, използвани за полуколичествена RT-PCR амплификация, бяха в линейния диапазон. Трансгенната експресия чрез PCR в реално време и полуколичествена RT-PCR последователно и специфично показва най-високата експресия в бъбрека от всички трансгенни линии в сравнение с други органи (Фиг. 3b и c). Нивата на бъбречна експресия за отделна проба са възпроизводими с която и да е от използваните техники за откриване. Най-високите нива на PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) трансгенна бъбречна експресия беше измерена за линии 39 и 41. За да се проследи дали повишената експресия на PKD1 (поликистозно бъбречно заболяване 1) е резултат от трансгена или ендогенния ген, същата група мишки от трите трансгенни линии беше сравнена за бъбречна PKD1 ( поликистозна бъбречна болест 1) трансгенна експресия и за бъбречна PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1) обща (трансгенна и ендогенна) експресия чрез PCR в реално време. Интересно. редове 39 и 41 спрямо ред 3 показват, че увеличеният PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) трансгенната бъбречна експресия е подобна или по-висока от тази на PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1) общата бъбречна експресия, което сочи към трансгена като специфично отговорен за тази индуцирана експресия. В различни органи (включително сърце, бял дроб, мозък, черен дроб, панкреас и далак), SBPKD1 (поликистоза на бъбреците 1) RAC; трансгенът показва много слаба експресия, понякога открита в далака и белия дроб, с малка до неоткриваема експресия в други органи (фиг. 3b). Количественото определяне чрез PCR в реално време демонстрира 10-до 1,000-кратно по-ниско ниво на трансгенна експресия в екстраренални тъкани в сравнение с бъбречната експресия (фиг. 3c). "SB" регулаторните елементи на SBPkdlrAc трансгена предоставят преференциална бъбречна експресия; това специфично органно разпределение също се определя, когато се използва в трансгени, свързани с c-Myc (SBM) и c-fos (SBF) (36, 38). c-Mye, ефектор надолу по веригата на PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) сигнални пътища в SBPkdlrAc: мишки. За да придобием представа за вътреклетъчния патогенетичен механизъм на SBPkdlrAc трансгенни мишки, след това се опитахме да наблюдаваме нивото на бъбречна експресия на c-Myc въз основа на нашето предишно наблюдение на дерегулация на c-Myc в човешки ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване) бъбреци (22). Анализът на бъбреците беше извършен от трите трансгенни линии 3(n=4).39(n=7) и 41 (n =4), както и контролите (n {{9 }}). Както е показано на Фиг. 3d, има значителна експресия на ендогенен c-Mye, индуциран в SBPkdlrAa мишки по отношение на контролни мишки на подобна възраст. Интересно е, че нивото на експресия на c-Myc в някои SBPkdlrAG бъбреци, по-специално линия 39, достига нива, сравними с тези, наблюдавани в PKD SBM трансгенен миши модел, произведен от бъбречна експресия на c-Myc.

Бъбречни аномалии при SBPKD1 (поликистоза на бъбреците 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 за всяка линия) развити множество тубулни (T) и гломерулни кисти (G) (Фиг. 4d, f и g). Кисти се наблюдават в тубули от кортикалните и медуларните области, както и събирателни тубули от папилата (Фигура 4d и e). Трансгенните мишки показват тубулна епителна хиперплазия (върх на стрела), включваща както кистозни, така и не-кистозни тубули и честа хипертрофия (фиг. 4g и h). но тежестта варира между отделните мишки. Интерстициална фиброза (F). често се наблюдават периваскуларни лимфоидни инфилтрати и протеинови отливки (P) (Фиг. 4d и e)

Фиг. 4

За по-прецизно определяне на мястото на локализиране на повишената PKD1 (поликистоза на бъбреците 1)експресия в бъбреците, ние проведохме in situ хибридизация, използвайки екзон 36-45 сондата, използвана преди това (16). Сигналът за хибридизация е локализиран специфично към епителните клетки, покриващи киста и хиперпластични тубули, както и гломерулни кисти. В допълнение, известен сигнал се наблюдава върху епитела на нецистични или леко разширени тубули, вероятно идентифициращи тубули, предопределени да претърпят бъдещи кистозни промени (фиг. 4i и j). Бъбречният хистологичен анализ също е извършен върху трансгенни мишки при раждането (n=8), следродилния ден 10(P10)(n=3),P20(n=5),P35(n{ {10}}) и P45(n= 3) в сравнение с отрицателни котила от същата възрастова група (n =2 до 4). Интересното е, че всички новородени трансгенни мишки показват тубулна и гломерулна дилатация спрямо контролни отрицателни котила (фиг. 4k и 1), което показва, че бъбречните аномалии са започнали in utero, както се наблюдава при SBM мишки и при ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване) пациенти. Тубулната и гломерулната дилатация се увеличават по размер и брой с напредването на възрастта. До P35, трансгенните мишки показват по-тежка хиперплазия и доказателства за гломерулосклероза. Променени бъбречни физиологични функции при SBPkdlrsc мишки. Бъбречните физиологични функции на всички трансгенни мишки показват характеристики, подобни на PKD, докато нетрансгенните котила никога не са развили заболяването. В рамките на няколко месеца след раждането, засегнатите животни развиват хронична бъбречна недостатъчност. Тези животни се наблюдават за бъбречни функционални параметри чрез измерване на нивата в серума и урината. уреен азот в кръвта (BUN) и креатинин, осмоларитет на урината, протеин в урината и екскреция на йони (Таблица 1). Всички мишки от трите линии в сравнение с контролите показват концентрационни дефекти, често срещана находка при ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване). и следователно показаха намалено уриниране на BUN. креатинин, протеини и концентрации на желязо. Трансгенен SBPKD1 (поликистоза на бъбреците 1)rAc.основателите и потомствата (n=6) от всяка линия бяха наблюдавани качествено за протеинурия върху проби от урина чрез SDS-PAGE (фиг. 5). Мишки на възраст над 2 месеца показват неселективна протеинурия, която прогресира с възрастта. В допълнение, нивата на серумния BUN и серумния креатинин са повишени, разкривайки бъбречна недостатъчност (Таблица 2). Тъй като хроничната бъбречна недостатъчност обикновено води до промени в хематологичните параметри, те бяха изследвани в SBPkdlAc трансгенни мишки на възраст от 3 до 14 месеца (Таблица 2). Тези трансгенни мишки са анемични, както се вижда от значително намаления брой червени кръвни клетки, като хемоглобинът и хематокритът достигат половината от нормалните нива. Други параметри на червените кръвни клетки, като процента на ретикулоцитите, не са засегнати, както се очаква, когато са предизвикани от бъбречен дефект. Тези животни постоянно умират от бъбречна недостатъчност на -5.9± 2,8 месечна възраст (n {{12} }) за трансгенна линия 39 и на по-късни възрасти, -14.6± 3,1 месеца (n= 20) и -11.7 ±6,5 месеца (n=7) ,съответно за редове 3 и 41.

ЕФЕКТИ НА CISTANCHE: ЛЕЧЕНИЕ НА БЪБРЕЧНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ

ДИСКУСИЯ

Тук докладваме изолирането и характеризирането на миши PKD1 (поликистоза на бъбреците 1)-BAC. Този PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) генът беше маркиран и регулаторните елементи бяха заменени, за да насочат експресията специфично към бъбреците чрез две последователни събития на хомоложна рекомбинация. Трансгенни мишки, произведени с този нов SBPkdlrAG ген, показват 2-до 15-кратно увеличение на експресията на PKD1 (поликистозно бъбречно заболяване 1) и възпроизводимо развити ранни бъбречни морфологични изменения, типични за PKD. Бъбречната недостатъчност е очевидна на средна възраст и мишките умират преждевременно от бъбречна недостатъчност. Нашите резултати също така показват, че механизмът на свръхекспресия на PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1), отговорен за този фенотип, е медииран от сигнално активиране на c-Myc in vivo. Това проучване демонстрира, че усилването на функцията на миши PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1) в бъбреците е достатъчно, за да произведе бъбречен фенотип на PKD.

Тъй като мишият PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) генът не се дублира, както е при хората (27), ние директно идентифицирахме и изолирахме BAC клонинг, който съдържа целия PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) ген. Пълна характеристика на 129/Sv миши PKD1 (поликистоза на бъбреците 1)-BAC. индиректното сравнение с два други инбредни вида мишки потвърди целостта на локуса на PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1). PKD1 (поликистоза на бъбреците 1)-BACinsert съдържа -37 до 39 kb последователности нагоре и надолу по веригата от гена PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1). Нашият анализ показа, че PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) генът в този BAC е добросъвестен миши див тип локус, който може да послужи за по-нататъшни изследвания.

Въпреки че има сериозни доказателства, че образуването на кисти при ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване) може да е резултат от загуба на хетерозиготност след соматично инактивиране на нормалната PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) алел (3.21.32), има също предполагаеми доказателства за продължителна или дори повишена експресия на полицистин-1 в кистозния тубуларен епител (22.29). Последното наблюдение повдига въпроса дали свръхекспресията на PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1) сама по себе си е достатъчна непосредствена причина за цистогенеза. При трансгенни мишки, носещи човешка PKD1 (поликистоза на бъбреците 1), TSC2. RAB26. NTHL1 и SLC9A3R2 гени, само малка част от мишките са развили кисти и нито една не е имала откриваема трансгенна експресия в зряла възраст въпреки 30 копия на трансгена (31). При тези трансгенни мишки. беше трудно да се установи ясна роля за свръхекспресията на PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1) в цистогенезата. Нашият модел се различава, тъй като две до девет копия от див тип на PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1) самостоятелно, без съседни гени, бяха интегрирани в трансгенни мишки. Тъй като генът PKD1 (поликистозно бъбречно заболяване 1) има основни функции в различни органи или тъкани, както е описано за множество мишки с аблация на гена PKD1 (поликистозно бъбречно заболяване 1), системна свръхекспресия на PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) може да доведе до допълнителни объркващи ефекти. Следователно, ние разгледахме ролята на PKD1 (поликистоза на бъбреците 1)повишаване на функцията с помощта на подход, който е насочен към PKD1 (бъбречна поликистоза 1) специално към бъбреците. Чрез хомоложна рекомбинация, ние първо заместихме PKD1 (поликистозно бъбречно заболяване 1) нагоре по течението на регулаторната област с "SB" бъбречно ограничени регулаторни елементи, като по този начин предотвратихме намалената генна експресия, нормално наблюдавана за PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) в зряла възраст, както и потенциална вторична регулация на обратната връзка (36,38). Второ, маркирахме мишия PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) трансген (Pkdlr) с безшумна точкова мутация в екзон 10, но не е вмъкнал етикет на епитоп, за да гарантира, че ще бъде произведен напълно функционален протеин от "див тип" със запазена структура и цялост. От този модифициран BAC, SBPkdlrAG фрагмент беше пречистен от Tsc2 гена и BAC вектора, за да се предотврати интерференция от Tsc2 гена, който също може да индуцира кистичен фенотип (8.20.28). както и за избягване на инхибиторния ефект на прокариотните последователности (5).

Четири различни SBPkdlrAcтрансгенни мишки основатели и три независими линии бяха произведени със специфичен бъбречен PKD1 (поликистоза на бъбреците 1)-подобрена експресия. Особено поразително е пълното проникване на фенотипа в тези трансгенни мишки. SBPKD1 (поликистоза на бъбреците 1) rAc основател и миши линии споделят няколко физиопатологични характеристики, общи с ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване). Те включват развитието на кисти в кората, медулата и гломерулите заедно с епителна хиперплазия, интерстициална фиброза и фокално интерстициално възпаление.

Тъй като PKD фенотипът се наблюдава последователно при всички различни трансгенни мишки основатели и трансгенната интеграция в мишия геном е случайно явление, фенотипът не може да бъде резултат от ефекта на хромозомната позиция, а само от повишен PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) израз. Наистина, експресията на трансгена на PKD1 (поликистозно бъбречно заболяване 1) във всички линии е доказано, че е бъбречно ограничена. както е наблюдавано по-рано за други трансгени, регулирани от "SB" елементите (36,38). Освен това, тази повишена експресия на PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1) е причинена от трансгена, а не от индиректен ендогенен PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) активиране. Следователно нашите резултати предоставят ясни доказателства, че усилването на функцията на див тип функционален PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1) може да доведе до множество бъбречни кисти. Важно е, че тези SBPKD1 (поликистозна бъбречна болест 1) практики представляват първия миши модел, генериран от единствената свръхекспресия на миши ортолог на човешки PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) ген.

SBPkdl-Ac мишките показват, че PKD1 (поликистоза на бъбреците 1Свръхекспресията е първичен патогенетичен механизъм на бъбречната цистогенеза. Важно е, че най-високите нива на трансгенна експресия в бъбреците изглежда корелират с прогресията и тежестта на фенотипа. Установихме също, че свръхекспресията на PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1) при развитието на SBPKD1 (поликистоза на бъбреците 1)-Ac фенотипът е вероятно да сигнализира за активиране на c-Myc in vivo. Вероятно това активиране може дори да бъде директно през C-терминалната опашка на полицистин-1, подложена на протеолитично разцепване и ядрена транслокация (7). Тъй като е доказано, че повишената бъбречна експресия на c-Myc при възрастни мишки индуцира PKD, тя би било много последователно да поддържа c-Myc като основен ефектор надолу по веригата на PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) сигнални пътища. Този резултат също корелира с нашите предишни констатации за повишена експресия на c-Myc в бъбреците на всички анализирани човешки ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване) (22). Като цяло тези резултати показват, че c-Mye е основен медиатор на PKD1 (поликистоза на бъбреците 1)цистогенеза.

Нашите резултати от PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) модел на усилване на функцията, заедно с хаплонедостатъчност на миши PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1) и загуба на функция, показват, че всеки PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) дисрегулацията може да доведе до цистогенеза (2.19.23-26.31.40). Тежък дисбаланс на PKD1 (поликистозна бъбречна болест 1) при мишки, индуциран от PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) аблация или трансгенна свръхекспресия причинява ранно начало и бързо прогресиране на бъбречни кисти и засяга голяма част от тубулите. За разлика от това, по-лек PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) дисбаланс като хаплонедостатъчност води до по-бавно прогресиране на PKD с повече фокални кисти. Очевидното парадоксално развитие на подобен фенотип чрез противоположна дисрегулация на полицистин-1 може да се обясни с общия резултат, а именно относителен дисбаланс на протеиновата концентрация, който може да промени образуването или функцията на активен полицистинов мултипротеинов комплекс. Взети заедно, нашите резултати и тези на други изследователи твърдят, че механизмът на образуване на кисти при ADPKD (автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване) е вероятно да възникне от три патогенетични механизма: усилване на функцията, загуба на функция и ефекти на генната доза.

Романът SBPkdlrAc; мишките представляват мощен модел на бъбречна цистогенеза, който може да предостави основни познания за патофизиологията на PKD, PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) пътища на сигнална трансдукция и взаимодействащи партньори. Изследването на този модел може също да доведе до разработването на нови терапевтични стратегии за възстановяване на нормалния протеинов баланс в рамките на PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) мултимерен комплекс.

Cistanche лекува бъбречни заболявания и подобрява бъбречната функция

ПРЕПРАТКИ

1. Blouin, MJ, H.Beachemin, A Wright, M. E. De Paepe, M. Surrette, AM. Бо. Б. Накамото, CN. Оу, Г. Стаматоянопулос и М. Трудел. 2000. Генетична корекция на сърповидно-клетъчна анемия: прозрения с помощта на модели на трансгенни мишки Nat. Мед.17-182.

2 Boulter, C, S.Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle и R. Sandford. 2001. Сърдечно-съдови, скелетни. и бъбречни дефекти при мишки с целенасочено разрушаване на PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) ген. Proc. Natl.Acad. Sci. САЩ 9812174-12179.

3. Brasier, JL и EPHenske.1997. Загуба наполикистоза на бъбреците(PKD1）регион на хромозома 1φp13 в клетка на бъбречна киста поддържа модел на загуба на функция за патогенеза на киста. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connars, W. R Dackowski, LR.Petry, TJVan Raay, JMMilhalland, M. Venet, G. Milker, R ML Hakim, G. ML Landes, KW Klinger, F. Qiam, LF. Onuchic, T. Watnick GGGermino и N. A Doggett. 1995. Анализ на геномната последователност заавтозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяванеген предсказва наличието на богато на левцин повторение. Hum Mol, Genet.4-575-58.

5. Chada, K, J.Magram, K. Raphael, G.Radice, E. Lacy и F.Costantini. 1985. Специфична експресия на чужд -глобинов ген в еритроидната клетка на трансгенни мишки Nature 337-380.

6. Chauvet, V, F.Qian, N. Bought, Y.Cai B.Phakdeekitacharoen, LF.Onuchi, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O.Devuryst, GG Germino и M.-C. Gubler.2002. Експресия на PKDI и PKD2 транскрипти и протеини в човешкия ембрион и по време на нормалното развитие на бъбреците. Am. J.Pathol. 160973-983.

7.Chaurvet,V, X Tian, ​​H.Husson, DH Grimm, T.Wang T.Hiesberger, P. Igarashi, AMBennett, O.braghimov-Beskrovnaya, S.Somlo и MJ Caplan. 2004 Механичните стимули предизвикват разцепване и ядрени транслокация на края на pobeystin-1 C.J. Cin.Investig 114:1433-1443.

8. Cheadle, JP, MPReeve, JR Sampson и DJ Kwiatkowski 2000. Молекулен генетичен напредък при туберозна склероза. тананикам Генет10797-114.

9. Консорциум, EPKD1993. Идентифициране и характеризиране на гена за туберозна склероза на хромозома 16.Cell75:1305-1315.

10. Консорциум, EPKD1994.Theполикистоза на бъбреците 1генът кодира всичко, което може да се транскрибира в рамките на дублирана област на хромозома 16 клетка 7781-894.

11. Консорциум, Л ПК Д 1995г.Поликистоза на бъбреците: пълната структура на PKD1 (поликистоза на бъбреците1) ген и неговия протеин. Ce 81:289-298

12. Couillard, M.,R Guilkume, N Tanj, V.DAgati и M. Trudel.2002. c-Myc-индуцирана апоптоза вполикистоза на бъбрецитее независимо от взаимодействието FasL/Fas. Cancer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, M Land M Trudy 1904, Модел на човешка сърповидноклетъчна гломерулопатия. Kidney Int. 46:1337-1345.

14. GengL,Y, Segal B.PekseL N.Den Y. Pei, F.Carone, H G. Rennke, AM Glücksman-Kuis, MCSchneider, M Ericsson, STReeders и J.Zhou. 1996. Идентифициране и локализиране на полиестер, PKD1 (поликистоза на бъбреците 1) генен продукт. J. Clin. разследване. 98-2674-2682