Част Ⅰ Желязният хелатор, PBT434, модулира трансцелуларния трафик на желязо в мозъчните микроваскуларни ендотелни клетки
Apr 28, 2023
Резюме
Желязото и други преходни метали, като мед и манган, са от съществено значение за поддържане на мозъчната функция, но свръхнатрупването е цитотоксично. Това свръхнатрупване на метали, особено желязо, е общо за няколко неврологични разстройства; те включват болестта на Алцхаймер, болестта на Паркинсон, атаксия на Фридрих и други разстройства, проявяващи се с невродегенерация и свързаното с това натрупване на желязо в мозъка. Управлението на притока на желязо от кръвно-мозъчната бариера осигурява първата линия на защита срещу свръхнатрупването на желязо при нормална физиология и тези патологични състояния. В това проучване установихме, че хелаторът на желязо PBT434, който в момента се разработва за лечение на болестта на Паркинсон и множествена системна атрофия, модулира усвояването на желязо от микроваскуларните ендотелни клетки на човешкия мозък (hBMVEC) чрез хелиране на извънклетъчно Fe2 плюс. Третирането на hBMVEC с PBT434 води до увеличаване на изобилието на транскриптите за трансферинов рецептор (TfR) и церулоплазмин (Cp). Анализите Western blot и ELISA разкриват съответно увеличение и на протеините. В клетката PBT434 повишава откриваемото ниво на благотворно, лабилно Fe2 плюс; данните показват, че това Fe2 плюссе освобождава от феритин. В допълнение, PBT434 потенцира изтичането на желязо, вероятно поради увеличаването на цитозолното двувалентно желязо, субстратът за износителя на желязо, феропортин. PBT434 се уравновесява бързо и двупосочно през hBMVEC кръвно-мозъчна бариера. Тези резултати показват, че комплексът PBT434-желязо не е субстрат за усвояването на hBMVEC и по този начин подкрепят модел, при който PBT434 ще хелатира интерстициалното желязо и ще инхибира повторното усвояване на желязото от ендотелните клетки на кръвно-мозъчната бариера, като както и да инхибират усвояването му от другите клетки на невроваскуларната единица. Като цяло, това представлява нов и обещаващ механизъм за терапевтично хелиране на желязо.
Щракнете тук, за да получитекакви са ползите от Cistanche
Въведение
Металната хелатотерапия (MCT) отдавна се използва като лечение на отравяне с преходен метал и за генетични нарушения в метаболизма на основен метален йон, което води до свръхнатрупване на метала [1–3]. Два примера за последното са хипер-натрупването на мед при болестта на Wilson [4] и на желязо при наследствена хемохроматоза [5]. Както медта, така и желязото са катализатори на оксидативния стрес и следователно са цитотоксични при концентрации, които надвишават способността на клетката и организма да „шаперонират“ тези редокс-активни преходни метали [6, 7]. Натрупването на желязо, по-специално, е широко идиопатично; наистина, увеличаването на желязото е отличителен белег на стареене на мозъка [8–10]. Патологично това натрупване на желязо в мозъка е характеристика на мутации в гени, които не са свързани с метаболизма на желязото [11–15], както и различни други невродегенеративни заболявания, някои от които нямат специфична генетична връзка като стареене [16], болестта на Алцхаймер [ 17], атаксия на Фридрих [18] и болест на Паркинсон [19]. Като група такива заболявания могат да се разглеждат като невродегенерация с натрупване на желязо в мозъка (NBIA), въпреки че това съкращение обикновено е ограничено до тези, за които е идентифицирана генетична връзка [11, 13, 14].
В случай на претоварване с желязо, целта е да се „прочисти“ тялото от излишното желязо поради дефект в клетъчното усвояване или изтичане на желязо. Тук целта е да се конкурират физиологичните хелатори на желязото с лекарството; съединение, което има добра фармакокинетика и висок афинитет към двувалентното желязо е целевото лекарство. Тъй като тялото е пренаситено с основния метал, има малко опасения за предизвикване на дефицит в хода на лечението. Лечението на мозъчно заболяване с хелатотерапия с желязо изисква различна стратегия. Това не е проблем на системно претоварване с желязо, а на натрупване на желязо в области на патология с увреждащи последствия надолу по веригата. Свързаното с възрастта натрупване на желязо при болестта на Паркинсон (PD), например, потенциално допринася за свързаното с оксидативния стрес клетъчно увреждане [20]. Прекомерното лабилно желязо насърчава неправилното нагъване на -синуклеин в невроните на substantia nigral. Използването на хелатор с висок афинитет може да доведе до известно намаляване на натоварването на мозъка с желязо, но със сигурност ще предизвика железен дефицит, който най-малкото при възрастното население е противопоказан предвид системния железен дефицит, който е общ за тази възрастова група [21] . Хелатор с оптимален афинитет има потенциала да намали натрупването на желязо, както и съпътстващия оксидативен стрес, дължащ се на излишък на лабилно желязо и основни болестни процеси.
Cistanche tubulosaиЕфектите на Cistanche
Един хелатор, одобрен за употреба при лечение на индуцирано от трансфузия претоварване с желязо при пациенти с таласемия, е деферипрон (DFP, марка Ferriprox) [5, 22]. DFP също се използва за лечение на атаксия на Friedreich [23] и болест на Parkinson [24, 25]. В мета-анализ е доказано, че DFP осигурява значително намаляване на съдържанието на желязо в миокарда, както и по-голяма сърдечна защита при пациенти с таласемия, отколкото дефероксамин, класическият желязохелатен агент [5]. От друга страна, DFP се метаболизира бързо от черния дроб [26] и по-скорошна работа показа, че той хелатира Fe2 плюс в активното място на зависими от желязо хистон лизин деметилази, активност, която корелира с неразпозната преди това цитотоксичност [27]. Това откритие подчертава ключово ограничение при използването на хелатотерапия с желязо, а именно конкуренция от страна на лекарството за физиологично есенциално желязо, независимо дали в запас от желязо или протеин, който съдържа протезен вид желязо. Независимо от това, DFP, например, показа ефикасност във фаза 2 на изпитване за лечение на болестта на Паркинсон, както е посочено както от аналитични (намалено натоварване на мозъка с желязо чрез T2- претеглен MRI), така и от поведенчески индекси (когнитивна и моторна невронна функция) [ 24, 25].
Афинитетът на DFP към Fe3 плюс обаче остава проблем. Стабилният вид DFP-желязо е трис-комплексът [Fe(DFP)3] 0 [28]. Докато неутралността на този комплекс е идеална за мобилизиране на желязото от клетката, константата на стабилност за него, ~1037, прави DFP истински чистач на желязо; в този контекст неговото инхибиране на железен ензим като лизин деметилаза е предвидимо [27]. Тази загриженост отразява необходимостта от разработване на хелатори на желязо, които имат мембранната пропускливост на DFP, но значително по-слаб афинитет към Fe2 плюс и Fe3 плюс. Тази последна характеристика ограничава отделянето на лекарства от протезния метал и термодинамичния потенциал на хелатиращия агент за катализиране на автоокисляването на двувалентно желязо, което води до производството на реактивни кислородни видове. По същество силните хелатори на фери-желязото катализират прооксидантното свойство на Fe2 plus [29]. В това проучване ние докладваме как такъв хелатор на желязо с умерен афинитет към феро и феро желязо модулира потока на желязо в мозъчните микроваскуларни ендотелни клетки, които образуват кръвно-мозъчната бариера (BBB).
Cistanche хапчета
Това лекарство, PBT434 [5,7-дихлоро-2-((метиламино)метил)-8-хидрокси-3-метилхиназолин-4 (3H)-он, Фигура 1A] , образува бис-железен комплекс с логаритмични константи на стабилност от ~11 и ~15 за Fe2 плюси Fe3 плюс, съответно [30]. PBT434 предотвратява загубата на substantia nigra pars compacta (SNpc) неврони, понижава натрупването на ниграл-синуклеин, намалява съдържанието на желязо в средния мозък, свързано с модела на болестта на PD, и запазва двигателната ефективност при два миши модела на болестта на Паркинсон без видимо изчерпване на системните запаси от желязо [30]. PBT434 също е ефикасен при миши модели на множествена системна атрофия (MSA) [30, 31], двигателно разстройство, подобно на представянето на болестта на Паркинсон, но което се характеризира с неправилно нагъване на -синуклеин и последващо натрупване, причиняващо образуването на глиални цитоплазмени включвания, които са отличителният белег патология на заболяването [32]. Значително, PBT434 намалява маркерите на оксидативен стрес в миши PD модели [30], което показва, че 1) PBT434 е насочен към запасите от желязо, които иначе са били подготвени да функционират като прооксиданти и 2) PBT434 не потенцира тази зараждаща се цитотоксичност, базирана на окисление. PBT434 е завършил фаза 1 проучване задоволително [33].
Работата, представена тук, е предназначена да разпита въздействието на PBT434 върху трафика на желязо в клетките на мозъчната бариера, микроваскуларните ендотелни клетки, които заедно с подлежащата глия образуват кръвно-мозъчната бариера. Тези проучвания са използвали добре валидирана обезсмъртена ендотелна клетъчна линия както в монослойни, така и в трансуелни култури [34–37]. Основната цел на тези изследвания беше да се определи кинетиката на поглъщане и изтичане на желязо от тези клетки и тяхната модулация от PBT434. Моделът transwell BBB беше използван също за демонстриране на двупосочния PBT434 трансцелуларен поток през бариерата на ендотелните клетки. Моделът демонстрира в молекулярно отношение, че PBT434 инхибира усвояването на желязо чрез хелатиране, като същевременно стимулира изтичането на желязо. Проучванията за клетъчни изображения показват, че PBT434 има достъп до същия лабилен резерв от желязо, изследван от класически Fe2 плюсхелатиращ агент, 2,2'-бипиридин или бипиридил, и флуоресцентна сонда за двувалентно желязо. Резултатите предполагат възможен механизъм на действие за PBT434, който включва инхибиране на усвояването на системно желязо в BBB и последващо секвестриране на мозъчно желязо в интерстициалното пространство.
Резултати
1. PBT434 няма цитотоксични ефекти върху мозъчните микроваскуларни ендотелни клетки
За да определим подходящ диапазон от работни концентрации за PBT434 в нашата in vitro клетъчна култура, ние използвахме MTT анализ за наблюдение на митохондриалната функция на hBMVEC в отговор на PBT434. Въз основа на предишни доклади [30], са били третирани с диапазон от концентрации на PBT434 до 100 μM за 24 часа. Не наблюдавахме значителни промени в жизнеспособността на hBMVEC при която и да е тествана концентрация (Фигура 2).
2. PBT434 бързо се поема и пренася през hBMVEC бариерата
PBT434 е орално бионалично лекарство, което може лесно да проникне през BBB, както се вижда от проучвания, проведени при мишки и хора [30, 38, 39]. Ние наблюдавахме натрупването на PBT434 в hBMVEC, отгледан в монослоеве, използвайки 14C-белязан PBT434 като радиоиндикатор. Данните показват, че в първата фаза 14C-PBT434 бързо се уравновесява между средата за поемане и клетката. Това първоначално поглъщане беше последвано от допълнително бавно натрупване в продължение на 3 часа, което показва скорост от 30,1 ± 9,8 pmol/mg/h (Фигура 3A). В протокола за поглъщане поглъщането се спира и клетките се промиват при 4˚C преди обработка за натрупване на 14C-PBT434 (Методи). В отделен експеримент изследвахме изтичането на 14C-PBT434 от hBMVEC след 30 минути период на зареждане. В протокола за ефлукс клетките се промиват при 25˚C. Данните на Фигура 3B показват, че при промиване при 25˚C приблизително 92 процента от натрупания в клетките 14C-PBT434 е загубен (ср. 550 pmol 14C-PBT434/mg протеин в 3A при 30 min до 43 pmol 14C-PBT434/mg протеин при t=0 в 3B). Имаше допълнителна бавна загуба на останалия 14C-PBT434 (Фигура 3B). Данните предполагат два аспекта на натрупването и ефлукса на PBT434 от hBMVEC. Потокът през плазмената мембрана бързо достига това, което изглежда е равновесие, независимо дали по време на поемане или изтичане. И в двата процеса обаче се появява друг по-бавен процес. Това предполага, че в клетката част от клетката PBT434 е в локал/състояние, което е в кинетична стабилна връзка с фракцията в равновесие с извънклетъчната среда. Кинетичният анализ, отбелязан на Фигура 3B, оценява, че този пул от PBT434 е представен от 27±4 pmol/mg протеин в клетъчния лизат, когато клетките са третирани с 20 μM реагент.
За да изследваме трансцелуларния поток на PBT434, ние използвахме добре валидиран in vitro BBB модел, използвайки растеж на апикалната страна на трансуелна мембрана [35, 36, 40, 41]. Бариерните свойства на тези трансуелни култури бяха потвърдени чрез количествено определяне на тяхното трансендотелно електрическо съпротивление (TEER) и непропускливост към FITC-белязан декстран (S1 Фигура). Сравнихме поглъщането на 14C-PBT434 от луминалната (или апикалната страна на кръвта) (Фигура 4A) с поемането от аблуминалната (или базолатералната страна на мозъка) (Фигура 4C) мембрана. В същия експеримент съответният ефлукс (трансцелуларен поток) беше количествено определен чрез появата на 14C-PBT434 в ефлуксната камера (фиг. 4 панели B и D). Скоростите на тези процеси са дадени в Таблица 1. Масовите данни, илюстрирани на Фигура 4 (панели B и D), показват, че нетният поток на PBT434 през този модел кръвно-мозъчна бариера е еднакъв в двете посоки. Имаше 976±185 pmol 14C-PBT434, натрупан в базалната камера (Фигура 4B) и 1033±210 pmol количествено определени в базалната камера (Фигура 4D). Тази почти еквивалентност беше отразена и в много сходните скорости на изтичане на PBT434 при двете бариерни мембрани (Таблица 1). Въпреки това, имаше значително по-голямо поглъщане на PBT434 в базолатералната мембрана в този бариерен модел, както е илюстрирано от ~50 процента по-голяма загуба на съединение от базалната камера (Фигура 4C), което съответства на ~40 процента по-висока скорост на очевидно клетъчно поглъщане (Маса 1). Предвижда се, че по-силното усвояване ще доведе до по-голямо натрупване. Анализът на клетките на 3h показа, че те задържат ~6 μM PBT434, независимо от посоката на потока. Стойностите бяха 8,1±1,3 μM (апикално към базално) и 4,7±1,2 μM (базално към апикално). Както е отбелязано по-горе, този анализ следва промиването на клетките преди лизис и количествено определяне на общия клетъчен протеин и 14C-PBT434. В допълнение, средата в апикалната камера съдържа RPMI плюс 10 процента FBS и 10 процента NuSerum, докато базалната, „мозъчна” камера съдържа само RPMI (методи). Разумно заключение е, че по-голямото „поглъщане“ от базалната мембрана отразява клетъчната повърхностна адсорбция на PBT434, която е ограничена в апикалната камера от присъствието на протеинови компоненти в серума. При промиване на клетките за натрупване на PBT434, този адсорбиран материал (който е регистриран като „поемане“) се отстранява. Повтарянето на този експеримент с поток, но със серум в базалната камера, показа, че наистина серумът потиска тази вероятна адсорбция на PBT434 на клетъчната повърхност (S2 фиг.).
3. PBT434, за разлика от бипиридила, не ограничава вътреклетъчната наличност на лабилно желязо
Тъй като PBT434 има по-умерен афинитет към желязото в сравнение с класическите хелатори на желязо като деферипрон или бипиридил, ние изследвахме как тази разлика се отразява в ефекта на PBT434 върху клетъчния лабилен железен пул (LIP) на hBMVEC. За да направим това, ние се възползвахме от пропускливостта, Fe2 плюс-специфично флуоресцентно багрило FerroOrange, което реагира с благотворно цитоплазмено желязо. Видяхме значително премахване на флуоресценцията в клетките, когато се третираха с бипиридил, в съответствие с хелатирането на LIP от този хелатор на двувалентно желязо с висок афинитет и по този начин блокира действието на флуоресцентния индикатор за желязо (Фигура 5А). За разлика от това, PBT434 не се конкурира с FerroOrange за Fe2 плюс, поведение, съответстващо на неговия по-умерен афинитет [30]. Резултатите показват, че PBT434, но не и неактивното производно на PBT434-met, предизвиква 34 ± 9% увеличение на достъпното за FerroOrange Fe2 плюскоето предполага, че този хелатиращ агент мобилизира желязото в клетката без съпътстваща токсичност. Представените по-долу данни предполагат, че желязото идва от феритин.
По-рано беше показано, че PBT434 възстановява изчерпаната експресия на феропортинов протеин в мишки, третирани с MPTP, до ниво, подобно на това при мишки без лезии [30]. Този резултат, заедно с увеличаването на вътреклетъчното оцветяване с двувалентно желязо в отговор на PBT434, предполага потенциален ефект върху системата за реакция на клетъчното желязо и функцията на свързаните с желязото протеини надолу по веригата. За да оценим това, първо проведохме количествен PCR (qPCR) анализ на ефекта на PBT434 върху изобилието на транскриптите за няколко протеини, работещи с желязо (Фигура 6). Докато транскриптите за желязния ефлукс протеин, феропортин (Fpn) и двата цитоплазмени железни шаперона, PCBP1 и 2, бяха незасегнати, изобилието на иРНК за трансфериновия рецептор (TfR) и фероксидазата, церулоплазмин (Cp), направи промяна. TfR и Cp транскриптите се увеличават съответно с 2,8 и 36-пъти. Експресията на рецептора за трансферин (TfR) е свързана със системата на желязо-отговарящия елемент (IRE)/желязния регулаторен протеин (IRP) [42–44]. Увеличаването на TfR mRNA предполага, че PBT434 се конкурира с PCBP1-зависимото доставяне на желязо за сглобяването на Fe, S клъстера, който превръща регулаторния IREBP от РНК-свързващ протеин в цитозолна аконитаза [45]. По този начин PBT434 измества тази регулаторна модулация към РНК-свързване и съответното инхибиране на разграждането на TfR mRNA. При клетъчен дефицит на желязо експресията на Cp отчасти се регулира от HIF-1 [46]. Увеличаването на функцията на HIF-1 следва от нокдауна на неговото хидроксилиране от пролил хидроксилазна активност в желязозависима реакция [47]. Както в случая с IREBP, PBT434 изглежда намалява количеството желязо, което служи като кофактор в хидроксилирането и разграждането на HIF-1. В този модел повишаването на нивото на стационарно състояние на този транскрипционен активатор увеличава Cp транскрипцията.
Използвайки комбинация от ELISA анализ и Western blotting, ние изследвахме експресията на протеини, работещи с желязо в PBT434 или PBT434-met третиран hBMVEC; примери за WB анализи са дадени на Фигура 7A. Данните показват, че изобилието на TfR мономер и димер е значително увеличено с 24 часа, както и Cp (Фигура 7B и 7C). И двете увеличения са успоредни на PBT434-зависимото увеличение в съответните транскрипти (Фигура 6). За разлика от това, експресията на желязния ефлукс протеин, Fpn, е нечувствителна към лечението с PBT434 (Фигура 7D).
Използвахме ELISA като допълнителен метод за количествено определяне на промените на гънките, посочени от данните от Western blot. По този начин, hBMVEC бяха третирани с PBT434 за 24 часа и клетъчните лизати бяха анализирани чрез ELISA за TfR (Фигура 8А). Кратното увеличение на TfR в отговор на третиране с PBT434, количествено определено чрез ELISA, е еквивалентно на това, осигурено чрез анализ на Western blots (Фигура 7B). ELISA се използва също за оценка на изобилието на секретиран и GPI-свързан Cp протеин, като се използват HepG2 клетки като положителна контрола. Относно Cp, секретиран в растежна среда, този подход беше ограничен, тъй като изобилието на sCp както в HepG2, така и в hBMVEC кондиционирана среда беше на или под долната граница на чувствителност на този анализ (S3 Фигура). Въпреки това, той даде възможност за оценка на изобилието на GPI-Cp. При този метод клетките бяха третирани с фосфатидилинозитол-специфична фосфолипаза С (PI-PLC), която разцепва GPI котвата; така кондиционираната среда се концентрира и анализира чрез Cp-ELISA. Докато този подход демонстрира, че PBT434 увеличава количеството GPI-Cp в HepG2 клетки, той отново не успява да открие Cp, освободен от PI-PLC (Фигура 8B). ELISA също предоставя директен метод за количествено определяне на феритин. За да се направи това, hBMVEC се зареждат с 1 uM Fe-цитрат за 24 часа, последвано от третиране в отсъствие или присъствие на PBT434 за допълнителен 1 час. Получените клетъчни лизати бяха подложени на ELISA анализ за феритин (Фигура 8С). За разлика от повишаването на TfR, лечението с PBT434 поваля протеина феритин (Ft) с ~18 процента. Наистина, тази загуба на Ft протеин беше очевидна само след 1 час третиране с реагента. Времевият характер на този резултат може да бъде свързан с увеличението на благотворителния Fe2 плюс, отбелязано по-горе, след 30 минути лечение с PBT434. Както беше обсъдено по-късно, нокдаунът на феритина е демонстриран след лечение с други клетъчно пропускливи Fe2 плюс хелатиращи агенти [48].
4. 55Fe2 плюспоемането се инхибира от комплексообразуване с PBT434
Като се има предвид бързото уравновесяване на PBT434 в hBMVEC в рамките на 30 минути, в сравнение с бавното, двуфазно поглъщане и уравновесяване на Fe2 плюс за 24 часа [49], ние предположихме, че PBT434 и Fe2 плюс не споделят същия механизъм на поглъщане. За да се тества това, монослоевете се инкубират с радиомаркиран 55Fe2 плюс в отсъствието или присъствието на PBT434 или PBT434-met и се наблюдава поглъщането на 55Fe2 плюс за 3 часа (Фигура 9А). PBT434 значително намалява скоростта на усвояване на 55Fe2 плюс, както и намалява общото натрупване на 55Fe2 плюс в клетъчните лизати (Фигура 9C). Този ефект не се наблюдава при PBT434-met. Сравнението на скоростите на усвояване на PBT434 и 55Fe показва, че PBT434 и Fe2 плюс се поемат от отделни транспортни пътища. Освен това, инхибирането на поглъщането на 55Fe в присъствието на PBT434, но не и на PBT434-met предполага, че извънклетъчен PBT{31}}железен комплекс не е лиганд за транспортерите на двувалентно желязо в hBMVEC, а именно ZIP8, и ZIP14.
Cistanche добавки
За по-нататъшно изследване на ролята на PBT434 в натрупването на желязо, тествахме ефекта, който има неговото предварително излагане върху поглъщането на 55Fe2 плюс. Клетките, предварително третирани с PBT434, които след промиване бяха изложени на 55Fe2 плюс, показаха увеличение на скоростта на поемане и натрупване на 55Fe2 плюс след 3 часа (Фигура 9, панели B и D). Това повишено натрупване се поддържа поне 24 часа. Тези данни предполагат, че предварителното излагане на клетки на PBT434 временно потенцира усвояването на желязо. Неочаквано предварителната обработка с PBT434-met също показа увеличение както на поглъщането, така и на натрупването (Фигура 9B), но този ефект не беше толкова значителен или устойчив, както този, показан от PBT434.
Ние показахме, че поглъщането на желязо от 59Fe-трансферин се поддържа от фери-редукция и феро-проникване в плазмената мембрана на have [50, 51]. Един експериментален резултат в подкрепа на този TBI модел на усвояване на желязо беше нокдаунът на това усвояване чрез инхибиране на извънцитоплазмената фериредуктазна активност; друг резултат е 60% инхибиране на усвояването на желязо от TBI от ферозин, силен хелатиращ агент на двувалентно желязо [50]. Тази последна стратегия беше използвана, за да се демонстрира, че PBT434, но не и PBT434-met, също инхибира усвояването на желязо от TBI (Фигура 10).
5. PBT434 стимулира Fpn-зависим 55Fe2 плюс ефлукс
PBT434 има приблизително 20 процента от способността на деферипрон да произвежда очевидно стимулиране на Fe2 плюс изтичане от невронни клетки [30]. Ние оценихме ефлукса на 55Fe2 плюс от hBMVEC в отсъствието или присъствието на PBT434 в контролни клетки или клетки, третирани с мини-хепцидин, PR73. Хепсидинът е пептиден хормон, намиращ се както системно, така и в мозъчния интерстициум, който се свързва с Fpn и се насочва към транспортера за разграждане. Ефектите на хепцидина върху функцията за износ на желязо на Fpn са обстойно проучени [52–54]. По-рано показахме, че ефлуксът на Fe2 плюс от hBMVEC е зависим от Fpn [35, 49]. PR73 има EC50 от ~4 nM за Fpn разграждане в GFP репортерен анализ [55]. hBMVEC в монослоеве бяха заредени с 55Fe2 плюс за 24 часа в отсъствие или присъствие на PR73. След това изтичането на 55Fe се определя количествено за период от 5 часа при продължително отсъствие или присъствие на PR73 в комбинация с отсъствието и присъствието на PBT434 (Фигура 11). Докато PR73 потиска изтичането на 55Fe както от контролната, така и от третираната с PBT434-култура, PBT434 частично потиска инхибирането, дължащо се на мини-хепцидина. При отсъствието на PBT434, изтичането на желязо от културите, третирани с PR73-, беше намалено с ~75 процента, докато нокдаунът в културите, третирани с PBT434-, беше само ~50 процента (Фигура 11 и Таблица 2). От тези резултати могат да се направят два извода. Първо, нокдаунът на Fpn от PR73 регулира надолу изтичането на 55Fe в присъствието, както и в отсъствието на PBT434. Второ, при всяко от двете условия PBT434 поддържа значително, макар и малко стимулиране на изтичането на желязо.
Препратки
1. Hatcher HC, Singh RN, Torti FM, Torti SV. Синтетични и естествени хелатори на желязо: терапевтичен потенциал и клинична употреба. Future Med Chem. 2009 г.; 1(9):1643–70.
2 . Nuñez MT, Chana-Cuevas P. Нови перспективи в хелатотерапията с желязо за лечение на невродегенеративни заболявания. Pharmaceuticals (Базел). 2018 г.; 11(4):109.
3. Tosato M, Di Marco V. Метална хелаторна терапия и болестта на Паркинсон: Критичен преглед на термодинамиката на образуването на комплекси между съответните метални йони и обещаващи или утвърдени лекарства. Биомолекули. 2019 г.; 9(7).
4. Hedera P. Актуализация на клиничното управление на болестта на Wilson. Appl Clin Genet. 2017 г.; 10:9–19.
5. Xia S, Zhang W, Huang L, Jiang H. Сравнителна ефикасност и безопасност на дефероксамин, деферипрон и деферазирокс при тежка таласемия: мета-анализ на 16 рандомизирани контролирани проучвания. PLoS One. 2013; 8(12):e82662.
6. Buettner GR, Jurkiewicz BA. Каталитични метали, аскорбат и свободни радикали: комбинации, които трябва да се избягват. Radiat Res. 1996 г.; 145 (5): 532–41. PMID: 8619018
7. Singh A, Kukreti R, Saso L, Kukreti S. Оксидативен стрес: ключов модулатор при невродегенеративни заболявания. Молекули. 2019 г.; 24 (8).
8. Ashraf A, Clark M, So PW. Остаряването на Железния човек. Предни стареене Neurosci. 2018 г.; 10:65 часа.
9. Ghadery C, Pirpamer L, Hofer E, Langkammer C, Petrovic K, Loitfelder M, et al. R2 * картографиране за мозъчно желязо: асоциации с познанието при нормално стареене. Невробиолно стареене. 2015 г.; 36 (2): 925–32.
10. Zecca L, Youdim MBH, Riederer P, Connor JR, Crichton RR. Желязо, стареене на мозъка и невродегенеративни заболявания. Nat Rev Neurosci. 2004 г.; 5(11):863–73.
11. Di Meo I, Tiranti V. Класификация и молекулярна патогенеза на NBIA синдроми. Eur J Paediatr Neurol. 2018 г.; 22 (2): 272–84.
12. Levi S, Finazzi D. Невродегенерация с натрупване на желязо в мозъка: актуализация на патогенните механизми. Front Pharmacol. 2014 г.; 5:99–.
13. Levi S, Tiranti V. Невродегенерация с нарушения в натрупването на желязо в мозъка: ценни модели, насочени към разбиране на патогенезата на отлагането на желязо. Pharmaceuticals (Базел). 2019 г.; 12(1).
14. Майер E, Kurian MA, Hayflick SJ. Невродегенерация с натрупване на желязо в мозъка: генетично разнообразие и патофизиологични механизми. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015 г.; 16: 257-79.
15. Tonekaboni SH, Mollamohammadi M. Невродегенерация с натрупване на желязо в мозъка: преглед. Иран J Child Neurol. 2014 г.; 8(4):1–8. PMID: 25657764
16. Cozzi A, Orellana DI, Santambrogio P, Rubio A, Cancellieri C, Giannelli S, et al. Моделирането на невроферитинопатията със стволови клетки разкрива желязото като определящ фактор за стареенето и фероптозата по време на стареенето на невроните. Доклади за стволови клетки. 2019 г.; 13(5):832–46.
17. Liu JL, Fan YG, Yang ZS, Wang ZY, Guo C. Желязо и болестта на Алцхаймер: от патогенезата до терапевтичните последици. Предни неврони. 2018 г.; 12:632.
18. Llorens JV, Soriano S, Calap-Quintana P, Gonzalez-Cabo P, Molto MD. Ролята на желязото в атаксията на Фридрих: Прозрения от изследвания върху човешки тъкани и клетъчни и животински модели. Предни неврони. 2019 г.; 13:75 часа.
19. Puschmann A. Нови гени, причиняващи наследствена болест на Паркинсон или паркинсонизъм. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017; 17(9):66.
20. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Насочване към метаболизма на желязото при откриване и доставка на лекарства. Nat Rev Drug Discov. 2017 г.; 16(6):400–23.
21. Guralnik JM, Eisenstaedt RS, Ferrucci L, Klein HG, Woodman RC. Разпространение на анемия при хора на 65 и повече години в Съединените щати: доказателства за висок процент на необяснима анемия. Кръв. 2004 г.; 104 (8): 2263–8.
22. Pepe A, Meloni A, Capra M, Cianciulli P, Prossomariti L, Malaventura C, et al. Лечение с деферазирокс, деферипрон и десфериоксамин при големи пациенти с таласемия: сърдечно желязо и сравнение на функциите, определени чрез количествено магнитно резонансно изображение. Хематология. 2011 г.; 96 (1): 41–7.
23. Pandolfo M, Arpa J, Delatycki MB, Le Quan Sang KH, Mariotti C, Munnich A, et al. Деферипрон при атаксия на Friedreich: 6-месечно рандомизирано контролирано проучване. Ан Нейрол. 2014 г.; 76 (4): 509–21.
24. Martin-Bastida A, Ward RJ, Newbould R, Piccini P, Sharp D, Kabba C, et al. Хелиране на желязо в мозъка чрез деферипрон във фаза 2 рандомизирано двойно-сляпо плацебо-контролирано клинично изпитване при болестта на Паркинсон. Sci Rep. 2017; 7(1):1398.
25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault M, Laloux C, et al. Насочване към хелатно желязо като терапевтична модалност при болестта на Паркинсон. Антиоксиден редокс сигнал. 2014 г.; 21 (2): 195–210. https://doi. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381
26. Singh S, Epemolu RO, Dobbin PS, Tilbrook GS, Ellis BL, Damani LA и др. Метаболитни профили на урината при хора и плъхове на 1,2-диметил- и 1,2-диетил-заместени 3-хидрокси пиридин-4-они. Метаболизъм и разпределение на лекарствата. 1992 г.; 20(2):256. PMID: 1352218
27. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, Xu Y, Ho PY, Bridges A, et al. Деферипрон: Пан-селективно изследване на активността на инхибиране на хистон лизин деметилаза и връзката между структурната активност. Sci Rep. 2019; 9(1):4802.
28. Hider R. Последни разработки, съсредоточени върху перорално активни хелатори на желязо. Доклади за таласемия. 2014 г.; 4 (2).
29. Косман DJ. Метаболизъм на желязото в аероби: управление на хидролизата на желязото и автоокислението на желязото. Coord Chem Rev. 2013; 257 (1): 210–7.
30. Finkelstein DI, Billings JL, Adlard PA, Ayton S, Sedjahtera A, Masters CL, et al. Новото съединение PBT434 предотвратява медиираната от желязо невродегенерация и алфа-синуклеинова токсичност при множество модели на болестта на Паркинсон. Acta Neuropathol Commun. 2017 г.; 5(1):53.
31. Heras-Garvin A, Refolo V, Schmidt C, Bradbury M, Stamler D, Stefanova N, редактори. PBT434 запазва допаминергичните неврони, намалява олигомеризацията на алфа-синуклеин и подобрява двигателната функция в модел на трансгенна миша множествена системна атрофия. Анали по неврология; 2020: Wiley 111 River St, Hoboken 07030–5774, NJ САЩ.
32. Херас-Гарвин А, Стефанова Н. MSA: От основни механизми до експериментална терапия. Разстройство, свързано с паркинсонизъм. 2020 г.; 73:94-104.
33. Dawson VL, Dawson TM. Обещаващи болест-модифициращи терапии за болестта на Паркинсон. Научна транслационна медицина. 2019 г.; 11(520):eaba1659.
34. Eigenmann DE, Xue G, Kim KS, Moses AV, Hamburger M, Oufir M. Сравнително изследване на четири обезсмъртени човешки мозъчни капилярни ендотелни клетъчни линии, hCMEC/D3, hBMEC, TY10 и BB19, и оптимизиране на условията на култура за in vitro модел на кръвно-мозъчната бариера за изследвания на пропускливостта на лекарства. Течности и бариери на ЦНС. 2013; 10(1):33.
35. Маккарти RC, Косман DJ. Церулоплазминът и хепцидинът на глиалните клетки диференциално регулират изтичането на желязо от мозъчните микроваскуларни ендотелни клетки. PLoS One. 2014 г.; 9(2):e89003.
36. Steimle BL, Smith FM, Kosman DJ. Носителите на разтворени вещества ZIP8 и ZIP14 регулират натрупването на манган в мозъчните микроваскуларни ендотелни клетки и контролират нивата на манган в мозъка. J Biol Chem. 2019 г.; 294 (50): 19197–208.
37. Stins MF, Badger J, Sik Kim K. Бактериална инвазия и трансцитоза в трансфектирани човешки мозъчни микроваскуларни ендотелни клетки. Микробен патоген. 2001 г.; 30(1):19–28.
38. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Първо изследване при хора на PBT434, нов малък молекулен инхибитор на -синуклеинова агрегация (S4.001). Неврология. 2019 г.; 92(15 Допълнение):S4.001.
39. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Фаза 1 проучване на PBT434, нов малък молекулен инхибитор на -синуклеинова агрегация, при възрастни и по-възрастни възрастни доброволци (4871). Неврология. 2020 г.; 94 (15 Допълнение): 4871.
40. Маккарти RC, Косман DJ. Активиране на C6 глиобластомна клетъчна експресия на церулоплазмин от съседни интерлевкини, получени от човешки мозъчен ендотел, в моделна система на кръвно-мозъчна бариера in vitro. Клетъчна комуникация и сигнализация: CCS. 2014 г.; 12:65 часа.
41. Маккарти RC, Парк YH, Косман DJ. sAPP модулира изтичането на желязо от мозъчните микроваскуларни ендотелни клетки чрез стабилизиране на износителя на двувалентно желязо феропортин. Доклади на EMBO. 2014 г.; 15 (7): 809–15. https://doi. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889
42. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Two to Tango: Регулиране на метаболизма на желязото при бозайници. клетка. 2010 г.; 142 (1): 24–38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012
43. Zhou ZD, Tan EK. Желязо регулаторен протеин (IRP) - желязо-отговарящ елемент (IRE) сигнален път при човешки невродегенеративни заболявания. Молекулярна невродегенерация. 2017 г.; 12(1):75. https://doi.org/10. 1186/s13024-017-0218-4 PMID: 29061112
44. Крайтън Р. Р., Декстър Д. Т., Уорд Р. Дж. Метаболизъм на желязото в мозъка и неговото нарушение при неврологични заболявания. J Neural Transm. 2011 г.; 118 (3): 301–14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066
45. Patel SJ, Frey AG, Palenchar DJ, Achar S, Bullough KZ, Vashisht A, et al. PCBP1-BolA2 шаперонов комплекс доставя желязо за сглобяване на цитозолен [2Fe-2S] клъстер. Nat Chem Biol. 2019 г.; 15 (9): 872–81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370
46. Mukhopadhyay CK, Mazumder B, Fox PL. Роля на индуцируемия от хипоксия фактор -1 в транскрипционното активиране на церулоплазмин от дефицит на желязо. J Biol Chem. 2000 г.; 275 (28): 21048–54.
47. Strowitzki MJ, Cummins EP, Taylor CT. Протеиново хидроксилиране чрез хидроксилази, предизвикани от хипоксия (HIF): уникални или повсеместни? клетки. 2019 г.; 8(5).
48. De Domenico I, Vaughn MB, Li L, Bagley D, Musci G, Ward DM, et al. Медиираната от феропортин мобилизация на феритиново желязо предшества разграждането на феритин от протеазомата. Embo j. 2006 г.; 25 (22): 5396–404.
49. Маккарти RC, Косман DJ. Феропортинът и екзоцитоплазмената фероксидазна активност са необходими за изтичане на желязо от мозъчни микроваскуларни ендотелни клетки. Вестник по биологична химия. 2013; 288 (24): 17932-40.
50. Маккарти RC, Косман DJ. Механичен анализ на натрупването на желязо от ендотелните клетки на BBB. Биомети. 2012 г.; 25 (4): 665–75.
51. Косман Д.Ж. Телосът на метало-редукция и метало-окисление в еукариотния трафик на желязо и мед. Металомика. 2018 г.; 10(3):370–7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341
52. Aschemeyer S, Qiao B, Stefanova D, Valore EV, Sek AC, Ruwe TA, et al. Структурно-функционалният анализ на феропортин определя мястото на свързване и алтернативния механизъм на действие на хепцидина. Кръв. 2018 г.; 131 (8): 899–910.
53. Ganz T, Nemeth E. Хепцидин и желязна хомеостаза. Biochim Biophys Acta. 2012 г.; 1823 (9): 1434–43.
54. Qiao B, Sugianto P, Fung E, Del-Castillo-Rueda A, Moran-Jimenez MJ, Ganz T, et al. Индуцираната от хепцидин ендоцитоза на феропортин зависи от убиквитинирането на феропортин. Cell Metab. 2012 г.; 15 (6): 918–24.
55. Fung E, Chua K, Ganz T, Nemeth E, Ruchala P. Тиол-дериватизирани минихепцидини запазват биологична активност. Bioorg Med Chem Lett. 2015 г.; 25 (4): 763–6.
Даниел К. БейлиID, Уитни Кларк, Даниел Дж. Косман
Катедра по биохимия, Училище по медицина и биомедицински науки Jacobs, Държавен университет на Ню Йорк в Бъфало, Бъфало, Ню Йорк, Съединени американски щати
