Пентраксин-3-медиирано активиране на комплемента в свински модел на бъбречна исхемия/реперфузионно увреждане

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Киара Дивела и др

АБСТРАКТ

Пентраксините са семейство от еволюционно запазени молекули за разпознаване на образи с централна роля във вродения имунитет и възпалението, като опсонизирането на патогени по време на бактериални и вирусни инфекции. По-специално е показано, че дългият Pentraxin 3 (PTX3) регулира няколко аспекта на съдово и тъканно възпаление по време на трансплантация на твърди органи.

Нашето проучване изследва ролята на PTX3 като възможен модулатор на активирането на комплемента в свински модел на увреждане на бъбречна исхемия/реперфузия (I/R). Ние демонстрирахме, че индуцираните от I/R наранявания ранни PTX3 отлагания на перитубулни и гломерулни капилярни нива. Конфокалната лазерна сканираща микроскопия разкрива отлагания на PTX3, които се локализират заедно с CD31 плюс ендотелни клетки. В допълнение, PTX3 се свързва с инфилтриращи макрофаги (CD163), дендритни клетки (SWC3a) и миофибробласти (FSP1). По-специално, ние демонстрирахме значително PTX3-медиирано активиране на класически (C1q-медииран) и лектин (MBL-медииран) пътища на комплемента. Интересно е, че отлаганията на PTX3 са локализирани съвместно с активирането на крайния комплекс на комплемента (C5b-9) върху ендотелни клетки, което показва, че медиираното от PTX{17}} активиране на комплемента е настъпило главно на ниво бъбречни съдове. В заключение, тези данни показват, че PTX3 може да бъде потенциална терапевтична цел за предотвратяване на индуцирано от комплемента I/R увреждане.

Кореспонденция до:Джузепе Кастелано

Ключови думи:исхемично/реперфузионно увреждане, система на комплемента, пентраксин 3,бъбрек, класически път

Cistanche tubulosa предотвратява бъбречни заболявания, щракнете тук, за да получите пробата

ВЪВЕДЕНИЕ

Исхемично-реперфузионното (I/R) увреждане представлява основната причина за острабъбрекнараняванеслед трансплантация и се характеризира със значително активиране на системата на комплемента [1, 2]. В този сценарий ендотелните клетки (EC) играят критична роля в неадаптивното възстановяване след I/R, което води до ранна фиброза чрез ендотелен към мезенхимален преход (EndMT) [3]. По време на фазата на реперфузия комплементът организира имунологични и възпалителни процеси, допринасяйки за различни имунни и възпалителни заболявания [2–5]. Други съществени компоненти на хуморалното рамо на вродената имунна система са представени от пентраксини, за които се смята, че играят ключова роля в съдовата биология [6].

Пентраксините са семейство мултимерни разтворими протеини [6], които се класифицират в къси и дълги семейства въз основа на тяхната структура [7]. Тези еволюционно запазени протеини са ефектори в острата фаза, които служат като сензори за иницииране на възпаление и бързо нарастват в плазмата по време на инфекция [8]. Дългият пентраксин 3 (PTX3) е разтворима молекула за разпознаване на образи, която е от решаващо значение за вродената имунна защита и може да активира системата на комплемента [9–11].

По-специално, PTX3 индуцира класическа и лектинова пътека за активиране чрез свързване с C1q, MBL, Ficolin-2 и е в състояние да повлияе на алтернативната пътека чрез CFH [10–12].

За разлика от други пентраксини, произвеждани от черния дроб в кръвния поток (т.е. CRP), PTX3 може да бъде освободен от резидентни клетки в мястото на възпалението, например от мононуклеарни фагоцити, дендритни клетки, фибробласти и EC [9], действащи по паракринен начин [13]. PTX3 също се съхранява в готова форма в неутрофили, локализиран в специфични гранули и секретиран в отговор на разпознаването на микробни части [14]. В EC, експресията на PTX3 лесно се индуцира от TNF- и IL-1, давайки преход от неподвижен, противовъзпалителен фенотип, към прокоагулантно и провъзпалително състояние, като по този начин силно регулира микроваскуларната функция [7, 8 ]. Поради тази причина нивата на PTX3 са описани катохрониченбъбрекзаболяване, повишаването на протеиновите нива на PTX3 е свързано с понижения на GFR и сърдечно-съдови усложнения, но все още се знае малко за ролята на PTX3 в ранните настройки като I/R-индуцирана острабъбрекнараняване [15, 16].

Ролята на PTX3 при бъбречни възпалителни заболявания е двувалентна, от страна протеинът може да активира класически и лектинови пътища, насърчавайки първоначално възпаление и увреждане [10–12]. От друга страна, N-терминалният домен на PTX3 модулирано активиране на комплемента отслабва набирането на левкоцити и инхибира интерстициалната фиброза при остро бъбречно увреждане, насърчавайки възстановяването на тъканите [17–20].

Комплементът играе ключова роля в патофизиологията на индуцираното от I/R нараняване остробъбрекнараняване[21, 22]. В свински модел на бъбречно I/R увреждане, ние демонстрирахме основната роля на активирането на системата на комплемента за индуциране на EndMT и ранна фиброза, с участието както на класически, така и на лектинови пътища [23]. Освен това, ние демонстрирахме, че терапевтичното инхибиране на тези комплементни пътища от рекомбинантен C1-INH (rhC1INH) води до значително намаляване на отлагането на комплемента, с намалено набиране на инфилтриращи възпалителни клетки и тубулоинтерстициално увреждане [23]. Тези резултати бяха потвърдени и от Delpech PO et al [24]; значителна модулация в C1q, MASP и C4d гломерулно и тубулно отлагане беше оценено след 30 минути след реперфузия, което показва централна роля на C1-INH за противодействие на класическите и лектиновите пътища.

В това проучване ние изследвахме възможното участие на PTX3 в медиирането на ранното активиране на комплемента при бъбречно I/R увреждане, характеризирайки различните клетъчни източници на PTX3.

РЕЗУЛТАТИ

PTX3 се експресира от ендотелни клетки и имунни инфилтриращи клетки в свински модел на I/R увреждане

Първо, ние изследвахме наличието на PTX3 в свински модел на топло I/R-индуцирано бъбречно увреждане. Наблюдавахме много ограничени отлагания на PTX3 в нормална тъкан (Фигура 1А). I/R нараняване причинява дифузно отлагане на PTX3 вече 15 минути след реперфузия (Фигура 1B, 1C) в тубулоинтерстициалната област (Фигура 1E), в перитубуларните капиляри (Фигура 1D; стрелка) и на гломерулни нива (Фигура 1D). PTX3 отлаганията все още се откриват 1 час след реперфузия на нивото на перитубуларните капиляри (Фигура 1G). В нашата предишна работа [23] ние демонстрирахме, че основните характеристики на I/R увреждането са апоптоза на тубулни епителни клетки и набиране на инфилтриращи възпалителни клетки като моноцити, дендритни клетки и лимфоцити. Независимо от това, чрез рутинна хистологична оценка (допълнителна фигура 1), ние демонстрирахме, че 30 минути топла исхемия, последвана от 15 минути индуцирано от реперфузия ранно тубулно интерстициално увреждане, характеризиращо се с по-голяма капилярна конгестия и фокална цитоплазмена вакуолизация на епитела на бъбречните тубули, в сравнение с базалния състояние.

За по-нататъшно характеризиране на клетъчната локализация на отлагания на PTX3 и оценка на неговия потенциален ефект при модулирането на възпалителния отговор и нараняване, ние извършихме двойно имунооцветяване и конфокален микроскопски анализ. Експресията на PTX3 протеин се открива в по-голямата част от ЕК на перитубулни (Фигура 2А) и гломерулни (Фигура 2В) капилярни нива, 15 минути след реперфузия.

Добре известно е, че I/R увреждането се характеризира с повишено активиране на вродените и адаптивни имунни отговори, включително трафик на възпалителни клетки в болния орган, което допълнително изостря увреждането чрез имунните клетки и системата на комплемента [25]. В нашия модел на свинете, ние също наблюдавахме, вече 15 минути след реперфузия, плътен възпалителен инфилтрат, съставен предимно от макрофаги и дендритни клетки в тубулно-интерстициалната област. Открихме, че и двете тези антиген-представящи клетки се характеризират с повишена експресия на PTX3 в сравнение с T0, тъй като наблюдавахме увеличен брой CD163 плюс /PTX3 плюс (Фигура 2E, 2F, 2K) и SWC3a плюс /PTX3 плюс (Фигура 2G, 2H, 2L) клетки на тубулни интерстициални нива при Т15.

Експресията на PTX3 може да допринесе за EndMT при I/R нараняване

В предишни наблюдения ние демонстрирахме, че I/R нараняването е отговорно за EndMT [26, 27], характеризиращо се с придобиването на мезенхимален фенотип от EC със загуба на специфични ендотелни маркери и усилване на мезенхимни маркери, като специфични за фибробласти протеин 1 (FSP-1), невронален кадхерин (N-кадхерин) и алфа-гладкомускулен актин (алфа-SMA). По този начин ние изследвахме дали експресията на PTX3 от EC може да повлияе на този процес. Както се очакваше, когато изследвахме експресията на алфа-SMA, като маркери на активиран миофибробласт, не открихме никаква съвместна локализация между алфа-SMA и PTX3 (Фигура 2C, 2D). Напротив, наблюдавахме увеличение на тубулоинтерстициалния FSP1 плюс /PTX3 плюс миофибробласти през целия период на наблюдение (Фигура 2K–2M).

Отлаганията на PTX3 са свързани с активирането на системата на комплемента

И накрая, ние проучихме дали отлаганията на PTX3 са свързани с активирането на комплемента. Наистина, както при други компоненти от семейството на пентраксин, PTX3 може да регулира активирането на класическия път на комплемента [7]. За да се определи връзката между PTX3 и активирането на комплемента, ние извършихме имунофлуоресценция с двоен етикет, за да оценим експресията на PTX3 и терминала Комплекс на комплемента, C5b-9, използващ антитяло, насочено срещу C9-неоепитоп. Наблюдавахме значителна съвместна локализация на PTX3 и C5b-9 отлагания (Фигура 3A, 3B). Терминалният комплекс на комплемента е локализиран на перитубуларно ниво, както и в перитубуларните капиляри заедно с ендотелния клетъчен слой, както показахме по-рано [23, 28]. Тъй като PTX3 може да активира системата на комплемента чрез класическия и лектиновия път, ние оценихме отлагането на C1q и MBL в бъбречния паренхим. Интересно е, че C1q (Фигура 3E, 3F) и MBL (Фигура 3C, 3D) отлагания са открити главно на интерстициално и капилярно ниво (Фигура 3C до 3F), както е описано по-рано [23] и са колокализирани с PTX3 отлагания.

C{0}}инхибиторът пречи на свързването на PTX3 към ендотелните клетки

В предишната ни работа [23] демонстрирахме, че прилагането на C1-инхибитор води до значително намаляване на отлагането на комплемента, с намалено набиране на инфилтриращи възпалителни клетки и тубулоинтерстициално увреждане. Следователно, ние изследвахме нивото на експресия на PTX3 в животни, третирани с rhC1-INH. Установихме, че вливането на C1-инхибитор намалява отлаганията на PTX3 в перитубулните капиляри и интерстициално ниво след 15 минути след реперфузия (Фигура 4А).

Освен това, за да подкрепим хипотезата, че намаляването на отлаганията на PTX3 в животни, третирани с rhC1-INH, е свързано с инхибирането на ендотелно увреждане, ние проведохме експерименти in vitro и оценихме свързването на rhC1-INH и PTX3 върху култивиран ЕК при нормални условия или в присъствието на клетъчен стрес (Фигура 4В). FACS анализът показа, че EC при нормални условия не свързва rhC1-INH и PTX3. В съответствие с нашето предишно проучване [26], ние наблюдавахме повишено клетъчно свързване на rhC1-INH върху H2O2-стимулиран EC в сравнение с базалните условия. Освен това, в отсъствието на rhC1-INH, PTX3 може да свърже активиран EC. Интересно е, че когато H2O2-активиран EC беше инкубиран с PTX3 и rhC1-INH, наблюдавахме, че C1INH успя да защити EC при блокиране на свързването на PTX3.

ДИСКУСИЯ

В това проучване ние демонстрирахме отлагане на PTX3 в ранната фаза на бъбречно I/R увреждане и неговия възможен принос за развитието на EndMT. Интересното е, че открихме, че медиираното от PTX3- активиране на комплемента се случва главно на васкуларно ниво, локализирайки се съвместно с C1q и MBL, молекулите за разпознаване на класическите и лектинови пътища на каскадата на комплемента.

I/R нараняването предизвиква подчертан възпалителен отговор, характеризиращ се с активиране на комплемента, свободни от кислород радикали и производство на провъзпалителни цитокини, което води до активиране на съдов ендотел и периферни левкоцити [29, 30]. По време на I/R нараняване, активирането на комплемента води до отлагане на компоненти на комплемента върху повърхностната мембрана на увредена и дисфункционална ЕК, с едновременно генериране на анафилатоксини и усилване на възпалителния процес [31]. По време на възпаление, PTX3 нараства бързо и може да играе централна роля в модулирането на ендотелния отговор. Наистина, PTX3 е посочен като потенциален биомаркер за съдова ендотелна дисфункция при няколко заболявания, включително хроничнибъбрекзаболяване, прееклампсия и няколко съдови заболявания [7, 16, 17, 32]. Ние също така показахме, че PTX3 участва в други съдови усложнения като неуспех на артериовенозна фистула при пациенти на хемодиализа [33]. Тези наблюдения предполагат, че PTX3 може да бъде мост между възпалителния отговор и ендотелната дисфункция [34]. В съответствие с тези проучвания, ние наблюдавахме отлагания на PTX3 на ендотелно ниво вече след 15 минути след реперфузия (Фигура 2A, 2B). Нашите резултати също показаха, че в ранната фаза на I/R нараняване, PTX3 се колокализира с миофибробластен маркер, FSP-1 (Фигура 2I, 2J), но не и с алфа-SMA, маркер, експресиран от активиран миофибробласт (Фигура 2C, 2D). Взети заедно, тези данни биха могли да предполагат, че ендотелната дисфункция и процесът EndMT [35], наблюдавани при I/R животни [26], се появяват за първи път при EC, експресиращ PTX3.

Връзката между PTX3 и възпалителните клетки е широко призната. В тази статия ние специално се фокусирахме върху присъщите ефекти на PTX3 в интерстициалната инфилтрация на левкоцитите, които са основен източник на PTX3 [36]. По-специално, открихме макрофаги и дендритни клетки, след 15 минути след реперфузия, експресиращи по-високи нива на PTX3 (Фигура 2E до 2H). Тези данни са в съгласие с увеличаващия се набор от доказателства, предполагащи важна роля на вродения имунитет при посредничеството на ранно увреждане при I/R нараняване [23]. Ранното активиране на комплемента в бъбречната тъкан след I/R увреждане води до генериране на няколко възпалителни медиатора, които увеличават набирането на имунни клетки [21, 23, 37, 38]. Последните проучвания идентифицираха PTX3 като един от основните компоненти на мрежата, която организира възпалителния отговор, предизвикан от I/R нараняване [39]. В различни експериментални модели на I/R нараняване, PTX3 може да упражнява двойни противоположни роли върху специфични тъкани [40, 41]. Ранното производство на PTX3 е свързано с бъбречно увреждане, тъй като индуцира ранна експресия на ендотелни адхезионни молекули и хемокини, които ускоряват локалния дезадаптивен възпалителен отговор.

Напротив, продължителното локално производство на PTX3 предотвратява прекомерно възпаление и дисфункция на органи [41].

PTX3 е каскаден модулатор на комплемента [9, 42]; това е в съгласие с плейотропните свойства на PTX3, което показва двойна роля на PTX3 като модулатор или усилвател на вродения имунен отговор [39]. Първоначално PTX3 активира комплемента чрез свързване на C1q и MBL [43]; обаче ранното повишено възпаление трябва да бъде ограничено до целевата област. Следователно, PTX3, чрез набиране на фактор Н или инхибиране на ангиогенезата, може също да намали възпалителния отговор и активирането на комплемента, запазвайки бъбречния паренхим от възпалително увреждане [43]. Въпреки че активирането на комплемента в I/R при гризачи е локализирано главно на тубулно ниво [44], по време на фазата на реперфузия, ендотелиумът е основната цел на различни провъзпалителни агенти, включително медиатори на комплемента [2]. По-рано демонстрирахме, че при свинския модел на I/R увреждане, както и при пациенти с DGF, активирането на системата на комплемента се случва в ранната фаза, върху перитубулните капиляри, в интерстициума и върху гломерулния ендотел [23]. Нашите данни показват ясна съвместна локализация на C5b-9 отлагания върху PTX3 плюс EC след 15 минути след реперфузия (Фигура 3A, 3B). Следователно бъбречният ендотелиум изглежда е преобладаващото място на PTX3-медиирано активиране на комплемента в ранната фаза на I/R увреждане както в предклинични, така и в клинични условия.

Взаимодействието на пентраксините с C1q и неговата роля в активирането на класическия път на комплемента са добре описани [45–47]. В контекста на вродените имунни отговори, PTX3 може да свързва различни компоненти на комплемента и да модулира активирането на комплемента [43, 48]. PTX3 активира комплемента чрез свързване на C1q [49]. Нашите резултати в животинския модел ясно показаха, че PTX3 може да медиира активирането на класически път чрез взаимодействие с C1q (Фигура 3E, 3F). Освен това, PTX3 също така модулира лектиновия път на комплемента, както е показано на фигура 3C, 3D. MBL свързва PTX3 чрез своя колаген-подобен домейн [45] и MBL/PTX3 комплексите набират C1q и предизвикват отлагане на C3 и C4 върху повърхностите на целевите клетки.

Като цяло, тези резултати предполагат централната роля на PTX3 в посредничествотобъбрекувреждане при I/R нараняване, което може да има важни последици за насочени към комплемента терапии при бъбречно I/R увреждане.

В нашето предишно проучване [26] изследвахме участието на комплемента в медиирането на EC активирането чрез използване на рекомбинантна форма на C1-INH, мощен инхибитор на протеази на класическия и лектин комплементния път (C1r, C1 s, и MASP2). В същия животински модел ние показахме (Фигура 4А), че терапевтичното инхибиране на двата пътя от rhC1INH намалява отлаганията на PTX3 в перитубулните капиляри и интерстициално ниво след 15 минути след реперфузия. Тези данни, потвърдени с in vitro резултати за EC (Фигура 4B), ни накараха да предположим, че rhC1INH може да защити увредения EC при блокиране на свързването на PTX3. В литературата има доказателства за свързването на C1-INH с ендотелни адхезионни молекули, експресирани върху активиран ендотел, наречени селектини, по-специално P и E-селектини [50, 51]. Това свързване с EC може да попречи на взаимодействието ендотел-левкоцит по време на възпаление и представлява друг важен противовъзпалителен механизъм [50, 51]. Следователно, ние предположихме, че rh-C1INH може да свърже активиран EC и медиира локалната регулация на активирането на комплемента и възпалителния процес. В нашите предишни проучвания ние демонстрирахме участието на комплемента в I/R увреждане и други имуномедиирани бъбречни заболявания [38, 52–54]. Механизмите на активиране на комплемента в този животински модел могат да имат важни последици за тълкуването на данните, очаквани в човешката среда. За успешното разработване на терапевтични интервенции, насочени към активиране на комплемента [36, 54], от съществено значение е да се установи валидността на данните за свине по отношение на това, което се случва в клинични обстоятелства. Тъй като това изследване е ограничено до обсервационни проучвания, са необходими допълнителни експерименти за очертаване на взаимосвързаните механизми между PTX3 и комплемента, които биха могли да подчертаят нови терапевтични стратегии. От резултатите по-горе, нашите данни подкрепят хипотезата, че PTX3 може да регулира множество аспекти на комплемент-медиирано I/R увреждане, като по този начин представлява потенциална терапевтична цел.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Модел на прасе с бъбречно I/R увреждане

Животинският модел на бъбречно I/R увреждане е разработен, както е описано по-горе [23]. След одобрение от комисията по етика към Министерството на здравеопазването, 4-месечни женски големи бели прасета (n=8, n=4 за група, 20 kg) бяха подложени на експериментална отворена хирургична процедура под обща анестезия. Животните са гладували 24 часа преди въвеждането в анестезия. Електрокардиограмата, сърдечната честота, насищането на хемоглобина с кислород, респираторният газов състав, дихателната честота, дихателният обем, налягането в дихателните пътища, систолното артериално кръвно налягане и централното венозно налягане бяха непрекъснато наблюдавани и записвани автоматично (Ohmeda Modulus CD; DatexOhmeda, Хелзинки, Финландия) . Лявата бъбречна артерия и вена бяха изолирани и съдова примка беше позиционирана около бъбречната артерия със скоба под прав ъгъл. Извършена е бъбречна биопсия преди исхемия (T0). След това се индуцира исхемичната фаза (30 минути) чрез издърпване на примката на съда. След това бяха извършени множество биопсии на 15, 30 и 60 минути след реперфузия; животните бяха умъртвени 24 часа след хирургическата процедура. Част от всеки биопсичен образец незабавно се замразява бързо в среда с оптимална температура на рязане (Tissuetek, Питсбърг, Пенсилвания) и се съхранява в течен азот. Друга част се фиксира в буфериран формалин (4 процента) в продължение на 12 часа и се поставя в парафин, като се използват стандартни процедури.

Микроскопско изследване

Вградени в парафин бъбречни проби от бъбречни биопсии бяха използвани за конвенционално хистологично оцветяване (H&E, периодична киселина-Schiff). Изображенията са получени от устройство Aperio ScanScope CS2 (Aperio Technologies, Vista, Калифорния, САЩ). Тубулно-интерстициални и гломерулни лезии бяха оценени с помощта на качествен анализ от двама наблюдатели (CD, MR), които не знаеха за произхода

Антитела

Първичните антитела, използвани в това изследване, разпознаха следните антигени: PTX3 (MNB4: директен срещу PTX3 N-терминален домен, Exira Life Sciences In., Larsen, Швейцария); CD163 (моноцити/макрофаги, US Biological, Swampscott, MA); SWC3a (дендритни клетки, [55] 74-22-15A, BD Biosciences); FSP1 (фибробластен специфичен протеин 1, Abcam, Cambridge, UK); алфа-гладкомускулен актин (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Santa Cruz, CA, USA); C1q (R9/2, AbDSerotec; Kidlington, Обединено кралство); MBL (3E7: директно срещу домейн за разпознаване на въглехидрати MBL, Hycult biotechnology, Uden, Холандия) и C9 неоантиген (aE11, Hycult biotechnology). Кръстосаната реактивност беше потвърдена чрез предварително инкубиране на специфичните антитела, преди тяхното използване, с човешки пептиди, използвани за отглеждането им. Предварителната инкубация премахва специфичното оцветяване на свинската тъкан.

Тъканна имунофлуоресценция и конфокална лазерна сканираща микроскопия

Характеризирането и локализирането на PTX3 сигнала бяха изследвани върху замразена тъкан, включена в OCT среда (Tissue-Tek). Слайдовете се инкубират с 5 процента заешки серум за 1 час при 37 градуса С. След това слайдовете се инкубират за 1 час при стайна температура със специфични антитела. След три промивания в PBS, предметните стъкла се инкубират с подходящите вторични антитела (Alexa Flour 488 и 555, Molecular Probes, Eugene, OR). Всички срезове бяха насрещно оцветени с TO-PRO-3 (Molecular Probes). Отрицателните контроли бяха приготвени с неподходящи антитела. Секциите бяха анализирани с помощта на Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Германия) конфокален лазерно сканиращ микроскоп. Броят на инфилтриращите клетки беше измерен в най-малко 10 полета с висока мощност (x630)/секция от двама независими наблюдатели, заслепени за произхода на слайдовете. Окончателните преброявания бяха средните стойности на двете мерки. В никакъв случай променливостта между наблюдателите не е била по-висока от 20 процента.

Клетъчна култура и анализ на поточна цитометрия

Човешки ендотелни клетки от пъпна вена (HUVEC, EC) бяха закупени от American Type Culture Collection (ATCC-LGC Standards, Sesto San Giovanni, Италия). EC се отглежда в препоръчаната от тях среда, EndoGro (Merck Millipore, Дармщат, Германия). EC се посява при плътност от 1{{10}},000клетки/cm2 и се стимулира с третиране с H2O2 (3 процента, 1 час). След това базалната и стимулираната EC се промиват два пъти с PBS и се отстраняват с PBS-EDTA 2mM и трипсин 0.001×. След това клетките се ресуспендират в PBS и се инкубират съответно с PTX3 (рекомбинантен човешки PTX3, Sigma-Aldrich, Merck, Германия) (1ug/ml) или/и с rhC1-INH (Ruconest®, Pharming) (2,5ug /ml) за 60 минути. След промиване три пъти с PBS 1X, клетките се ресуспендират в буфер за поточна цитометрия (FACS) (буфериран с фосфат физиологичен разтвор, рН 7,2, 0,2 процента говежди серумен албумин и 0,02 процента натриев азид) и се инкубират с FCR блокиращ реагент (Miltenyi Biotec) за 10 минути при стайна температура. След блокиране, ECs се инкубират със заешки анти-човешки C1-INH (осигурен от проф. M. Daha, Университет на Лайден, 1/100 разреждане) или/и с плъши анти-PTX3 (MNB4, Exira Life Sciences In., 1/20 разреждане) при стайна температура за 30 минути и се промива с FACS буфер. След това клетките се инкубират с кози анти-заешки IgG PE (Молекулярни сонди, 1/100 разреждане) или/с анти-плъши IgG FITC (Молекулярни сонди, 1/100 разреждане) при стайна температура за 30 минути и се промиват три пъти. Клетките бяха анализирани с FC500 (Beckman Coulter, Brea, Калифорния, САЩ) и софтуер Kaluza. Областта на положителност беше определена чрез използване на изотипно съвпадащо mAb и бяха получени общо 104 събития за всяка проба. Проведени са три независими експеримента.

Статистически анализ

Данните са представени като средно ± стандартно отклонение (SD) и са сравнени с помощта на анализ на дисперсията или сдвоен t-тест на Student, според случая. Разликите се считат за статистически значими, когато стойностите на p са по-малки от 0.05. Данните бяха анализирани с помощта на софтуерния пакет Statview (5.0 версия) (SAS Inc. Co., Cary, NC, USA). Графиките бяха показани с помощта на GraphPad Prism Software 5.

Съкращения

I/R: исхемия/реперфузия; EC: ендотелни клетки; PTX3: пентраксин 3; FSP-1: фибробласт-специфичен протеин 1; N-кадхерин: невронален кадхерин; алфа-SMA: алфа-гладкомускулен актин.

АВТОРСКИ ПРИНОС

CD координира проучването, участва в имуномаркиране и конфокална микроскопия на бъбречни участъци и състави ръкописа. AS и RF участваха в дизайна на изследването, допринесоха за анализа на данните, извършиха in vitro експерименти и критично ревизираха ръкописа. MR и GSN извършиха хистопатологичен анализ на изображението. LL, FS, AMC извършиха животински модел на исхемично-реперфузионно увреждане и помогнаха за преразглеждането на ръкописа. GL, PD и MB извършиха всички хирургични процедури върху модела на прасе и помогнаха за преразглеждането на ръкописа. MRD, P.vdP., C.vK. и FS ревизираха ръкописа.

PP, ER, GG, GS и LG критично ревизират ръкописа. GC предостави нови аналитични инструменти, проектира и контролира изследването. CD, AS и RF еднакво допринесоха за това проучване. Всички автори допринесоха за статията и одобриха изпратената версия.

БЛАГОДАРНОСТИ

Благодарим на Клаудия Курчи от Отделението по бъбречна, диализа и трансплантация, Отдел за спешна помощ и трансплантация на органи,

Университета в Бари за отличната техническа помощ.

КОНФЛИКТ НА ИНТЕРЕСИ

Авторите декларират, че нямат конфликт на интереси.

ФИНАНСИРАНЕ

Това проучване е подкрепено от университета в Бари „Алдо Моро“, италианското Министерство на здравеопазването (GR 2016- 02362239 „Подход, базиран на транскриптомиката за идентифициране на предсказващи фактори и терапевтични цели за забавена функция на присадката прибъбрекреципиенти на трансплантация“, Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD получи стипендия по този проект) и Fondo Sociale Europeo, Azione I.2 „Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori“- AIM-1810057-дейност 2, предоставена на AS

ПРЕПРАТКИ

1. Bonventre JV, Yang L. Клетъчна патофизиология на остра исхемична болестбъбрекнараняване. J Clin Invest. 2011 г.; 121: 4210-21.

2. Jang HR, Rabb H. Вроденият имунен отговор при остра исхемиябъбрекнараняване. Clin Immunol. 2009 г.; 130:41–50.

3. Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Допълнение: ключова система за имунен надзор и хомеостаза. Nat Immunol. 2010 г.; 11:785-97.

4. Търман Дж.М., Холърс В.М. Централната роля на алтернативния път на комплемента при човешкото заболяване. J Immunol. 2006 г.; 176:1305-10. PMID: 16424154

5. Franzin R, Stasi A, Fiorentino M, Stallone G, Cantaluppi V, Gesualdo L, Castellano G. Inflammaging and Complement System: A Link Between AcuteБъбрекНараняване и хронично увреждане на присадката. Преден имунол.

2020 г.; 11:734.PMID:32457738

6. Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A. Пентраксини във вродения имунитет: уроци от PTX3. Cell Tissue Res. 2011 г.; 343: 237–49. PMID: 20683616

7. Cieślik P, Hrycek A. Long pentraxin 3 (PTX3) в светлината на неговата структура, механизъм на действие и клинични последици. Автоимунитет. 2012 г.; 45: 119–28.PMID: 21988562

8. Kunes P, Holubcova Z, Kolackova M, Krejsek J. Pentraxin 3(PTX 3): ендогенен модулатор на възпалителния отговор. Медиатори на възпаление. 2012 г.; 2012:920517.PMID:22577258

9. Garlanda C, Bottazzi B, Bastone A, Mantovani A. Пентраксини на кръстопътя между вродения имунитет, възпалението, отлагането на матрицата и женската плодовитост. Annu Rev Immunol. 2005 г.; 23:337–66.115756PMID:15771574

10. Bottazzi B, Garlanda C, Cotena A, Moalli F, Jaillon S, Deban L, Mantovani A. Дългият пентраксин PTX3 като прототипен рецептор за разпознаване на хуморални модели: взаимодействие с клетъчния вроден имунитет. Immunol Rev. 2009; 227:9–18.PMID:19120471

11. Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. Синергията между фиколин-2 и пентраксин 3 повишава вроденото имунно разпознаване и отлагането на комплемента. J Biol Chem. 2009 г.; 284:28263–75.PMID:19632990

12. Netti GS, Lucarelli G, Spadaccino F, Castellano G, Gigante M, Divella C, Rocchetti MT, Rascio F, Mancini V, Stallone G, Carrieri G, Gesualdo L, Battaglia M, Ranieri E. PTX3 модулира имунофлогозата в тумора микросреда и е прогностичен фактор за пациенти с ясноклетъчен бъбречноклетъчен карцином. Стареене (Albany NY). 2020 г.; 12: 7585-602.PMID: 32345771

13. Souza DG, Amaral FA, Fagundes CT, Coelho FM, Arantes RM, Sousa LP, Matzuk MM, Garlanda C, Mantovani A, Dias AA, Teixeira MM. Дългият пентраксин PTX3 е от решаващо значение за възпалението на тъканите след

чревна исхемия и реперфузия при мишки. Am J Pathol. 2009 г.; 174:1309–18.PMID:19286566

14. Jaillon S, Peri G, Delneste Y, Frémaux I, Doni A, Moalli F, Garlanda C, Romani L, Gascan H, Bellocchio S, Bozza S, Cassatella MA, Jeannin P, Mantovani A. Хуморалният рецептор за разпознаване на образи PTX3 се съхранява в неутрофилни гранули и се локализира в извънклетъчни капани. J Exp Med. 2007 г.; 204: 793-804. PMID: 17389238

15. Tong M, Carrero JJ, Qureshi AR, Anderstam B, Heimbürger O, Bárány P, Axelsson J, Alvestrand A, Stenvinkel P, Lindholm B, Suliman ME. Плазмен пентраксин 3 при пациенти с хроничнибъбрекзаболяване: асоциации с бъбречна функция, протеинова енергия, изтощение, сърдечно-съдови заболявания и смъртност. Clin J Am Soc Nephrol. 2007 г.; 2:889–97.PMID:17702732

16. Witasp A, Rydén M, Carrero JJ, Qureshi AR, Nordfors L, Näslund E, Hammarqvist F, Arefin S, Kublickiene K, Stenvinkel P. Повишени циркулиращи нива и тъканна експресия на пентраксин 3 при уремия: отражение на ендотелна дисфункция. PLoS One. 2013; 8: e63493.PMID:23658833

17. Presta M, Camozzi M, Salvatori G, Rusnati M. Роля на разтворимия рецептор за разпознаване на образи PTX3 в съдовата биология. J Cell Mol Med. 2007 г.; 11:723–38.PMID:17760835

18. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, Barbagallo M, Magrini E, Garlanda C, Mantovani A. Пентраксините PTX3 и SAP във вроден имунитет, регулиране на възпалението и тъканно ремоделиране. J Hepatol. 2016 г.; 64:1416-27.

19. Xiao Y, Yang N, Zhang Q, Wang Y, Yang S, Liu Z. Пентраксин 3 инхибира индуцираната от остро бъбречно увреждане интерстициална фиброза чрез потискане на пътя на IL-6/Stat3. Възпаление. 2014 г.; 37: 1895-901.PMID: 24854162

20. Inforzato A, Reading PC, Barbati E, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A. „Сладката“ страна на дългия пентраксин: как гликозилирането засяга функциите на PTX3 при вроден имунитет и възпаление. Преден имунол. 2013; 3:407. PMID: 23316195