Причината за хронично бъбречно заболяване (ХБН) - анемия

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

ЧАСТ Ⅰ: Протеинуричното хронично бъбречно заболяване е свързано с променен живот на червените кръвни клетки, деформируемост и метаболизъм

Рози Бисинджър, Травис Немков и др.

Разработването наанемияе типично усложнение на напредналхронично бъбречно заболяване(CKD) и е свързано с влошено качество на живот¹и повишен риск от сърдечно-съдови инциденти²и хоспитализация,³както и когнитивен спад.⁴Тежестта наанемиясе разглежда като независим предиктор за смъртността както при диализно-, така и при не-диализно-зависима ХБН (хронично бъбречно заболяване) пациенти.⁵Патофизиологията на бъбречно заболяване, свързаноанемияе сложен и включва дефицит на желязо и еритропоетин (ЕРО) в условията на нискостепенно възпаление, което от своя страна компрометира нормалната еритропоеза при ХБН (хронично бъбречно заболяване) пациенти.⁶При напреднала ХБН (хронично бъбречно заболяване), отговорът на EPO е неадекватно нисък по отношение на степента наанемия.^7,8 Високото разпространение на съпътстващия железен дефицит при ХБН (хронично бъбречно заболяване) е следствие от нарушена хомеостаза на желязото.⁹ Пренебрегван механизъм на загуба на желязо при ХБН (хронично бъбречно заболяване) е протеинурия, която може да доведе до загуба на свързано с трансферин желязо с урината (до 0.3 mg/ден), когато протеинурията достигне нефротичния диапазон.¹⁰Друг фактор, за който се смята, че допринася заанемияпри ХБН (хронично бъбречно заболяване) patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >преди 60 години.^6,11,12

Полза от Cistanche: лечение на бъбречно заболяване и подобряване на бъбречната функция

Скорошно проучване, използващо дихателен тест с въглероден окис, показа, че продължителността на живота на червените кръвни клетки прогресивно намалява от 120 дни при пациенти с ХБН в стадий 1 (хронично бъбречно заболяване) до 60 дни при пациенти с ХБН стадий 5 (хронично бъбречно заболяване).¹³ По-специално, трансфузия на алогенни червени кръвни клетки от здрави донори на ХБН (хронично бъбречно заболяване) пациентите са последвани от бързо изчистване на трансфузирани червени кръвни клетки без данни за хемолиза.¹²Вероятен механизъм за това наблюдение може да бъде стимулирането на подобна на апоптоза клетъчна смърт в безядрените червени кръвни клетки, което означава модел на нараняване, при който целостта на клетъчната мембрана не е компрометирана и цитоплазменото съдържание остава непокътнато.¹⁴Червените кръвни клетки, подложени на клетъчна смърт, показват различни морфологични промени в резултат на увреждане на цитоскелета, като образуване на повърхностни мехурчета, загуба на еластичност на мембраната и/или клетъчна дехидратация.¹⁵На молекулярно ниво смъртта на червените кръвни клетки е свързана с вътреклетъчно натрупване на Ca2þ, променен клетъчен енергиен статус и разрушаване на фосфолипидната асиметрия, което в крайна сметка води до екстернализиране на фосфатидилсерин (PS) върху външната плазмена мембрана.^15,16Като следствие, макрофагите и специализираните дендритни клетки бързо разпознават PS-екстернализирани червени кръвни клетки, което води до еритрозна фагоцитоза и техния катаболизъм в далака и черния дроб.¹⁷Поради объркващата патофизиология назаболяване на бъбреците– асоциирананемияпри хора, проучванията върху животни са оправдани, за да се определят допринасящите механизми. Индуцирана от доксорубицин нефропатия (DIN) при 129S1/SvImJ мишки¹⁸и мишки с индуцируем дефицит на подоцин (Nphs2Dipod)¹⁹са 2 модела, които се характеризират с индуциране на протеинурия от нефротичен диапазон в рамките на дни, прогресия до бъбречна недостатъчност след 3 седмици и смърт след 6 до 7 седмици.^19–21И двата модела на мишки ефективно рекапитулират всички етапи на човешката ХБН (хронично бъбречно заболяване). В настоящото проучване тествахме дали има прогресивна бъбречна недостатъчност при тези мишки с протеинуриязаболяване на бъбрецитевлияе върху продължителността на живота на червените кръвни клетки и допринася заанемия. Успоредно с това изследвахме фенотипа на RBC в кръвта, взета от ХБН (хронично бъбречно заболяване) пациенти с протеинурия от нефротичен диапазон.

ХБН (хронично бъбречно заболяване) ианемия: CISTANCHE

МЕТОДИ

Подробна информация за материалите и методите е предоставена в Допълнителните материали и методи.

Изследвания на мишки

Експериментите бяха проведени върху 8-седмични мишки от див тип 129S1/SvImJ от двата пола (Charles River). DIN се индуцира чрез еднократно инжектиране на доксорубицин (14, 5 mg / g телесно тегло), както е описано по-горе.^18,22За да се контролира миелотоксичният ефект на доксорубицин, несвързан с развитието на нефропатия, резистентните на доксорубицин C57BL/6 мишки също бяха подложени на същия протокол за лечение.²³ В допълнение, подобни експерименти бяха проведени върху 8-седмични мишки с индуцируема делеция на подоцин (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G] 8Jhm*Tg[tetO -cre]1Jaw) или Nphs2Dipod мишки, които са третирани с доксициклин в продължение на 14 дни.¹⁹Всички експерименти с животни са проведени в съответствие с Ръководството на националните здравни институти за грижа и използване на лабораторни животни и германския закон за хуманно отношение към животните, с одобрение от местните власти (Regierungspräsidium Tübingen, номера на одобрение M12/17 и M17/19G ). Експерименталният дизайн на проучванията с мишки е описан в допълнителна фигура S1.

пациенти

Проучването с пациенти е проведено в съответствие с Декларацията от Хелзинки и е одобрено от местната комисия по етика на Университетската болница в Тюбинген (556/2018BO2). Бяха взети проби от кръв и урина с литиев хепарин от пациенти с протеинурия в нефротичен диапазон и запазена скорост на гломерулна филтрация (GFR; етапи 1-2; n=10) и пациенти с намалена GFR (CKD (хронично бъбречно заболяване) етап 3–5; n ¼ 15) в университетската болница в Тюбинген. Като контролна група, кръвта от здрави доброволци с еднаква възраст и пол (n=25) беше предоставена от кръвната банка на университетската болница в Тюбинген. Всички човешки проби са събрани след информирано съгласие. Клиничните характеристики на пациентите са посочени вМаса 1.

Таблица 1|Характеристики на пациентите с ХБН (хронична бъбречна болест) и здрави кръводарители

Анализи с поточна цитометрия

Различни параметри на клетъчната смърт на RBC се определят чрез друга цитометрия.¹⁴ За да се определи продължителността на живота на червените кръвни клетки in vivo, 25 ml от 5,6-карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидилов естер [5(6)-CFDA, SE] багрило се инжектира в концентрация 9,96 mM (разтворен в диметилсулфоксид) в ретроорбиталната плексус на див тип 129S1/SvImJ и мишки, инжектирани с доксорубицин, както е описано по-горе. 24 В посочените времеви точки се взема кръв от ретро-орбиталния плексус на мишките и процентът на 5(6)-CFDA, SEþ клетките бяха открити чрез друг цитометричен анализ. Накрая, данните бяха анализирани с помощта на софтуер FlowJo (FlowJo LLC).

RBC деформируемост и осмотичен градиент ектацитометрия

Деформируемостта на червените кръвни клетки се измерва с помощта на лазерно-подпомогнат оптичен ротационен клетъчен анализатор (LORCA Max Sis; RR Mechatronics), който е описан подробно другаде.²⁵Анализите на ектацитометрията на осмотичния градиент (космическа кутия) също бяха извършени с помощта на LORCA Max Sis и измерваха деформируемостта при различни осмотични условия.²⁶

Хистологично изследване

За оцветяване с хематоксилин и еозин, далаците и бедрените кости се оцветяват с хематоксилин и еозин. Всички предметни стъкла бяха оцветени с първичното антитяло Ter119 (BD Pharmingen; разреждане 1:500). За оцветяване с периодична киселина–Шиф, срезове с дебелина 25-mm отбъбрецибяха оцветени с периодична киселина-Шиф реактив (Carl Roth) и хематоксилин (Abcam). Беше извършено оцветяване по May-Grünwald-Giemsa (метод на Pappenheim), за да се определят промените във формата на RBC, както е описано по-горе.²⁷ Изолирането на гломерули беше извършено чрез използване на подход на биотинилиране и клетъчно сортиране.¹⁹За откриване на протеин на подоцин беше приложено антитяло от Sigma (P0372).¹⁹Roti-Mount Fluor Care 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; Carl Roth) се използва за оцветяване на ядра.

Ултра-високо ефективна течна хроматография-масспектрометрия метаболомика от миши червени кръвни клетки

Анализите са извършени, както е публикувано по-рано.²⁸Накратко, аналитичната платформа използва система за течна хроматография с ултрависока ефективност Vanquish (Thermo Fisher Scientific), свързана онлайн с Q Exactive масспектрометър (Thermo Fisher Scientific).

Cistanche лекува бъбречни заболявания, причинени от анемия

статистически анализи

Данните са предоставени като средни аритметични SEM или като медиана с интерквартилен диапазон (25-ти–75-ти персентил), като n представлява съответно броя на използваните животни или включените пациенти. Данните бяха тествани за нормалност с теста на Колмогоров-Смирнов, теста на Д'Агостино и теста на Шапиро-Уилк. Вариациите бяха анализирани чрез теста на Бартлет за равни дисперсии. Посттест за множество сравнения на Tukey или Dunn, несдвоен t-тест на Student или U тест на Mann-Whitney беше извършен от GraphPad Prism 8 (софтуер GraphPad). P < 0.05="" с="" 2-="" тестване="" с="" опашка="" се="" счита="" за="" статистически="" значимо.="" допълнителни="" графики="" бяха="" начертани="" чрез="" graphpad="" prism="">

РЕЗУЛТАТИ

Експериментално протеинурично бъбречно заболяване предизвикваанемияпри мишки След индукция, 129S1/SvImJ мишки с DIN и Nphs2Dipod мишки развиват протеинурия в нефротичен диапазон (Фигура 1а и допълнителна фигура S2C) и прогресивна бъбречна недостатъчност, характеризираща се с високи плазмени нива на урея от ден 20 нататък (Фигура 1b и допълнителна фигура S2D). През първите 10 дни мишките са имали наддаване на телесно тегло с асцит (Фигура 1c и допълнителна фигура S2E), отразявайки задържането на натрий, причинено от екскрецията на серинови протеази или протеинурия.¹⁸След спонтанно обръщане на задържането на натрий, тези мишки постоянно губят тегло. При мишки с DIN и при мишки Nphs2Dipod, светлинни микроскопски изображения, заснети след 10 дни, разкриват типични хистоморфологични промени, съответстващи на фокална сегментна гломерулна склероза (Фигура 1d и допълнителна фигура S2B). Те отсъстват при мишки C57BL/6, инжектирани с доксорубицин (Фигура 1d). Лечението с доксорубицин предизвиква силен спад в хемоглобина, броя на червените кръвни клетки и хематокрита (Фигура 1e–g) от ден 10 нататък при мишки 129S1/SvImJ и C57BL/6, които при последните се нормализират на дни 20 и 30. За разлика от това, на дни 20 и 30, инжектирани с доксорубицин 129S1/SvImJ и мишки с дефицит на подоцин развиват прогресивноанемия, характеризиращ се с намален среден корпускуларен обем (Фигура 1h) и намален хемоглобин (допълнителна фигура S2F), което предполага, чеанемиясе свързва с прогресираща бъбречна недостатъчност, а не с лечение с доксорубицин.

Фигура 1|Бъбречна функция и явна анемия при инжектирани с доксорубицин 129S1/SvImJ мишки.(a-d) Инжектирани с доксорубицин 129S1/SvImJ мишки развиват (a) висока протеинурия, (b) прогресивно повишаване на плазмената концентрация на урея, (c) преходно повишаване на телесното тегло и (d) типични хистоморфологични промени, показателни за фокална сегментна гломерулна склероза на ден 10 (оцветяване с периодична киселина–Шиф; лента ¼ 10 mm). ( e – h ) В допълнение, тези мишки се развиватанемияотразено от (e) намалено ниво на хемоглобина, (f) по-нисък брой на червените кръвни клетки (RBC), (g) понижени нива на хематокрит и (h) намален среден корпускуларен обем. (a-d) C57BL/6 мишки, инжектирани с доксорубицин, не показват никакви признаци на бъбречно увреждане и (e-g)анемияна ден 10 се нормализира на дни 20 и 30. Показани са аритметични средни SEM. *P <0,05, **p=""><0,01,>< 0.001,and="" ****p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="" <="" 0.01,="" ###p="" <="" 0.001,="" and="" ####p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="" <="" 0.05,="" §§p="" <="" 0.01,="" §§§p="" <="" 0.001,="" and="" §§§§p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">

Анемията при експериментално протеинурично бъбречно заболяване не се причинява от компрометирана еритропоеза

И двата модела на анемични мишки показват значително увеличение на процента на циркулиращи ретикулоцити (Фигура 2а и допълнителна фигура S3C). Плазмените концентрации на ЕРО бяха драматично повишени на ден 10 в 129S1/SvImJ с DIN и здрави C57BL/6 мишки, но бяха нормализирани отново на дни 20 и 30 (Фигура 2b). При мишки с дефицит на подоцин, плазмените концентрации на ЕРО се повишават на ден 10 и остават повишени на дни 20 и 30 (допълнителна фигура S2H). При хистологични анализи от костен мозък и далак броят на еритроидните прекурсорни клетки в сравнение с миелоидните прекурсори се увеличава на 30-ия ден (Фигура 2d–g), което сочи към стимулирана еритропоеза при анемични 129S1/SvImJ мишки с DIN.

Фигура 2|Еритропоезата се стимулира при инжектирани с доксорубицин 129S1/SvImJ мишки с анемия. (a) анемияпри инжектирани с доксорубицин 129S1/SvImJ мишки се наблюдава въпреки увеличения брой ретикулоцити на дни 2{{30}} и 30. (b) Плазмената концентрация на еритропоетин е силно повишена на ден 10 в инжектирани с доксорубицин 129S1/SvImJ и C57BL/6 мишки, но се нормализира отново на дни 20 и 30. ( c – e ) Количествено определяне на абсолютния брой на ( c ) миелоидни и ( d ) еритроидни клетки в костния мозък. (e) Съотношението на миелоидни към еритроидни клетки при здрави и инжектирани с доксорубицин 129S1/SvImJ мишки в костния мозък показва по-голям брой еритроидни прекурсорни клетки в инжектирани с доксорубицин 129S1/SvImJ мишки на ден 3{{5{{52 }}}}. (f,g) Хистологията на (f) далака и (g) костния мозък показва увеличение на еритроидните прекурсорни клетки, наблюдавано дори при по-ниски увеличения, при инжектирани с доксорубицин 129S1/SvImJ мишки (десни панели) в сравнение със здрави мишки (леви панели ) на ден 30. (f,g) Имунохистохимията на Ter119 (долни панели) подкрепя констатациите за хематоксилин и еозин (H&E). Ter119 е положителен в еритроидните прекурсори (ядрени клетки) и в червените кръвни клетки (безядрени клетки). Ширина ¼ 100 mm; вложки ¼ 25 mm. Показани са аритметични средни SEM. *P <0,05, **p=""><0,01 и="" ***p=""><0,001 показват="" значителна="" разлика="" между="" здрави="" 129s1/svimj="" и="" инжектирани="" с="" доксорубицин="" 129s1/svimj="" мишки;="" ##p="">< 0.01="" и="" ####p="">< 0.0001="" показват="" значителна="" разлика="" спрямо="" изходното="" ниво="" на="" инжектирани="" с="" доксорубицин="" 129s1/svimj="" мишки;="" и="" §p=""><0.05, §§p=""><0.01 и="" §§§§p=""><0.0001 показват="" значителна="" разлика="" между="" инжектирани="" с="" доксорубицин="" 129s1/svimj="" и="" инжектирани="" с="" доксорубицин="" c57bl/6="">

Полза отCistanche: лечение на бъбречно заболяване и подобряване на бъбречната функция

Намалената продължителност на живота на червените кръвни клетки е основната причина за анемия при експериментално протеинурично бъбречно заболяване

Екстернализацията на PS върху външната листовка на плазмената мембрана на RBC е индикатор за клетъчна смърт и промотор на еритрофагоцитоза.¹⁴Клетъчната смърт на червените кръвни клетки се определя количествено с помощта на флуоресцентно-активирани клетъчни анализи за сортиране на флуоресцентен анексин V-свързан повърхностен PS.¹⁴ In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >{{0}}кратно по-високо на ден 20 при мишки с DIN (4,16 процента & 0.86 процента ) в сравнение със здрави мишки (1.{{7 }} процента & 0.11 процента ) (Фигура 3а). По подобен начин мишките Nphs2Dipod показват приблизително 2-кратно увеличение на експозицията на PS (1,27 процента и 0.20 процента) в сравнение със здрави мишки (0,58 процента и 0,05 процента) на ден 30 (допълнителна фигура S3A). Известно е, че червените кръвни клетки се елиминират от кръвообращението от макрофаги, намиращи се в далака.17 Това наблюдение може следователно да обясни по-високото съотношение далак/телесно тегло на мишки Nphs2Dipod (допълнителна фигура S2G), при което два пъти повече червени кръвни клетки се разграждат в сравнение със здрави C57BL/6 мишки. Тъй като протеинурията в нефротичен диапазон води до диспротеинемия,29 ние допълнително проучихме дали повишената клетъчна смърт на RBC може да бъде стимулирана от компонент в плазмата на мишки с DIN. Както е показано на Фигура 3b, експозицията на PS на 10 и 20 ден е два пъти по-висока след инкубацията (30 минути на 37^OC) на здрави червени кръвни клетки в плазма на инжектирани с доксорубицин 129S1/SvImJ мишки в сравнение с инкубиране в плазма на здрави мишки. Приток на Ca2þ в червените кръвни клетки, медииран от зависими от напрежението и независими от напрежението неселективни катионни канали,^30,31е един от ключовите регулатори на смъртта на червените кръвни клетки. В червените кръвни клетки, събрани на 20-ия и 30-ия ден от 129S1/SvImJ мишки с DIN, вътреклетъчните концентрации на Ca2þ са повишени (Фигура 3с); това явление беше рекапитулирано в мишки Nphs2Dipod на 20-ия ден (допълнителна фигура S3B). И в двата модела на мишки имаше значителна отрицателна корелация на процента на PS-позитивните червени кръвни клетки, с тежестта наанемияотразени от нивата на хемоглобина (Фигура 3d и допълнителна фигура S3D). Освен това има значителна корелация с увреждане на бъбреците, отразено от плазмената концентрация на урея (Фигура 3e и допълнителна фигура S3E) и в по-малка степен с протеинурия (Фигура 3f и допълнителна фигура S3F). За компенсиране на загубата на RBC ванемия, образуването на нови червени кръвни клетки се стимулира и при двете мишки, както се вижда от увеличения процент на циркулиращите ретикулоцити, и е значително корелирано с величината на PS, излагащи червените кръвни клетки (Фигура 3g и допълнителна фигура S3G).

Фигура 3|Мишки с индуцирана от доксорубицин нефропатия развиват повишена смърт на червени кръвни клетки (RBC), медиирана от повишени вътреклетъчни нива на калций.(a) Екстернализацията на фосфатидилсерин (PS), отразяваща смъртта на червените кръвни клетки, се засилва на дни 20 и 30 след индуциране на индуцирана от доксорубицин нефропатия. (b) Инкубирането на здрави червени кръвни клетки в плазма, взета на дни 10 и 20 от тези мишки, доведе до екстернализация на PS. (c) Екстернализацията на PS беше придружена от повишени вътреклетъчни нива на калций на червените кръвни клетки, взети на дни 20 и 3{{30}} след индукцията. ( d – g ) Процентът ( d ) на червените кръвни клетки, експониращи PS, е свързан с нивата на хемоглобина, увреждане на бъбреците, посочено от ( e ) плазмена концентрация на урея и ( f ) протеинурия, както и с ( g ) образуване на ретикулоцити. (d–g) Данните включват всяка времева точка (0, 10, 20 и 30 дни) на всяка здрава мишка 129S1/SvImJ и 129S1/SvImJ с индуцирана от доксорубицин нефропатия. Показани са аритметични средни SEM. **P <0.01, ***p=""><0.001 и="" ****p=""><0.0001 показват="" значителна="" разлика="" между="" здрави="" 129s1/svimj="" и="" инжектирани="" с="" доксорубицин="" (in.)="" 129s1/svimj="" мишки;="" #p="">< 0.05,="" ##p="">< 0.01="" и="" ####p="">< 0.0001="" показват="" значителна="" разлика="" спрямо="" изходното="" ниво="" на="" инжектирани="" с="" доксорубицин="" 129s1/svimj="" мишки;="" и="" §§§§p="">< 0.0001="" показват="" значителна="" разлика="" между="" инжектирани="" с="" доксорубицин="" 129s1/svimj="" и="" инжектирани="" с="" доксорубицин="" c57bl/6="" мишки.="" crea,="" креатинин;="" mfi,="" среден="" интензитет="" на="">

Полза отCistanche: лечение на бъбречно заболяване и подобряване на бъбречната функция

НАТИСНЕТЕ ТУК ЗА ЧАСТ Ⅱ