Флоретинът потиска невровъзпалението чрез медиирано от автофагия Nrf2 активиране в макрофаги

Контакт:tina.xiang@wecistanche.com

Резюме

Заден план: Макрофагите играят двойна роля при невровъзпалителни заболявания като множествена склероза (МС). Те участват в появата и прогресията на лезията, но могат също така да насърчат разрешаването навъзпалениеи възстановяване на увредена тъкан. В това проучване ние проучваме дали и какфлоретин, флавоноид, изобилно присъстващ в ябълките и ягодите, намалява възпалителния фенотип на макрофагите и потисканевровъзпаление.

Методи: Транскрипционните промени в макрофагите, получени от костен мозък на мишка при експозиция на флоретин бяха оценени чрез групово секвениране на РНК. Подлежащите пътища, свързани с възпалението, реакцията на оксидативен стрес и аутофагията, бяха валидирани чрез количествена PCR, флуоресцентни и абсорбционни анализи, нокаут мишки с ядрен фактор еритроиден 2-фактор 2 (Nrf2), Western blot и имунофлуоресценция. Експерименталният модел на автоимунен енцефаломиелит (EAE) беше използван за изследване на въздействието на флоретин върху невровъзпалението in vivo и потвърждаване на основните механизми.

Резултати: Ние показваме, че флоретинът намалява възпалителния фенотип на макрофагите и значително потиска невровъзпалението при EAE. Флоретинът медиира своя ефект чрез активиране на Nr2 сигналния път. Активирането на Nrf2 се дължи на 5'AMP-активирана протеин киназа (AMPK)-зависима активация на аутофагия и последващо kelch-подобно ECH-свързано разграждане на протеин 1 (Keap1).

Заключения: Това проучване отваря бъдещи перспективи за флоретин като терапевтична стратегия за невровъзпалителни разстройства като МС.

Пробна регистрация: Не е приложимо.

Ключови думи: флоретин, макрофаги, невровъзпаление, множествена склероза, автоимунитет

Щракнете тук, за да научите повече информация

Заден план

Лезиите на активната множествена склероза (МС) се характеризират с наличието на множествомакрофаги[1-5]. Ранните проучвания показват, че макрофагите приемат провъзпалителен фенотип в MS лезии, като по този начин насърчаватневровъзпаление, демиелинизация и невродегенерация. Ефекторните функции, стимулиращи заболяването, включват представянето на антигени, получени от централната нервна система (ЦНС), на автореактивни Т клетки и производството на възпалителни медиатори като провъзпалителни цитокини, реактивни кислородни видове (ROS) и азотен оксид (NO) [ 6,7]. Съвсем наскоро беше установено, че макрофагите също имат полезни функции при MS лезии, тъй като те могат да променят своя фенотип до такъв, който обикновено се свързва с имуносупресия и възстановяване на ЦНС. Този защитен фенотип се характеризира с намалено производство на провъзпалителни медиатори, производство на противовъзпалителни медиатори и растежни фактори и активиране на антиоксидантни пътища като еритроидния 2-свързан с ядрения фактор фактор 2 (Nrf2) път [8-14]. Тъй като възпалителният статус на макрофагите е свързан с прогресията на МС и развитието на хронични активни лезии, насочването на макрофагите към благоприятен фенотип се счита за обещаваща стратегия за ограничаване на прогресията на МС [15].

Диетичните компоненти стимулират функцията на макрофагите и невровъзпалението [16]. По-специално, семейството на флавоноидите все повече се признава, че съдържа обещаващи съединения, които влияят на патогенните пътища и модулират фенотипа на имунните клетки като макрофаги [17,18]. Флавоноидите образуват едно от най-големите семейства фитонутриенти, които съдържат над 8000 фенолни съединения с разнообразна биоактивност. Няколко членове на семейството на флавоноидите показват противовъзпалителни и антиоксидантни ефекти върху макрофагите [19-21]. Флавоноидът флоретин е член на дихидрохалконите и присъства в често консумираните плодове като ябълки и ягоди. Известно е, че флоретинът проявява имуномодулиращи свойства и се използва широко за грижа за кожата поради антиоксидантните си характеристики [22-24]. Освен това, флоретинът е инхибитор на глюкозен транспортер (GLUT), характеристика, която засяга фенотипа на макрофагите, тъй като активирането на макрофагите се подхранва от GLUT [25, 26]. Като цяло, тези характеристики правят флоретин обещаващо съединение за модулиране на фенотипа на макрофагите и невровъзпалението. В това проучване ние показваме, че флоретинът задвижва макрофагите към по-малко възпалителен фенотип и облекчава невровъзпалението в експерименталния модел на автоимунен енцефаломиелит (EAE). Секвенирането на РНК и функционалните експерименти идентифицираха пътя на Nrf2 като център и двигател на този защитен макрофагов фенотип, индуциран от флоретин. AMPK-зависимото активиране на машината за автофагия и последващото SQSTMl/p62-медиирано (наричано по-долу p62) разграждане на Keapl, адаптер, който улеснява протеазомното разграждане на Nrf2, е установено, че е в основата на активирането на Nrf2 в макрофагите. Тези открития показват, че флоретинът има потенциал да се използва в терапевтични стратегии за невровъзпалителни разстройства.

Методи

Антитела и химични реактиви

Флоретин(Sigma Aldrich) се разтваря в 50 mM KOH до 15 mM изходен разтвор и се съхранява при -20 градуса. Бяха направени допълнителни разреждания в среда RPMI1640 (Gibco). За лечение in vivo флоретинът се разтваря в 1 N NaOH, след което рН се регулира отново до 7,2 с 1 N HCL и разтворът се разрежда допълнително във физиологична вода, за да се получи концентрация от 50 mg/kg. BML-275（1 μM, Santa Cruz Biotechnology）бе добавен 1 час преди третиране с флоретин, за да инхибира активирането на AMPK. Бафиломицин А1（BAF, 0,1 μM, InvivoGen） се добавя 2 часа преди събирането, за да се блокира сливането на автофагозоми и лизозоми. Липополизахарид (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) се използва за стимулиране на клетки за възпалително фенотипиране. Форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) се използва за индуциране на производството на ROS. Следните антитела бяха използвани за Western blot: миши анти- -актин (1:10,000;sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), миши анти-GAPDH (1:{{29 }};AB_2537659, Invitrogen), заешки анти-AMPK (1:1000;5831S, технология за клетъчно сигнализиране), заешки анти-фосфорилиран AMPK (1:1000; 2535S, технология за клетъчно сигнализиране), заешки анти-LC3 (1:1000; L7543, Sigma-Aldrich), заешко анти-p62 (1:1000; 23214, технология за клетъчно сигнализиране). Следните антитела бяха използвани за имунофлуоресценция: плъши анти-CD3 (1:150; MCA500G, Bio-Rad), плъши анти-F4/80 (1:100; MCA497G, Bio-Rad), заешки анти-LC3 (1:1000) ;L7543, Sigma-Aldrich), заешки анти-p62 (1:500;23214, Cell Signaling Technology), заешки анти-Keap1(1:500;60027-1-Ig, Proteintech Europa), заешки анти-TMEM119(1 :100, ab209064, Abcam). Подходящи вторични антитела са закупени от Invitrogen.

мишки

Див тип (WT) C57BL/6JOlaHsd мишки бяха закупени от Envigo. Животните са били хранени с редовна диета и са били настанени в съоръжението за животни на Института за биомедицински изследвания на университета Хаселт. Всички експерименти са извършени в съответствие с институционалните указания и са одобрени от етичната комисия за експерименти с животни на университета Хаселт.

Клетъчна култура

Произведен от костен мозъкмакрофаги(BMDMs) бяха изолирани от WT и Nrf2 нокаутирани (KO) C57BL/6JOlaHsd мишки, закупени от Envigo и предоставени от RIEN BRC съгласно MTA съответно на проф. S. Kerdine-Römer [27,28]. BMDM бяха получени, както е описано по-рано [29]. В къс тибиален и феморален костен мозък клетки от 12-седмични WT и Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd мишки бяха култивирани в 10-cm петриеви плаки при концентрация от 10×106 клетки/ плака, в среда RPMI1640, допълнена с 10 процента фетален телешки серум (FCS, Gibco), 50 U/ml пеницилин (Invitro-gen), 50 U/ml стрептомицини (Invitrogen) и 15 процента L929-кондиционирана среда (LCM ). След диференциация BMDMs се отделят при 37 градуса с 10 mM EDTA в PBS (Gibco) и се култивират (0,5 × 10 градуса клетки/ml) в RPM1640, допълнен с 10 процента FCS, 50U/ml пеницилин, 50U/ml стрептомицин и 5 процента LCM ( 37 градуса C, 5 процента CO2). Микроглиалните култури бяха изолирани от мозъци на постнатални P1-3 C57BL/6/OlaHsd малки. След като мозъчният ствол, хороидният сплит и менингите бяха отстранени, мозъците бяха механично дисоциирани и ензимно усвоени за 15 минути с 1 × трипсин (Gibco) при 37 градуса. След това клетъчната суспензия се посява в DMEM среда с високо съдържание на глюкоза (Sigma), допълнена с 30 процента LCM, 10 процента FCS, 50U/ml пеницилин и 50U/ml стрептомицин в Т75 колби за култура. Два до 3 дни по-късно беше извършена пълна смяна на средата. Смесени глиални култури се разклащат (230rpm, 3h, 37 градуса) след 6-7 дни, за да се получат чисти микроглиални култури.

Секвениране на РНК

Клетките бяха предварително третирани с флоретин (50 μM) за 20 часа и LPS-стимулирани (100 ng/ml) за 6 часа. Клетъчният лизис се извършва с помощта на реагент Qiazol Lysis (Qiagen). РНК се екстрахира от клетки с помощта на RNeasy mini kit (Qiagen). След това пробите бяха обработени от Genomics Core Leuven (Белгия). Подготовката на библиотеката беше извършена с комплекта QuantSeq на Lexogen за генериране на съвместими с Illumina библиотеки. Библиотеките бяха секвенирани на системата за секвениране Illumina HiSeq4000. Подравняването в съответствие със снаждането беше извършено със STAR v2.6.1b[30]. Количественото определяне на показанията за ген се извършва с HT-seq Count v2.7.14. Базиран на броене диференциален експресионен анализ беше извършен с R-базиран (The R Foundation for Statistical Computing, Виена, Австрия) Bioconductor пакет DESeq2. Списък от диференциално експресирани гени беше избран в ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

Количествена PCR с обратна транскрипция

Клетките бяха предварително третирани с флоретин（50 μM） за 20 часа и LPS стимулирани (100 ng/ml) за 6 часа. Лизисът се извършва с помощта на Qiazol Lysis реагент (Qiagen). РНК се екстрахира с помощта на RNeasy mini kit (Qiagen). Концентрацията и качеството на РНК се определят с Nano-drop спектрофотометър (Isogen Life Science). Синтезът на cDNA се провежда с помощта на Quanta qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) според инструкциите на производителя. qPCR беше извършен на StepOne-Plus" PCR система в реално време (Applied Biosystems), използвайки SYBR зелена смес, съдържаща 1 × SYBR green (Applied Biosystems）, 0,3 μM праймери (Интегрирани ДНК технологии), 12,5 ng cDNA и вода без нуклеаза Сравнителният Ct метод беше използван за количествено определяне на генната експресия Данните бяха нормализирани към най-стабилните референтни гени циклин А и хипоксантин фосфорибозилтрансфераза 1. Праймерните последователности са налични при поискване.

Определяне на реактивни кислородни видове

Клетките се третират предварително с флоретин (50 uM) в продължение на 2 часа. След това клетките се стимулират с РМА (15 минути, 100 ng/ml) и производството на ROS се измерва с помощта на флуоресцентна сонда 2', 7'-дихлородихидрофлуоресцеин диацетат при 10 цМ в ​​PBS за 30 минути. Флуоресценцията беше измерена с помощта на флуоресцентен четец на микроплаки FLUOstar optima (BMG Labtech, Ortenberg, Германия) (възбуждане: 495 nm, емисия: 529 nm).

Измервания на азотен оксид

Клетките бяха предварително третирани с флоретин (50 μM) в продължение на 2 часа. След това клетките се стимулират с LPS (24 часа, 100 ng/ml). NO беше индиректно наблюдаван с помощта на комплекта за измерване на нитрит с реактив Griess (Abcam). Накратко, нитратът реагира със сулфаниламид и N-(1-нафтил)етилен-диамин дихидрохлорид, за да се получи розово азобагрило. След това абсорбцията на това азо производно се измерва при 540 nm с помощта на четец на микроплаки (iMark, Bio-Rad).

Western blot

Клетките бяха третирани с флоретин（5{{10}} μM） и LPS（100 ng/ml) за 1 час или 24 часа, за да се определи активирането на AMPK или съответно нивата на p62, LC3 и Keapl протеин. Клетките се лизират с помощта на RIPA-буфер (150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% натриев деоксихолат, 1% SDS, 50 mM Tris) и се разделят чрез електрофореза с натриев додецил сулфат с полиакриламиден гел. Геловете се прехвърлят към PVDF-мембрана (VWR) и блотовете се блокират за 1 час в 5 процента говежди серумен албумин в Tris-буфериран физиологичен разтвор, съдържащ 0,1 процента Tween-20(TBS-T). Мембраните се изследват с първични антитела за една нощ при 4°C, промиват се с TBS-T и се инкубират със съответното вторично белязано с пероксидаза от хрян антитяло за 1 час при стайна температура (RT). Имунореактивните сигнали се откриват с усилена хемилуминесценция (ECL Plus, Thermo Fisher), като се използва Amersham Imager 680 (GE Healthcare Life Sciences). Плътностите на лентите се определят с помощта на ImageJ.

Имунофлуоресценция

Криосекциите на гръбначния мозък се изсушават на въздух и се фиксират в леденостуден ацетон за 10 минути при - 20 градуса. Миши BMDM се култивират върху предметни стъкла и се фиксират в леденостуден метанол за 10 минути при -20 градуса. Секциите и BMDM бяха блокирани за 30 минути с помощта на Dako протеинов блок (Agi-lent). След това те бяха инкубирани за една нощ при 4°C с първични антитела, промити и инкубирани с подходящите вторични антитела за 1 час при стайна температура. Изображенията на тъканта на гръбначния мозък бяха направени с помощта на микроскоп Nikon Eclipse 80i (10× обектив) и NIS Софтуер Elements BR 3.10 (Nikon). Изображенията на BMDMs, оцветени за p62, LC3 и Keapl, са направени с помощта на конфокален микроскоп Zeiss LSM 880 и са коригирани чрез Airyscan (63 × обектив).P62-и LC3- положителните puncta бяха определени чрез полуавтоматизиран puncta анализ imageJ. Накратко, след като изображението беше направено двоично и клетките бяха избрани ръчно, puncta бяха анализирани за клетка. Колокализацията на P62 и Keapl беше извършена с помощта на конвейер за колокализация в софтуера CellProfiler [31 Изображенията, показани на фигурите, са цифрово подобрени.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, терапевтична настройка). Мишките се претеглят и оценяват всеки ден за неврологични признаци на заболяването съгласно ръководството за оценяване на EAE на мишка на производителя:0:няма клинични симптоми,0.5:върхът на опашката е отпуснат, 1:отпусната опашка , 1.5: отпусната опашка и инхибиране на задните крака 2: отпусната опашка и слабост на задните крака, 2.5: отпусната опашка и влачене на задните крака, 3: отпусната опашка и пълна парализа на задните крака, 3.5: отпусната опашка и пълна парализа на задните крака краката и мишката не могат да се изправят, когато са поставени настрани, 4: парализа на диафрагмата, 5: смърт от ЕАЕ.

Статистически анализ

GraphPad Prism беше използван за статистически анализ на данните, които са представени като средно±sem D'Agostino и Pear-son omnibus тест за нормалност беше използван за тестване за нормално разпределение. Двустранен несдвоен t-тест на Student (с корекцията на Welch, ако е необходимо) беше използван за нормално разпределени данни. Анализът на Mann-Whitney беше използван за данни, които не преминаха теста за нормалност.p-стойности<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Резултати

Транскрипционни промени, свързани с лечението с флоретин на макрофаги

За да се установят потенциални противовъзпалителни ефекти и да се идентифицират основните механизми на лечението с флоретин върху макрофаги, ние извършихме групово секвениране на РНК (допълнителна фигура 1). Анализът на пътя на активирани макрофаги, третирани с флоретин, показва, че диференциално експресираните гени са свръхпредставени в каноничните пътища, свързани свъзпаление, като iNOS(z-резултат:-2.449), подобен на такса рецептор (z-резултат:-2.236), интерфероново сигнализиране (z-резултат:- 2), и път на отговор на острата фаза (z-резултат: - 1.633) (Фиг. 1A, B). Подобно на анализа на каноничния път, анализът нагоре по веригата на данните от RNA-seq прогнозира, че флоретинът намалява активирането на ключови провъзпалителни регулатори на транскрипция като IRF7 (z-резултат: 2,229), IRF1 (z-резултат: -2). 025) и STAT1(z-резултат:-2.022)(фиг. 1D). В допълнение към понижаването на провъзпалителните пътища на макрофагите, анализът на RNA-seq на макрофаги, третирани с флоретин, показа, че наред с други пътища, флоретинът мощно активира пътя на Nrf2 (z-резултат: 1,897), доказано от регулирането нагоре на Nrf2-свързаните гени като mafG и прокси (фиг. 1A, C). Още повече, Nrf2(NFE2L2) е идентифициран като най-активирания транскрипционен регулатор нагоре по веригата (z-резултат: 2,801), а регулирането на нивата на ROS е идентифицирано като една от най-регулираните биологични функции в третирани с флоретин BMDMs (z-резултат: 2,008 ) (фиг. 1D, E). Като цяло откритията показват, че флоретинът активира Nrf2 и потиска възпалителния фенотип на макрофагите.

Пътят Nrf2 контролира фенотипа на третирани с флоретин макрофаги

След това потвърдихме противовъзпалителния ефект на флоретин и определихме дали той модулира възпалителния фенотип на макрофагите, като действа върху Nrf2. Намалени нива на ROS се наблюдават при третирани с флоретин WT BMDMs, стимулирани с PMA (фиг. 2A). Освен това, намалено производство на NO и нива на mRNA на провъзпалителни гени NOS2, I-6, COX2 и I-12 са наблюдавани в третирани с флоретин WT BMDMs, стимулирани с LPS (фиг. 2B, C). във връзка с решаващата роля на Nrf2 в индуцирането на по-малко възпалителен фенотип, нашите данни показват, че флоретинът активира Nrf2-отговорните гени HO1 и NQO1 в WT, но не и Nrf2 KO BMDMs, стимулирани с LPS (фиг. 2D). Освен това, лечението с флоретин намалява производството на ROS в WT, но не и в Nrf2 KO BMDM (фиг. 2E). Освен че контролира антиоксидантните реакции, се съобщава, че Nrf2 потиска възпалителния фенотип на макрофагите [12]. В подкрепа на последното, флоретинът не е в състояние да намали експресията на провъзпалителни гени NOS2, IL-6, COX2 , и IL-12 в активирани BMDMs с дефицит на Nrf2- (фиг. 2F). Като цяло, тези резултати показват, че Nrf2 задвижва медиираното от флоретин възпалително фенотипно изместване на макрофагите.

Флоретин насърчава активирането на AMPK

Флоретинът е добре дефиниран инхибитор на GLUT и последните проучвания подчертават значението на медиираното от GLUT усвояване на глюкоза за активирането на макрофагите [26,32]. Следователно, ние определихме дали флоретинът може да активира енергийния сензор AMPK, който се активира при ниски нива на енергия/глюкоза. Нашите резултати показват, че лечението с флоретин води до фосфорилиране и активиране на AMPK (фиг. 3A, B). Освен това, добавянето на AMPK инхибитора BML-275 до голяма степен предотвратява активирането на AMPK в BMDMs, третирани с флоретин (фиг. 3A, B). Нещо повече, нашите открития показват, че активирането на AMPK е от съществено значение за флоретин за потискане на производството на ROS, както е показано от по-високи нива на ROS в BMDMs, третирани както с флоретин, така и с AMPK инхибитор, в сравнение с BMDMs, третирани само с флоретин (фиг. 3C). Като цяло, нашите данни показват, че индуцираното от флоретин AMPK активиране е от решаващо значение за насочване на макрофагите към по-малко възпалителен фенотип.

Флоретинът стимулира автофагията по AMPK-зависим начин

Тъй като активирането на AMPK е свързано с активирането на катаболните процеси в отговор на лишаване от хранителни вещества [33], след това проучихме дали флоретинът може да активира автофагията. Аутофагията е запазен катаболитен процес, който се индуцира при гладуване и други реакции на стрес, което насърчава лизозомното разграждане на вътреклетъчния товар, изолиран във везикули, наречени автофагозоми. Анализът на RNA-seq прогнозира аутофагията като един от биологичните процеси надолу по веригата, показващ повишена активност в BMDMs, третирани с флоретин (z-резултат: 0.779) (Фиг. 4A). Освен това, имуноцитохимичният анализ на BMDMs, третирани с флоретин и инхибитора на аутофагията бафиломицин Al, показва повишено натрупване на маркерите за аутофагия MAP1LC3/LC3 (свързан с микротубулите протеин 1 лека верига 3) и p62 в сравнение с BMDMs, третирани с бафиломицин A1- (фиг. 4B-D), което показва повишен автофагичен поток при лечение с флоретин [34]. При индуциране на аутофагия, LC3 се превръща от формата LC3I в липидирана форма LC3I, която корелира с броя на автофагозомите. В съответствие с това, по-високи протеинови нива на LC3II и p62 бяха определени в стимулирани от флоретин BMDM чрез Western blot (фиг. 4E, F). Интересното е, че това увеличение на p62 и LC3II от флоретин е предотвратено чрез третиране на BMDM с AMPK инхибитора BML-275 (Фигура 4E-F). Като цяло нашите данни показват, че флоретинът стимулира аутофагията по AMPK-зависим начин.

Флоретин активира пътя на Nrf2 чрез медиирано от автофагия разграждане на Keap1

Нашите данни показват, че флоретинът активира Nrf2 и стимулира аутофагията в макрофагите. Интересното е, че рецепторът за автофагия p62 може да се конкурира с Nrf2 за свързване с Keapl, адаптерът, който улеснява убиквитинирането и разграждането на Nrf2 при нормални условия. Тази п62-медиирана дисоциация на Keap1/Nrf2 следователно ще предотврати разграждането на Nrf2 и в крайна сметка ще доведе до активиране на Nrf2 [35]. Поради тази причина ние определихме дали флоретинът насърчава взаимодействието p62 / Keapl, като по този начин активира Nrf2 пътя. Тук показваме, че флоретинът активира пътя на Nrf2 чрез p62-медиирано разграждане на Keapl в макрофагите. Чрез използване на конфокална микроскопия Airyscan с висока разделителна способност, комбинирана с анализ на колокализация, ние показваме, че флоретинът стимулира взаимодействието на p62 и Keapl, както се вижда от повишената стойност на параметъра на колокализация (коефициент на Pearson) в BMDM, третирани с флоретин (фиг. 5A). , B). Освен това, нашите открития показват, че по-ниски протеинови нива на Keapl присъстват в третирани с флоретин BMDMs, потвърждавайки разграждането на Keapl (фиг. 5C). За да потвърдим, че разграждането зависи от автофагията, добавихме инхибитора на аутофагията бафиломицин А1 към третирания с флоретин BMDMs. Интересно е, че това намаление на Keapl е обърнато чрез лечение с бафиломицин А1 (фиг. 5C). Тези резултати бяха потвърдени от Western blot, показвайки намаляване на нивата на Keapl протеин в третирани с флоретин BMDMs, което беше предотвратено от бафиломицин А1 (фиг. 5D, E).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), флоретинът намалява тежестта на заболяването (фиг. 6B). Намалената тежест на заболяването при животни, третирани с флоретин, е успоредна с намалена експресия на възпалителни гени MHCI,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 и CXCL2 в гръбначния мозък (фиг.6C). Освен това, намалено количество F4/80t клетки беше открито в гръбначния мозък на животни, третирани с флоретин (Фигура 6E, F). Тъй като макрофагите F4/80*микроглия и F4/80* допринасят за невровъзпалението, по-задълбочен анализ показва, че флоретин значително намалява количеството F480 плюс TMEMl19-

макрофаги в EAE мишки (допълнителна фигура 2 DF), докато се наблюдава незначителна тенденция към намаляване на F480 плюс TMEMl19 плюс микроглия. В съответствие с това откритие, флоретинът потиска производството на възпалителни медиатори в микроглията, но това потискане е по-слабо изразено в сравнение с макрофагите (допълнителна фигура 2 AC). Тези констатации предполагат, че подобряването на EAE от флоретин е главно задвижвано от макрофаги. В допълнение към намаляването на експресията на възпалителни гени, флоретинът повишава експресията на противовъзпалителни и невротрофични фактори, т.е. IL-4, CNTF и IGF-1 в гръбначния мозък на EAE животни (фиг. 6D ). Тези констатации категорично предполагат, че флоретинът намалява тежестта на заболяването на ЕАЕ, като насочва макрофагите към фенотип, разрешаващ заболяването. В съответствие с нашите предишни in vitro констатации, ние също открихме повишен Nrf2 сигнал-линг в ЦНС на третирани с флоретин EAE животни, както е показано от повишената експресия на mRNA на Nrf2 и неговите цели надолу по веригата NQO1 и GPX1 (фиг. 6G). Като цяло тези данни показват, че флоретинът потиска невровъзпалението както в профилактична, така и в терапевтична среда. Освен това, нашите открития показват, че флоретинът може да намали невровъзпалението чрез потискане на възпалителните характеристики на макрофагите чрез активиране на Nrf2.

Дискусия

В това проучване ние демонстрираме, че флоретинът задвижва макрофагите към по-малко възпалителен фенотип по Nrf2-зависим начин. Установено е, че AMPK-зависимото активиране на аутофагията и последващото разграждане на Keapl са в основата на активирането на Nrf2 от флоретин. Освен това, ние потвърждаваме противовъзпалителните ефекти на флоретин в EAE модел, където той намалява тежестта на заболяването и облекчава зависимите от макрофагитеневровъзпаление.

Ние показваме, че флоретинът потиска възпалителния фенотип на макрофагите. Това е в съответствие с констатациите на Wei-Tien Chang et al. които демонстрират, че флоретинът има противовъзпалителни свойства в клетъчна линия на макрофаги [36]. Ние демонстрираме, че индукцията на тази промяна на фенотипа зависи от Nrf2. Nrf2 е главен регулатор на антиоксидантните реакции и е известно, че неговото активиране кара макрофагите към противовъзпалителен фенотип [1l, 12, 37]. В допълнение, няколко проучвания определят, че активирането на Nrf2 отслабва невровъзпалението и невродегенерацията при нарушения на ЦНС [{{10 }}]. Въпреки това, въпреки че нашите открития показват, че Nrf2 е в основата на промяната на фенотипа на макрофагите, третирани с флоретин, данните за секвениране на РНК показват, че сред активирането на Nrf2 други пътища са регулирани нагоре. По-специално, регулирането нагоре на пътя на PPAR представлява интерес поради неговите противовъзпалителни характеристики и кръстосано взаимодействие с Nrf2 [41-45]. Освен това, тъй като флоретинът е добре дефиниран GLUT инхибитор и преминаването към гликолиза е решаващо метаболитно събитие за активиране на макрофагите, фенотипните промени могат също да бъдат частично индуцирани от директните метаболитни ефекти на флоретин върху тези глюкозни транспортери [46,47]. Необходими са повече изследвания, за да се определи значението на PPAR в индуцираното от флоретин Nrf2 активиране и до каква степен индуцираната от флоретин имуномодулация се влияе от директните метаболитни промени. Като цяло, нашите открития ясно показват, че активирането на Nrf2 играе съществена роля в фенотипния превключвател, медииран от флоретин.

Нашите открития показват, че активирането на Nrf2 от флоретин се медиира от AMPK активиране. AMPK играе решаваща роля при възстановяването на клетъчната енергийна хомеостаза в случай на стрес, който изчерпва АТФ, което води до повишено съотношение ADP: ATP, като по този начин се включват алтернативни катаболни пътища, които генерират АТФ, като същевременно се изключват анаболните пътища, които консумират АТФ [48]. Съответно, флоретинът е добре установен инхибитор на GLUT и понижава нивата на клетъчната глюкоза [49-51]. Няколко проучвания показват, че активирането на AMPK в макрофагите индуцира имуносупресивен фенотип, което потвърждава нашите резултати, показващи, че активирането на AMPK е от съществено значение за флоретина за понижаване на възпалението [52,53]. Нашите данни също са в съответствие с предишни проучвания, при които е доказано, че флоретин активира AMPK в други типове клетки, включително адипоцити и ендотелни клетки [50, 54-56]. Флоретинът може да активира AMPK косвено чрез увеличаване на AMP и понижаване на нивата на ATP, тъй като AMP и ATP алостерично стимулират или инхибират съответно активирането на AMPK [48, 57]. Независимо от това, CaMKK, която е киназа нагоре по веригата на AMPK, може да насърчи активирането на AMPK в отговор на повишени клетъчни Ca2 плюс нива без промяна в нивата на AMP/ATP [58]. В допълнение, като се има предвид широката мрежа от взаимодействие между AMPK и пътищата нагоре и надолу по веригата, са необходими допълнителни изследвания за изясняване на основния механизъм на индуцираното от флоретин AMPK активиране.

Нашите данни предполагат, че медиираното от флоретин AMPK активиране стимулира аутофагията в макрофагите. Както бе споменато по-горе, активирането на AMPK е самозащитен процес, който има за цел да възстанови енергийния баланс на клетката [48]. Въпреки че нито едно проучване не е показало, че флоретинът е в състояние да стимулира фенотипа на макрофагите чрез насърчаване на аутофагията, някои проучвания все пак демонстрират ефект на флоретин върху пътищата на аутофагията в раковите клетки и хепатоцитите [59-61]. Освен това различни проучвания показват, че катаболните процеси надолу по веригата на активиране на AMPK могат да активират аутофагия [60, 62, 63]. Интересно е, че в отговор на глюкозно гладуване, AMPK-медиираната аутофагия се индуцира от фосфорилиране на важния инициатор на аутофагия unc-51 като киназа, активираща аутофагията [64,65]. По отношение на това, ние спекулираме, че AMPK стимулира аутофагията за възстановяване на АТФ от клетъчните компоненти в отговор на индуцираното от флоретин изчерпване на глюкозата. Глюкозното гладуване обаче може също да активира автофагия по AMPK-независим начин [66-68]. Следователно са необходими повече изследвания, за да се определи дали активирането на аутофагия от флоретин също се случва частично независимо от AMPK.

Последните проучвания показаха значението на аутофагията за задвижване на функционалния фенотип на макрофагите. В този контекст дисрегулацията на аутофагията в макрофагите е свързана по-специално с появата на атеросклероза и неврологични заболявания [69-72]. Тук предоставяме връзка между лечението с флоретин, индукцията на автофагия и активирането на Nrf2, като показваме, че флоретинът насърчава активирането на Nrf2 чрез p62-медиирано разграждане на Keap1. Доскоро увеличаването на p62 puncta се считаше за признак на намалена аутофагия, тъй като p62 се разгражда в автофагозомите при активиране на аутофагията [34]. Във връзка с това, натрупването на p62 е свързано с дисфункция на автофагията при атеросклеротични лезии [73]. Това схващане обаче беше оспорено през последните години и сега се смята, че p62 е необходим за образуването на автофагозоми и че повишаването на нивата на p62 успоредно с увеличаването на LC3Il puncta може да бъде признак за индукция на автофагия [74]. Следователно, заедно с капацитета на флоретин да активира AMPK и известната му роля в активирането на аутофагията, нашите резултати предполагат, че натрупването на P62 и LC3 при лечение с бафиломицин А1 в стимулирани от флоретин макрофаги се дължи на повишен автофагичен поток, а не на нарушен автофагия. Интересното е, че Lee Y et al. наскоро показаха, че освен активирането на Nrf2, свързването на p62 с Keapl също участва в образуването на автофагозома, което предполага, че активирането на медиираната от флоретин аутофагия е пряко свързано с повишена активност на p62 от една страна, но също и с повече взаимодействие на Keapl-p62 от друга [ 75]. Keapl е адаптер на убиквитин лигаза, базирана на Cullin-3-, която образува хомодимер с Nrf2 при хомеостатични условия, като по този начин насърчава убиквитинирането на Nrf2 и протеазомното разграждане [76]. Разрушаването на комплекса Keapl-Nrf2 води до стабилизиране на Nrf2 и транслокация към ядрото [77, 78]. Добре документирано е, че разрушаването на този комплекс става или чрез модификация на Keapl цистеинови остатъци от електрофилни молекули, директно взаимодействие на малки молекули с Keapl, или p62-медиирано разграждане на Keapl [35]. Ying Y et al. предполагат директно взаимодействие на флоретин и Keapl въз основа на in silico експерименти, което след това води до активиране на Nrf2 пътя в кардиомиоцитна клетъчна линия [79]. Тук установихме допълнителен механизъм, свързан с автофагия, чрез който флоретин активира Nrf2.

Използвайки модела EAE, установихме, че флоретинът облекчава невровъзпалението in vivo. Нашите данни категорично предполагат, че флоретинът подобрява ЕАЕ чрез потискане на възпалителния отговор, медииран от макрофаги и активиране на Nrf2 пътя. При други модели на заболяването също се съобщава, че флоретинът проявява невропротективни и имуномодулиращи свойства. По-специално, установено е, че флоретинът активира пътя на Nrf2 в мозъка при церебрална исхемия и намалява натрупването на амилоид бета в модела на болестта на Алцхаймер при плъх [80-84]. Флоретинът може да повлияе и на други имунни клетки in vivo, тъй като е установено, че това съединение инхибира активирането на Т клетки и дендритни клетки in vitro [85, 86]. Като се има предвид, че невровъзпалението в модела EAE не зависи изцяло от макрофаги, би било от интерес да се определи до каква степен намаляването на невровъзпалението се медиира от други имунни клетки. По отношение на това, въпреки че нашите данни предполагат, че подобряването на EAE се задвижва главно от макрофаги и е по-малко зависимо от модулацията на микроглията, необходими са допълнителни експерименти, за да се изясни до каква степен флоретинът засяга микроглията при невровъзпалителни заболявания. Като цяло, нашите открития показват, че флоретинът намалява невровъзпалението чрез повлияване на фенотипа на макрофагите, показвайки терапевтичния потенциал на флоретин за невровъзпалителни разстройства.

Изводи

Нашето проучване показва, че флоретинът е мощен имуномодулиращ агент, който модулира възпалителните свойства на макрофагите при невровъзпалителни разстройства. Установено е активиране на пътя на Nrf2, медиирано от AMPK-зависима активация на аутофагия и последващо разграждане на Keapl, за да стимулира тази промяна на фенотипа. Следователно флоретинът е обещаващ естествено срещащ се агент, който може да се използва за намаляване на възпалителната тежест на невровъзпалителни заболявания като MS.

Препратки

1. Zeng Y, Peng Y, Tang K, Wang YQ, Zhao ZY, Wei XY и др. Дихидромирицетинът подобрява образуването на пенести клетки чрез LXRalpha-ABCA1/ABCG1-зависимото изтичане на холестерол в макрофагите. Biomed Pharmacother. 2018; 101: 543–52. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.02.124.

2. Xia M, Hou M, Zhu H, Ma J, Tang Z, Wang Q и др. Антоцианините индуцират изтичане на холестерол от миши перитонеални макрофаги: ролята на пероксизомен пролифератор-активиран рецептор {гама}-чернодробен X рецептор {алфа}-ABCA1 път. J Biol Chem. 2005; 280 (44): 36792–801. https://doi.org/10.1 074/jbc.M505047200.

3. Chang YC, Lee TS, Chiang AN. Кверцетинът засилва експресията на ABCA1 и изтичането на холестерол чрез ap38-зависим път в макрофагите. J Lipid Res. 2012; 53 (9): 1840–50. https://doi.org/10.1194/jlr.M024471.

4. Grajchen E, Hendriks JJA, Bogie JFJ. Физиологията на пенестите фагоцити при множествена склероза. Acta Neuropathol Commun. 2018; 6 (1): 124. https://doi. org/10.1186/s40478-018-0628-8.

5. Bogie JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Подгрупи на макрофаги и микроглия при множествена склероза. Acta Neuropathol. 2014; 128 (2): 191–213. https://doi.org/1 0.1007/s00401-014-1310-2.

6. Baecher-Allan C, Kaskow BJ, Weiner HL. Множествена склероза: механизми и имунотерапия. неврон. 2018; 97 (4): 742–68. https://doi.org/10.1016/j. неврон.2018.01.021.

7. Bogie JFJ, Grajchen E, Wouters E, Corrales AG, Dierckx T, Vanherle S, et al. Стеароил-КоА десатураза-1 уврежда репаративните свойства на макрофагите и микроглията в мозъка. J Exp Med. 2020; 217 (5).

8. Bogie JF, Stinissen P, Hellings N, Hendriks JJ. Миелин-фагоцитиращите макрофаги модулират автореактивната Т-клетъчна пролиферация. J Невровъзпаление. 2011; 8 (1): 85. https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Bogie JF, Timmermans S, Huynh-Thu VA, Irrthum A, Smeets HJ, Gustafsson JA и др. Липидите, получени от миелин, модулират активността на макрофагите чрез активиране на чернодробния Х рецептор. PLoS One. 2012;7(9):e44998. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044998.

10. Bogie JF, Jorissen W, Mailleux J, Nijland PG, Zelcer N, Vanmierlo T, et al. Миелинът променя възпалителния фенотип на макрофагите чрез активиране на PPAR. Acta Neuropathol Commun. 2013; 1 (1): 43. https://doi.org/10.1186/2 051-5960-1-43.