Част 1: Ефекти на изорамнетин върху диабета и свързаните с него усложнения: Преглед на in vitro и in vivo проучвания и пост хок транскриптомен анализ на участващия молекулярен път

За повече информация. контактtina.xiang@wecistanche.com

Резюме: Диабетмелитус, особено тип 2 (T2DM), е основен проблем за общественото здраве в световен мащаб. ЗД се характеризира с високи нива на гликемия и инсулинемия поради нарушена инсулинова секреция и инсулинова чувствителност на клетките, известна като инсулинова резистентност. T2DM причинява множество и тежки усложнения като нефропатия, невропатия и ретинопатия, причиняващи клетъчно оксидативно увреждане в различни вътрешни тъкани, особено панкреаса, сърцето, мастната тъкан, черния дроб и бъбреците. Растителните екстракти и техните биоактивни фитохимикали придобиват интерес като нови терапевтични и превантивни алтернативи за T2DM и свързаните с него усложнения. В тази връзка, изорамнетин, растениефлавоноид, отдавна е изследван за неговите потенциални антидиабетни ефекти. Този преглед описва въздействието му върху намаляване на свързаните с диабета разстройства чрез намаляване на нивата на глюкозата, подобряване на оксидативния статус, облекчаване на възпалението и модулиране на липидния метаболизъм и диференциацията на адипоцитите чрез регулиране на включените сигнални пътища, докладвани в in vitro и in vivo проучвания. Освен това, ние включваме post hoc анализ на транскриптома на целия геном на биологичните активности на изорамнетин с помощта на инструмент, базиран на стволови клетки.

Ключови думи: изорамнетин; кверцетин; биологични дейности; диабет; молекулярни пътища; микрочипове

Щракнете тук, за да научите повече контакти

1. Въведение

Растенията се използват като традиционни лекарства в почти всички континенти на света от древни времена. Научните изследвания на причините за тяхната медицинска употреба са довели до изследването на биоактивни молекули. Екстремофилните растения, които растат в екстремни условия на околната среда, се считат за добър потенциален източник на интересни биоактивни молекули. Всъщност тези екологични ограничения са в основата на дисфункционалния кислороден метаболизъм, който води до оксидативен стрес чрез увеличаване на реактивните кислородни видове (ROS)[1,2]. Някои растения, като халофитите, имат мощенантиоксидантсистема за елиминиране на тези вредни съединения. Сред биоактивните молекули, които представляват интерес, има фенолни съединения. Няколко проучвания оценяват растения, богати на полифеноли, със или без ограничителни условия в лабораторията [3-10]. Няколко биологични ефекта се приписват на екстрактите, богати на полифеноли, като противовъзпалителни и противоракови действия [11-13]. Други проучвания показват антиоксидантните, антимикробните [8,14-16], както и против затлъстяване, антидиабетни и антихепатални стеатотични [17-19] ефекти на изорамнетин. Сред тези полифеноли,флавоноидисе отличават. Тази група включва няколко подгрупи, като флавоноли. Изорхамнетинът е едно от основните съединения на флавонолите. Изорхамнетинът е монометокси флавон или О-метилиран флавонол от класа на флавоноидите. то екверцетинв която метокси група замества хидрокси групата в позиция 3'. Някои производни на изорамнетин присъстват в природата, като изорамнетин 3-O- -d-глюкопиранозид, изорамнетин 3-O-неохесперидозид и изорамнетин 3-O-рутинозид от Calendula officinalis L [20]. Изорхамнетинът притежава значителни биологични свойства като антиоксидант [21], противораков [22], антимикробен [23], антивирусен [24], противовъзпалителни и антидиабетни ефекти [21,25-33].

В този преглед първият фокус е върху произхода, химичната структура, методите за изолиране и екстракция, както и фитохимичния аспект на изорамнетин. След това, във втората част, ние се фокусираме върху описанието на потенциалните антидиабетни ефекти на този флавонол чрез намаляване на свързаните с диабета разстройства чрез намаляване на нивата на глюкозата, подобряване на оксидативния статус, облекчаване на възпалението и модулиране на липидния метаболизъм и диференциацията на адипоцитите. И накрая, извършихме вторичен анализ на нашите публикувани по-рано данни от микрочипове на целия геном, за да изследваме свързаните с диабета биоактивности на изорамнетин в инструмент, базиран на стволови клетки. Ние също се стремим да подчертаем ефекта на тази молекула върху регулирането на включените сигнални пътища, като докладваме in vitro и in vivo проучвания, използвани в тази област на изследване. В този преглед разкрихме характеристиките на антидиабетната активност на изорамнетин в сравнение скверцетинкойто се счита за метаболит на изорамнетин и важна референция в естественото лечение на диабет.

2. Общ преглед на биоактивните молекули в частност на полифенолите и флавоноидите

2.1. Оксидативният стрес като източник на биоактивни молекули в растенията

Няколко растения могат да бъдат подложени на различни условия на околната среда (соленост, суша, ултравиолетови лъчи, тежки метали, екстремни температури, дефицит на хранителни вещества, замърсяване на въздуха и атаки на патогени). Тези ограничения са в основата на дисфункциите на кислородния метаболизъм, които генерират оксидативен стрес чрез увеличаване на реактивните кислородни видове (ROS). Молекулата на кислорода (O2) играе важна роля във фотосинтезиращите организми. Първоначално във висшите растения и водорасли обменът на газ с участието на електрони се извършва в хлоропластите чрез улавяне на въглероден диоксид през деня и производство на кислород. Този газов обмен включва електрони. Наистина, в случай на сериозни ограничения на околната среда, голяма част от кислорода не се редуцира и по този начин може да генерира ROS в някои органели от растителни клетки [1,2] поради дисбаланс в правилното функциониране на хлоропластите и преноса на електрони [ 1]. Освен това, при ограниченията на околната среда, споменати по-горе, се произвеждат много ROS, като хидроксилен радикал (OH), супероксиден анионен радикал (O,-), алкоксилни и пероксилни радикали (RO: и RO2, съответно), водороден пероксид (H2O2, ), хипохлоритен радикал (-OCl), синглетен кислород (O2), азотен оксиден радикал (NO) и други липидни пероксиди (като малондиалдехид и 4-хидроксиноненал)[2,34,35]. Понякога ROS може да играе роля в клетъчното сигнализиране във физиологичното поведение на растенията, например в процеса на растеж и развитие на семена, развитие на тъкани и прехода от клетъчна пролиферация към клетъчно удължаване по време на по-ранните етапи на диференциация [36] . На високо ниво тези молекули причиняват молекулярно увреждане като липидна пероксидация на мембраните, промяна на протеини и ДНК и клетъчна смърт [1,35,37]. Някои растения, като халофитите, имат способността да се адаптират добре към тези условия чрез мощна антиоксидантна система. Известно е, че халофитите са източник на вторични метаболити като полифеноли [3-10]. Тези автори показват, че при тежки условия полифенолите се синтезират, за да играят важна роля в защитата срещу предизвикано от стреса оксидативно увреждане. Биосинтезата, съдържанието и активността на тези фенолни съединения са функция на няколко външни (светлина, температура, соленост и сухота) и вътрешни (генотип, орган и етап на развитие) параметри, влияещи върху тяхното съдържание и разпределение в растенията [ 8,38,39]. Например в Pyracantha coccinea някои флавоноиди като флаванони, флавони и флавоноли присъстват в издънките по време на вегетативната фаза и в корените изключително по време на репродуктивната 40]. От друга страна, няколко автори са показали, че тези фенолни съединения имат други биологични свойства като противовъзпалителни и противоракови действия [11-13]. Други проучвания показват антиоксидантните, антимикробните [8,14-16], както и антидиабетичните [18,41,42] ефекти на фенолните екстракти.

2.2. Класификация на естествените антиоксиданти

Антиоксидантната система може да бъде класифицирана според естеството на тези компоненти на ензимни и неензимни съединения. Първите включват супероксид дисмутаза (SOD), каталаза (CAT), аскорбат пероксидаза и глутатион редуктаза [1, 3542-44]. Гените, свързани с тези ензими, разкриват тяхното значение по време на физиологичното влошаване след прибиране на реколтата на корена за съхранение и в отговор на осмотичен стрес и абсцизова киселина, както и инфекция с Xanthomonas axonopodis [44]. Втората група включва главно фенолни съединения, каротеноиди, витамини и осмолити [1]. Фенолните съединения се характеризират с наличието на един или повече бензенови пръстени и се различават по сложността на основната молекула, броя и местоположението на хидроксилната група и степента на полимеризация. Тези съединения са вторични метаболити, които попадат в три големи групи: фенолни киселини (производни на бензоена и канелена киселини), флавоноиди (флавоноли, флавоноли, флаванони, флавони, антоцианини) и танини (хидролизируеми танини и проантоцианидини). В допълнение към тези молекули се отличават стилбени, лигнани и кумарини [45].

2.3. Произход и биохимична структура на флавоноидите, по-специално изорамнетин

Фенолните съединения са вторични метаболити, преобладаващи в растенията. Тези съединения са с ароматен пръстен с една или повече хидроксилни групи (ОН) и съдържат молекули, вариращи от прости фенолни киселини до полимеризирани съединения като танини. Синтезът на фенолни съединения е сложен процес, който преминава през няколко етапа. Фенолните съединения са биоактивни молекули с два пътя на произход: от едната страна шикимовата киселина и от другата страна, фенилпропаноидните молекули. Биосинтезата на флавоноиди като изорамнетин се основава на тези пътища. Всъщност, от една страна, шикиматът дава основния скелет на полифенолите, които имат един или повече бензенови пръстени (C6), носещи една или повече хидроксилни функции. От друга страна, има синтез на C6-C3 база, образувана от кондензацията на фенилаланин до канелена киселина (Фигура 1)[46].

По-точно, шикимовата киселина е в основата на няколко реакции, представляващи скелета на ароматните аминокиселини, които са инициатори на фенолни съединения. Първата стъпка се състои от комбинация от две молекули: фосфоенолпируват и еритроза 4-фосфат, които след четири реакции водят до образуването на първия скелет от феноли: шикимат или шикимова киселина (CHoOs). Това по-късно представя първия пръстен, който характеризира феноли с две хидроксилни групи. Шикиматът претърпява шест реакции, които завършват с първата аминокиселина: фенилаланин. Благодарение на два ключови ензима, фенилаланин амонячна лиаза (PAL) и цинамат-4-хидроксилаза (C4H), фенилаланинът последователно образува цинамат и р-кумарат. В тази стъпка нивото на активност на PAL може да регулира количествено натрупването на фенолни съединения. Молекулата p-кумарат е в основата на кумариновите производни. Пътят за синтеза на фенилпропаноидните молекули се характеризира с наличието на ключов ензим, наречен 4-кумарат CoA лигаза (4CL), който катализира в присъствието на тиолната функция на коензим A(CoA) р-кумаровата киселина в 4-кумароил CoA(C30Ha2N-O18P, S). Ароматният А-пръстен на флавоноидите се получава от кондензацията на три молекули малонил-CoA (-C6).

Впоследствие 4-кумароил CoA произвежда нарингениновия халкон, обяснявайки връзката между ароматния B-пръстен и 3C този на халкона (C6-C3-). Халконът е ключов елемент в тази тема, защото е предшественик на всички флавоноиди, базирани на петнадесет въглероден скелет, състоящ се от два бензенови пръстена. След това халконът се превръща в нарингенин (наричан още флаванон или трихидрокси флавон) чрез действието на халкон изомераза (CHI). От една страна, флавоните като апигенин, акацетин, кризин или лутеолин се синтезират от нарингенин в присъствието на флавон синтаза (FNS). От друга страна, различни флавоноли и съединения на янтарната киселина се произвеждат от нарингенин в присъствието на два ензима; флаванон 3-диоксигеназа (F3D) и флавонол синтаза (FS). Освен производни на флавонола се произвеждат и други съединения, като кемпферол, мирицетин и кверцетин. Чрез прехвърляне на метилова група от S-аденозил-L-метионин, изорамнетинът се произвежда в присъствието на флавон 3'-O-метилтрансфераза (FMT)[47,48]. Тогава изорамнетинът е монометокси флавон или О-метилиран флавонол от класа флавоноиди. Това е кверцетин (прекурсор), в който хидрокси групата на позиция 3' е заменена с метокси група. Някои производни на изорамнетин присъстват в природата, като изорамнетин 3-O- -d-глюкопиранозид, изорамнетин 3-O-неохесперидозид и изорамнетин 3-O-рутинозид от Calendula officinalis L [20].

Всъщност флавоноидите се считат за една от най-важните групи от семейството на полифенолите. Те имат структура, базирана на дифенилпропанов тип с два бензенови пръстена (пръстен А и В, вижте Фигура 2), свързани с верига от три въглерода, която образува затворен пиранов пръстен (С пръстен). Следователно тяхната структура се означава като C6-C3-C6. Позициите на О-гликозилиране са С7 във флавоните, изофлавоните, флаваноните и флавонолите и С3 във флавонолите и антоцианидините. Позициите на C-гликозилиране са C6 и C8 във флавоните [49]. В допълнение, значението на антиоксидантната роля на фенолните съединения е свързано със степента на хидроксилиране на молекулата. Флавоноидите включват изофлавони, флавони, флаванони и техните гликозиди и флавоноли като изорамнетин, който също се нарича 3'-метокси кверцетин и 3-метил кверцетин [50]. В растенията един ензим, UDP-зависимите гликозилтрансферази, е отговорен за гликозидната форма на изорамнетин (изорамнетин 3-O-глюкозид). Този ензим използва нуклеотидни дифосфатни захари, обикновено уридиндифосфатни (UDP)-захари, за да прехвърли метиловата група в цикъла и да асоциира гликозидната функция с изорамнетин [51].

2.4. Изолиране и анализи на илсорхамнетин, произхождащ от лечебни растения

Разпространението на изорамнетин в лечебните растения е много широко и методите за екстракция и анализ са разнообразни. Производните на изорамнетин са особено желани. Хидроксилните и метиловите групи помагат при тяхното характеризиране. Използват се някои методи за извличане на изорамнетин, сред които на базата на фракциониране, използване на хемометрични подходи, ензим и суперкритична флуидна екстракция (SFE-CO2). Първо, фракционирането може да се използва за опростяване на екстракцията чрез отстраняване на всички маслени и липофилни пигменти от пробите, съдържащи липиди. Обезмаслената проба също се обработва с ултразвук преди накисване в смес от метанол и вода. След това хроматографията може да се използва за анализи на фенолни съединения, особено флавоноиди [49]. За тези последни съединения се използва LC-MS и често се прилагат йонизация с електроспрей (ESI) и химическа йонизация при атмосферно налягане, като най-добрата чувствителност за флавоноиди обикновено се постига в режим на отрицателни йони [49]. Например, фитохимията на растителни фракции Calligonum Azel Maire, събрани от тунизийската пустиня, е оценена и е използвана ултрависоко ефективна течна хроматография, съчетана с четворна масспектрометрия на времето на полета UHPLC-ESI-QTOF за идентифициране на феноли сред тях флавони и флаваноли, които са най-разпространените идентифицирани фенолни съединения [52]. По-конкретно, наличието на изорамнетин глюкозид и изорамнетин глюкозил-рамнозид беше потвърдено като основни съединения в листата на ядливия халофит Mesembryanthemum edule с помощта на LC/ESI-MS/MS технология [3]. Тази работа беше последвана от други, които са използвали LC-ESI-TOF-MS за характеризиране на много полифеноли; сред тях флавоноидите са идентифицирани от надземни части на етапа на пълен цъфтеж на халофити като Arthrocnemum indicum [5], Tamarix gallica [16], Glaucium flavum [13] и Salsola kali [8]. Подобно на последните работи, LC-ESI-TOF-MS и GC-MS профилиране на Artemisia herbal беше извършено за идентифициране на феноли, като флавони, флавоноли и флавоноидни алкалоиди [7]. Друга работа беше извършена върху Pancratium maritimum и анализът чрез HPLC-DAD-ESI/MS разкри наличието на флавоноиди, включително флавонол като изорамнетин с техните пентоксидни и хексозидни конюгати като изорамнетин ди-хексозид [53].

Като немаслено съединение, флавонолите могат да бъдат изолирани с хексан. След това може да се използва полярен разтворител като етанол. Проучване върху Limoniastrum guyonianum с помощта на HPLC показа наличието на много феноли, сред които изорамнетин-3-О-рутинозид [54].

Далеч от фенолните екстракти, фенолните съединения се намират и в масла като зехтина [55]. Тези съединения имат способността да предпазват маслата от окисляване и да подобряват хранителната стойност на маслото. Изорхамнетинът, като фенолно съединение, също е открит в маслен екстракт от семена от тунизийски черен кимион (Nigella sativa L.), получен със зелен разтворител като 2-метил тетрахидрофуран (MeTHF) като алтернатива на петрол или хексан -разтворител за извличане на обогатени с масло фенолни съединения [10]. Наличието на изорамнетин се потвърждава чрез HPLC анализ. Анализите, използващи течна хроматография с детектор с диодна матрица (LC-DAD), разкриват голямо количество изорамнетин, вариращо между 6,3 и 6,6 (ug/g масло) след екстракция на масло от черен кимион съответно с MeTHF и хексан. В допълнение, използвайки Н ядрено-магнитен резонанс (HNMR) и С ядрено-магнитен резонанс (CNMR), някои флавонолови гликозиди като кемпферол-3-О-рутинозид (никотифлорин) и изорамнетин-3-О-рутинозид (нарцисизъм) са характеризирани от надземните части на Peucedanum aucheri Boiss, събрани в град Мариван, провинция Кюрдистан, Иран [56]. ЯМР методът открива свойството, че определени атомни ядра на съединението взаимодействат с магнитно поле. Това свойство, което е да произвежда магнитен резонанс при определена честота, предоставя информация за структурата на молекулата. Второ, избрани са математически модели, за да се оцени ефективността на екстракцията на флавонол, особено за да се разбере най-добрият начин за получаване на изорамнетин-3-О-рутинозид [20]. Беше проведен многовариантен факторен анализ с помощта на цветя от Calendula officinalis. Бяха анализирани линейни, квадратични, пълни кубични и специални кубични модели. Крайният пълен кубичен беше най-подходящият, позволяващ по-голяма ефективност при извличането на изорамнетин-3-О-рутинозид с 60 процента. За това изследване ензимите Rapides Maxi Fruit и Viscozyme са използвани при някои важни фактори, влияещи върху активността на ензима при суперкритични условия на CO2 като налягане, температура, рН, време и воден разтвор на етанол. И накрая, методът за екстракция на суперкритичен флуид беше използван за извличане на фенолни съединения като флавоноли. Преди много години процедурата за суперкритична флуидна екстракция беше използвана за първи път върху кората на Eucalyptus globulus, използвайки чист и модифициран CO2 с вода, етил ацетат и етанол [57]. Авторите показват, че суперкритичният CO2, комбиниран с етанол, може да извлече значителни количества фенолни съединения, включително изорамнетин. HPLC-MS количествено определяне на някои флавоноли, като изорамнетин-хексозид (0,26 gg-I от екстракт) и прост изорамнетин (14,29 mg:gI от екстракт). Като съразтворител се използва етанол. Количественото определяне се извършва с течна хроматография под високо налягане, оборудвана с фотодиоден детектор. Изорамнетин 3-О-глюкозил-рамнозил-рамнозид, изорамнетин 3-О-глюкозил-рамнозил-пентоксид, изорамнетин 3-О-глюкозил-рамнозид и изорамнетин 3-О-глюкозил -пентоксид са най-разпространените флавоноли, извлечени от свръхкритичните екстракти на O. ficus-indica. Както бе споменато по-горе, течната хроматография под високо налягане или HPLC е често използван метод за анализиране на фенолни съединения. В сок от ябълка и сок от круши е открит изорамнетин 3-О-глюкозид. Всъщност разделянето на флавонолните гликозиди в екстракт от ябълка "Brettacher" чрез HPLC и масспектрометрия разкрива наличието на две гликозидни форми като изорамнетин 3-О-глюкоза и изорамнетин 3-О-галактозид [ 58].