ЧАСТ Ⅱ: Роля на човешки първичен бъбречен фибробласт в TGF- 1-медиирани устройства, имитиращи фиброза

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

ЧАСТ Ⅱ: Роля на човешки първичен бъбречен фибробласт в TGF- 1-медиирани устройства, имитиращи фиброза

Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee и др.

Резюме

Бъбречна фиброзае прогресивно хронично бъбречно заболяване, което в крайна сметка води до краен стадий на бъбречна недостатъчност. Въпреки няколко подхода за борбабъбречна фиброза, експериментален модел за оценка на наличните в момента лекарства не е идеален. Ние разработихме b-имитиращи модели, използвайки триизмерни (3D) устройства за съвместна култура, проектирани с три отделни слоя от тубулен интерстициум, а именно епителни, фибробластни и ендотелни слоеве. Ние въведохме човешки бъбречни проксимални тубулни епителни клетки (HK-2), човешки ендотелни клетки от пъпна вена и бъбречни фибробласти, получени от пациента, и оценихме ефектите наtтрансформиращ растежен фактор- (TGF-)иTGF-инхибиторно лечение по този въпросбъбречнафиброзамодел. Изразът нафиброзамаркер алфа-гладкомускулен актин върхуTGF- 1лечението беше увеличено в монослойно култивирани HK-2 клетки в 3D модел на заболяване. В съдовия дял набъбречнафиброзамодели, плътността на съдовете е увеличена и намалена вTGF--третирана група иTGF-- група за лечение с инхибитор, респ. Мултиплекс ELISA с използване на супернатанти вTGF--стимулиращи 3D модели показват, че нивата на провъзпалителни цитокини и растежен фактор, включително интерлевкин-1 бета, фактор на туморна некроза-алфа, основен растежен фактор на фибробласти иTGF- 1, TGF- 2, иTGF- 3бяха увеличени, което имитира фиброзната микросреда на човешките бъбреци. Това изследване може да позволи конструирането на човекбъбречнафиброза-имитиращ модел на устройство извън традиционните културни експерименти.

Ключови думи: бъбречен фибробласт; фиброза; TGF- 1

Cistanche tubolosa ползи за здравето: лечение на хронични бъбречни заболявания

НАТИСНЕТЕ ТУК ЗА ЧАСТ Ⅰ

3. Дискусия

TGF- 1играе важна роля в натрупването на матрицата в бъбречната фиброгенеза и инхибира пролиферацията в повечето клетки, включително гломерулни епителни и ендотелни клетки, както и тубулни епителни клетки 【1】. Въпреки това, TGF-ß1 индуцира пролиферация в човешки бъбречни фибробласти чрез индуциране на основен фибробластен растежен фактор (FGF-2) [8].

В настоящото изследване ние установихме aфиброза-имитиращо устройство, използващо три основни клетъчни компонента, включително човешки първични бъбречни фибробласти, бъбречни тубулни епителни клетки и човешки ендотелни клетки и го оцени катобъбречнафиброзамодел, базиран наTGF- 1стимулиране. За генериранебъбречнафиброза-on-a-chip, създадохме нова система за 3D-култури, проектирана с три отделни части от тъкан, с цел преодоляване на пречките, свързани с моделирането на бъбречно заболяване. Нашето проучване показа товаTGF- 1индуцирани клетъчни отговори, включително тубуларен епителен-мезенхимален преход (EMT) на епителни клетки, микроваскуларна промяна на ендотелни клетки и цитокинови промени в бъбречните фибробласти. Това е първото проучване, което въвежда aфиброза-имитиращо устройство, включващо първични фибробласти, получени от човешки бъбреци и стимулирани фибробласти, изолирани от пациенти сTGF- 1, известен индуктор на фиброзни отговори, обикновено използван като стандарт за имитиранефиброзав клетъчни култури [9]. Тези резултати предполагат, чеTGF- 1-третираните епителни клетки се превръщат в фенотип, подобен на мезенхимни клетки. КогаTGF- 1се прилага към фибробластите, различни цитокини се променят, за да отразят индукцията на фиброзни процеси. Очевидно е, че вбъбречнафиброзамодел, фибробластите са основната сила зад развитието на установената културна система чрез TGF стимулация.

Davis et al съобщават, че 3D културата на ендотелни клетки е достатъчна за клетките да нахлуят и да образуват лумен и тръбна мрежа, следвайки непокътнат организъм in vivo [10,11]. Няколко групи съобщават, че моделите на 3D-култури показват по-високи нива на нефротоксичност от моделите на 2D-клетъчни култури [12]. Освен това, експресията на гени, свързани с нефротоксичност и възпаление, е значително по-висока в модела на бъбречна 3D клетъчна култура, отколкото в типична 2D култура [13].

В това изследване културните среди на човекабъбречнафиброза-on-a-chip имаше значително по-високо ниво на цитокини в сравнение с това в 2Dкултура. Нашата група показа, че получените от пациента фибробласти могат да пресъздадат естествени бъбречни тъкани, включително ендотелни и епителни клетъчни слоеве, чрез нашите предложенияфиброза-модел на чип. Следователно тези констатации показват, чебъбречнафиброзаМоделът на чип точно симулира микрофизичната среда на човешкия бъбрек. В допълнение, тъй като фибробластите, култивирани в чипа, са получени от пациенти, други клинично значими модели на пациенти могат лесно и ясно да бъдат получени по безопасен начин. Следователно, човешкотобъбречнафиброзаСистемата за модел на чип може да позволи разработването на персонализирана медицина с чувствителни измервания на епителните и ендотелните функции. В нашите експерименти,фиброзаи ангиогенезата бяха намалени вTGF-групи, третирани с инхибитори. TGF-инхибиторите са естествени антагонисти на TGF-, които са демонстрирани с помощта на различни модели на бъбречно заболяване. Изглежда, че е възможно да се проведат експерименти, за да се потвърди ефективността на лечението при модели на заболяване, като се използват терапевтични средства като този TGF-инхибитор. Следователно, този чип е предоставил средство за разработване на подобрен модел на бъбречна фиброза за измерване на клетъчната морфология и функция и може да бъде полезен при извършване на оценки на нефротоксичността за фармацевтични продукти.

TGF-е преобладаващият профибротичен фактор при различни бъбречни заболявания [14] и играе роля в ангиогенезата [15]. Ангиогенните ефекти на TGF- са много сложни и могат да имат проангиогенна или антиангиогенна активност в зависимост от обстановката и различни регулаторни фактори [16]. Ангиогенните растежни фактори като VEGF и FGF-2индуцират ангиогенезата in vivo изглежда играят централна роля в модулирането на ангиогенезата in vivo [17-20]. Някои доказателства показват, че тези два фактора могат да действат синергично, за да насърчат морфогенетичните събития на ендотелните клетки [21,22]. Предоставихме доказателства, че експресията на VEGF иРНК и секрецията на FGF-2 протеин са значително повишени от TGF- 1 в 3D чипове в сравнение с 2D култура.

Ограничението на нашатафиброзамодели може да е, че са създадени за относително кратък период от време, 24 часа. TGF-бета има профиброзни и противовъзпалителни свойства в рамките на ранен етапфиброзапроцес, а не в хроничния процес. конвенционално,TGF-се използва основно при индуцирани от цитокинифиброзамодели. Въпреки това, тъй като само един цитокин не може да бъде представен in vivo,фиброзаиндукционни модели, използващи няколко допълнителни кандидат вещества, като напрTGF-и BMP7 са предложени. Въпреки това, два или три цитокина все още не са достатъчни за възпроизвеждане in vivo. ИзползвахмеTGF-като отправна точка; въпреки това, ние се опитахме да приложим in vivo микросреда върху чипа чрез индуциране на по-разнообразна цитокинова буря. Фибробласт, основен клетъчен компонент нафиброза, беше въведено и вторично стимулиране на по-разнообразни цитокини (IL-1, TNF-, b-FGF,TGF- 1, TGF-2, иTGF-3) се индуцира във фибробласти, стимулирани сTGF-. По този начин среда, подобна нафиброзав човешкото тяло се възпроизвежда.

екстракт от Cistanche deserticola: лечение на бъбречни заболявания

4. Материали и методи

4.1. Клетъчни култури

Kidney fibroblasts(KFs)were isolated from biopsies of the normal tissue portion of renal cell carcinoma patients with an estimated glomerular filtration rate (eGFR)>60 mL/минута/1,73 m2, след като пациентите са дали съгласието си за втора биопсия за изследователски цели. KF бяха култивирани в среда за растеж на фибробласти (FGM-2, Lonza, Швейцария) и пасажи 3 до 4 бяха използвани за експериментите. Бъбречните фибробласти се изстъргват от културата в продължение на 1-2 седмици, докато клетките образуват монослой. За да се елиминират епителните клетки, замърсяващи културата, фибробластите бяха избрани с помощта на магнитни антифибробластни перли (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, СА, САЩ) след първия пасаж. Клетките бяха отделени с помощта на 0.05 процента трипсин-етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA) (Welgene, Gyeongsan, Корея), инкубирани с антифибробластни перли и разделени с помощта на магнитна колона, и потокът- чрез беше събрано. Пречистените първични фибробласти се характеризират чрез флуоресцентно активиран клетъчен анализ (FACS), използвайки РЕ-конюгирани анти-фибробластни антитела. Нежният дисоциатор за сортиране на клетки с магнитно активиране (MACS) беше използван за нежно смилане на бъбречна тъкан. Магнитен сепаратор Octo MACSTM с MACS LS колони (с бутала), приложени за пречистване на маркирани с микрозърна клетки, беше закупен от Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, СА, САЩ). Нежни MACS C епруветки (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, Калифорния, САЩ) бяха използвани за смилане на бъбреци за разделяне на клетки. MACS Smart Strainers (70 um) бяха получени от Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, СА, САЩ). Буферът на колоната се използва за промиване на колони и ресуспендиране на клетъчни пелети. Буферът се приготвя като разтвор, съдържащ 0.5 процента говежди серумен албумин (BSA) с 2 mM EDTA във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) (рН 7.4) и закупен от Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, СА, САЩ). Експресиращи зелен флуоресцентен протеин човешки ендотелни клетки от пъпна вена (GFP-HUVECs, Lonza, Швейцария) бяха култивирани в среда за ендотелен растеж (EGM-2, Lonza, Швейцария) и бяха използвани клетки в пасажи 3 до 4. Човешка проксимална тубулна клетъчна линия (клетки от човешки бъбрек-2(HK-2) са получени от Американската колекция от типови култури (ATCC). Клетъчната линия се отглежда в модифицирана среда на Eagle с високо съдържание на глюкоза на Dulbecco (DMEM) допълнен с 10 процента фетален говежди серум (FBS), пеницилин (100 U/mL) и стрептомицин (100 ug/mL).Реагентите са закупени от Gibco (Rockville, MD, USA).Всички клетки се отделят с помощта на 0,05% трипсин- EDTA и се поддържат във влажен инкубатор при 37 градуса и 5 процента CO2. KFs се ресуспендират в FGM-2 при клетъчна концентрация от 4×10 градуса клетки/mL. Тубулни епителни клетки на човешки бъбрек (HK{{49 }}) бяха ресуспендирани при концентрация от 2 × 10 градуса клетки/mL в DMEM с високо съдържание на глюкоза. GFP-HUVEC бяха ресуспендирани при концентрация от 2 × 10 градуса клетки/mL в EGM-2.

4.2.Реактиви

Матрицата е съставена от фибринови гелове, включително наличния в търговската мрежа фибриноген от говежда плазма, апротинин от говежди бял дроб и тромбин от говежда плазма. Гореспоменатите три материала са закупени от Sigma (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Фибриногенът се разтваря в 1 × PBS във водна баня (37 градуса) в продължение на 3 0 минути при концентрация от 10 mg/mL. Тромбинът и апротининът се разтварят в дейонизирана вода при концентрация от 50 единици/mL и 4 TIU/mL. Трите разтвора се стерилизират чрез филтруване през 0.22 μm филтър. Рекомбинантен човекTGF- 1е получен от PeproTech EC Ltd. (Лондон, Обединеното кралство). Специфичен инхибитор на TGF-бета рецепторна киназа, SB431542, беше закупен от Tocris Cookson, Inc. (Ellisville, MO, USA).

4.3. Моделиране на клетки в устройството

Преди клетъчно засяване за улесняване на плътното свързване, устройството беше обработено за 1 минута в плазмена машина (Femto Science Inc., Suwon, Корея) с мощност 7 0 W, 50 Hz. Индуцираната от плазмената обработка хидрофилност на повърхността и спомага за улесняване на моделирането на гела и зареждането на медиите. За да се избегнат промени в хидрофилността, експериментите се провеждат в рамките на 30 минути след плазмената обработка. Различните клетъчни модели в рамките на устройствата могат да бъдат направени по много персонализиран начин. Важно беше да се определи съставът и концентрацията на различните типове клетки, които трябва да бъдат моделирани предварително. За клетъчни хидрогелни суспензии, 37,5 μL клетъчна суспензия и отделена аликвотна част от 12,5 μL от 10 mg/mL разтвор на фибриноген (250 μL от 10 mg/mL разтвор на фибриноген с 40 μL от 4 TIU/mL апротинин) бяха приготвени за незабавно смесване преди зареждане. Непосредствено преди зареждането, 37.5 μL клетъчна суспензия се смесва с 12.5 μL 10 mg/mL фибриноген до хомогенизиране. 50 uL хидрогел се смесват с 1 uL капка тромбин (0.5 единици/mL). Веднага след смесването, тромбин с фибринова суспензия на GFP-HUVECs (клетъчна концентрация от 2 × 10' клетки/mL) се инжектира във външния ръб на външния канал (Фигура 3, Гел А). Изчакахме 3 минути за пълно омрежване на фибриноген. Веднага след смесването, тромбин с фибринова суспензия на KFs (клетъчна концентрация от 4 × 10 градуса клетки/mL) се поставя от всяка страна на дъното на резервоара на ямка (Фигура 3, Гел С). Тази фибринова суспензия на KFs се оставя да се омреже при стайна температура в продължение на 3 минути. Клетъчна суспензия от 10 μL човешки бъбречни проксимални тубулни епителни клетки (HK-2) се инжектира в инжекционния порт на вътрешния канал (Фигура 3, гел B). За да се прикрепи HK-2 към стената на фибринов гел в GFP-HUVECs канала, устройството беше обърнато на 90 градуса и поставено в 5 процента CO, инкубатор за 30 минути при 37 градуса. HK-2 се утаява и образува клетъчен лист от страната на фибриновия гел.

След прикрепване на HK-2, устройството беше напълнено с EGM-2. Устройството се инкубира в продължение на 3 дни при 37 градуса в 5 процента CO, инкубатор. Средата се променя с или без 5 ng/mLTGF- 1и с 5 ng/mLTGF- 1и 10 umTGF- 1инхибитор след три дни инкубация (Фигура 3).

какво е цистанче

4.4. Имуноцитофлуоресценция

Ко-култивираните тъкани в устройството бяха фиксирани с 4 процента (w/v) разтвор на параформалдехид (Biosesang, Seongnam, Корея) в PBS (Welgene, Gyeongsan, Корея) за 2 0 минути, последвано от пермеабилизация с 20 мин. потапяне в 0,15 процента Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO, USA). След това пробите се третират с 3% BSA (Sigma, САЩ) в продължение на 1 час. Клетките се инкубират с антитела, закупени от Abcam. Първичните антитела бяха анти-цитокератин 8 и анти-о-SMA, оставени за 2 дни при стайна температура (RT). Alexa Fluor 647 конюгиран магарешки анти-заешки IgG (H плюс L) беше използван като вторично антитяло. ДНК маркирането се извършва с 1: 250 разреждане на Hoechst33342 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) в продължение на 3 часа при RT. Изображенията бяха събрани с помощта на конфокален лазерен микроскоп Zeiss LSM 710. Средният интензитет на флуоресценция (MFI) беше измерен с помощта на ImageJ и анализатор на интензитет на флуоресценция.

4.5. Мултиплексен анализ на цитокини

Комплектът MSD V-Plex Cytokine and Angiogenesis Panel 1 Human (Rockville, MD, USA) беше използван за измерване на концентрациите на интерлевкин-1 бета （IL-1ß） и основен фибробластен растежен фактор （b-FGF） в единични проби, съгласно инструкциите на производителя. Всички проби бяха оценени за общи протеинови нива на IL-1 и b-FGF. Количеството (в pg/mL) се определя количествено от стандартната крива на всяко измерване.

4.6. Имуноанализ с мултиплексни зърна

Концентрациите на цитокини бяха анализирани с помощта на мултиплексна система за имуноанализ на топчета (Procarta Cytokine Assay Kit; Affymetrix, Inc., Санта Клара, Калифорния, САЩ), базирана на мултиплексираща технология (xMAP; Luminex, Austin, TX, USA), съгласно инструкциите на производителя. Данните бяха получени с помощта на работна станция, съвместима с Luminex, и нейния мениджърски софтуер (работна станция Bio-Plex и версия 6.0 софтуер; Bio-Rad, Токио, Япония), съгласно инструкциите на производителя. Човешки TGF- 1, TGF- 2 и TGF- 3, свързани сфиброзапроцеса бяха анализирани едновременно в разредените проби. Изоформите наTGF-бяха открити с помощта на Bio-Plex 200 Systems и наличния в търговската мрежа Bio-Plex ProTM HumanTGF-анализи (Bio-Rad Laboratories, Inc); въз основа на информацията, предоставена от производителя. Комплектът за мултиплексен анализ може да измерва количествено множество цитокини от супернатанта с долна граница на откриване от 1 pg/mL на цитокин. Всяка проба се провежда като единично измерване за ограничено количество от събрания супернатант.

4.7.PCR в реално време

Екстракцията на РНК се извършва с помощта на реагент TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, САЩ). Master Mix и Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit бяха използвани за обратната транскрипция на общата РНК. qPCR бяха извършени с помощта на Applied BiosystemsTM PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Специфичните праймери бяха приготвени от Bioneer (Daejeon, Корея) и използвани в този експеримент, както следва. Последователностите на праймера са обобщени в таблица 1.

Десет микролитра PowerUp SYBR Green Master Mix, 4 μL cDNA и 2 pmol от всеки праймер бяха използвани за PCR в реално време в краен обем от 20 μL. Реакцията се провежда при 95 градуса за 1 s и 60 градуса за 20 s за 45 цикъла след денатурация при 95 градуса за 20 s. PCR се извършва в два екземпляра или три екземпляра за всяка проба. Нивата на cDNA се определят с помощта на стандартна крива на праговете на цикъла. Всички данни за всяка сДНК бяха в рамките на съответната стандартна крива. Получените данни бяха нормализирани към -актинова сДНК.

4.8. Статистически анализ

Количествените данни са представени като средно ±SD или SE от поне три независими експеримента. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на двустранен t-тест на Student. Считахме за значителна разлика само при 95 процента ниво на сигурност или по-високо (стр<>

5. Изводи

В обобщение, протоколите в това проучване позволиха изграждането на човешкибъбречнафиброза-имитира устройства като модел и показа различни ефекти, които не са възможни в експерименти с 2D-култура. Вярваме, че стратегията за оценка, предложена в това проучване, ще доведе до по-добро разбиране на детайлитефиброзамеханизми, участващи в патологичните промени по време набъбречно заболяване. Разработената 3D бъбречна фиброза върху чип може да се използва като потенциален in vitro модел, който ще ни доближи до създаването на подобрен модел бъбрек върху чип.

cistanche phelypaes: лечение на бъбречни заболявания

Препратки

1. Граница, В.; Noble, N. Трансформиращ растежен фактор в тъканфиброза.Н. англ. J. Med. 1994, 331, 1286-1292.

2. Wang, W.; Huang, XR; Li, AG; Liu, F; Li, J.; Truong, LD; Уанг, XJ; Lan, HY Сигнален механизъм на TGF-betal в превенцията на бъбречно възпаление: Роля на Smad. Аз съм. Soc. Nephrol. 2005, 16, 1371-1383. [CrossRef]

3. Лиу, Й.Бъбречнафиброза: Нови прозрения за патогенезата и терапията. Kidney Int.2006,69, 213-217. [CrossRef][PubMed]

4. Андес, Д.; Craig, WA Фармакокинетика и фармакодинамика на животински модел: Критичен преглед. Вътр. J.Antimicrob.Agents 2002, 19, 261-268. [CrossRef]

5. Ким, С.; Takayama, S. Орган на чип и бъбреците. Kidney Res. Clin. Pract.2015, 34, 165-169.[CrossRef][PubMed]

6. Jang, KJ; Mehr, AP; Хамилтън, Джорджия; Макпартлин, Луизиана; Chung, S.; Сух, Кентъки; Ingber, DE Човешки бъбречни проксимални тубули върху чип за транспортиране на лекарства и оценка на нефротоксичността. Цяло число. Biol. 2013,5,1119-1129. [CrossRef[PubMedl

7. Риърдън, С. „Органи върху чипове“ стават мейнстрийм. Nature 2015, 523, 266. [CrossRef]

8. Щруц, Ф; Zeisberg, M; Renziehausen, A.; Raschke, B.; Бекер, V; Kooten, CV; Мюлер, ДжорджияTGF- 1индуцира пролиферация в човешки бъбречни фибробласти чрез индуциране на основен фибробластен растежен фактор (FGF-2).Kidney Int. 2001, 59, 579-592.[CrossRef][PubMed]

9. Заноти, С.; Брагато, С.; Зучела, А.; Маги, Л.; Мантегаца, Р.; Моранди, Л.; Mora, M. Антифибротичен ефект на пирфенидон в мускулни фибробласти от пациенти с мускулна дистрофия на Дюшен. Life Sci. 2016, 145, 127-136. [CrossRef]

10. Дейвис, GE.: Камарило. C, W. Алфа 2 бета 1 интегрин-зависим пиноцитен механизъм, включващ вътреклетъчно образуване на вакуоли и коалесценция, регулира образуването на капилярен лумен и тръба в триизмерна колагенова матрица. Exp. Cell Res. 1996, 224, 39-51.[CrossRef]

11. Bayless, KJ; Davis, G. Cdc42 и Race GTPases са необходими за образуване на капилярен лумен в триизмерни извънклетъчни матрици. J. Cell Sci. 2002,115, 1123-1136. [CrossRef [PubMed]

12. DesRochers, ТМ; Suter, L.; Рот, А.; Kaplan, DL Биоинженерна 3D човешка бъбречна тъкан, платформа за определяне на нефротоксичност. PLoS ONE 2013, 8, e59219. [CrossRef]

13. Асташкина, А.И.; Mann, BK; Prestwich, GD; Grainger, DW Сравняване на предсказуеми биомаркери за нефротоксичност на лекарства в бъбречна 3-D първична органоидна култура и обезсмъртени клетъчни линии. Биоматериали 2012, 33, 4712-4721. [CrossRef] [PubMed]

14. Менг, XM; Николич-Патерсън, DJ; Lan, HY TGF-бета: Главният регулатор нафиброза. Nat.Rev.Nephrol.2016,12, 325-338. [CrossRef]

15. Pardali, E.; Goumans, MJ; ten Dijke, P. Сигнализиране от членове на семейството на TGF-бета при съдова морфогенеза и заболяване. Trends Cell Biol.2010, 20, 556-567. [CrossRef] [PubMed]

16. Cunha, SL; Pietras, K. ALK1 като нововъзникваща цел за антиангиогенна терапия на рак. Кръв 2011,117, 6999-7006.[CrossRef]

17.Klagsbrun, M.; D'Amore, PA Регулатори на ангиогенезата. Annu. Rev. Physiol.1991, 53, 217-239. [CrossRef]

18. Folkman, J.; Shing, Y. Ангиогенеза. J.Biol. Chem.1992, 267, 10931-10934. [CrossRef]

19. Shweiki, D. Itin, A. Soffer, D. Keshet, E. Васкуларният ендотелен растежен фактор, индуциран от хипоксия, може да медиира ангиогенезата, инициирана от хипоксия. Nature 1992, 359, 843-848. [CrossRef]

20. Ким, KJ; Li, B.; Winer, J.; Арманини, М; Gillett, N.; Филипс, HS; Ferrera, N. Инхибирането на ангиогенезата, индуцирана от васкуларен ендотелен растежен фактор, потиска туморния растеж in vivo. Nature 1993, 362, 841-844. [CrossRefl]

21. Pepper, MS; Ферара, Н.; Orci, L.; Montesano, R. Мощен синергизъм между васкуларен ендотелен растежен фактор и основен фибробластен растежен фактор при индуцирането на ангиогенеза in vitro. Biochem. Biophys. Рез. Commun.1992,189,824-831.[CrossRefl

22. Гото, Ф.; Гото, К.; Weindel, K.; Folkman, J. Синергични ефекти на васкуларен ендотелен растежен фактор и основен фибробластен растежен фактор върху пролиферацията и образуването на корда на говежди капилярни ендотелни клетки в колагенови гелове. лаборатория. Investig.1993,69, 508-551.[PubMed]

НАТИСНЕТЕ ТУК ЗА ЧАСТ Ⅰ