Част1: 3-Хидроксифенилоцетна киселина: флавоноиден метаболит, намаляващ кръвното налягане

Контакт:tina.xiang@wecistanche.com

Резюме: Редовният прием на храни, богати на полифеноли, се свързва с голямо разнообразие от полезни ефекти върху здравето, включително предотвратяване насърдечно-съдови заболявания. Въпреки това, родителятфлавоноиди имат най-вече ниска бионаличност и следователно се предполага, че техните метаболити са биоактивни. Един от тези метаболити, 3-хидроксифенил оцетна киселина (3-HPAA), образуван от чревната микробиота, по-рано беше съобщено, че упражнява вазорелаксантни ефекти ex vivo. Целта на това проучване беше да хвърли повече светлина върху този ефект in vivo и да изясни механизма на действие. 3-HPAA води до дозозависимо понижение на артериалното кръвно налягане, когато се прилага iv както като болус, така и като инфузия на плъхове със спонтанна хипертония. Обратно, не са наблюдавани значителни промени в сърдечната честота. В експерименти ex vivo, при които са използвани свински сърца от кланица за намаляване на нуждата от лабораторни животни, 3-HPAA отпуска предварително свитите сегменти на коронарната артерия на свинете чрез механизъм, частично зависим от целостта на ендотела. Това отпускане е значително нарушено след инхибиране на ендотелната синтаза на азотен оксид. Обратно, блокадата на SKCa или IKCa каналите или мускариновите рецептори не повлиява 3-отпускането на HPAA. По същия начин не са наблюдавани ефекти на 3-HPAA върху циклооксигеназата, нито L-тип калциеви канали. Така 3-HPAA намалявакръвно наляганеin vivo чрез релаксация на съдовете и този механизъм може да се основава на освобождаването на азотен оксид от ендотелния слой.

Ключови думи: флавоноиди; чревна микробиота;метаболит;3-хидроксифенилоцетна киселина;кръвно налягане;вазорелаксация; коронарен; артерия; плъх; прасе

1. Въведение

Сърдечно-съдовите заболявания са водещата причина за смърт в световен мащаб, като приблизителният брой на смъртните случаи наближава 18 милиона годишно. Коронарната артериална болест и инсултът допринасят за приблизително 85 процента от тези фатални сърдечно-съдови събития [1]. Глобалната смъртност и заболеваемост подтикнаха прилагането на насоки за превенция на сърдечно-съдови рискове [2]. Установяването на персистиращо високо артериално налягане с последващо лечение е сред основните стратегии[34]. В действителност хипертонията се класифицира като основен рисков фактор за сърдечно-съдови заболявания. Предимно се причинява от повишено системно съдово съпротивление и това често е свързано с различни структурни и функционални промени във васкулатурата, които нарушават съдовата хомеостаза. По-специално, туниката интима на кръвоносните съдове, образувана от един слой ендотелни клетки, е нефункционална. В допълнение, васкуларните гладкомускулни клетки често изглеждат по-свити и по-слабо реагиращи на релаксиращи фактори, получени от ендотелиума [5].

Няколко проучвания са предоставили доказателства за защитните ефекти на богатата на полифеноли диета срещу сърдечно-съдови заболявания. Наистина, диета, богата на плодове, зеленчуци, ядки, шоколад или чай, които са богати източници нафлавоноиди, се свързва с намаляване на риска от сърдечно-съдови заболявания [6]. В допълнение към антиоксидантните, противовъзпалителни, антиагрегантни и антимикробни свойства,флавоноидисъщо притежават значителни вазодилататорни свойства [7,8]. Въпреки това, приемът на флавоноиди в световен мащаб е силно променлив и след като бъдат погълнати, тези съединения взаимодействат по сложен начин със стомашно-чревния тракт. Накратко, флавоноидите се срещат в растенията предимно под формата нагликозиди. След прием под формата на диета, те се хидролизират по време на храносмилането и това позволява освобождаването на агликоновата форма в тънките черва. Агликоните от своя страна могат да претърпят метаболизъм в епитела на тънките черва и по-късно в черния дроб. Това води до много слаба бионаличност на изходните флавоноиди, което беше многократно потвърдено [9,10]. Въпреки това, неабсорбираната фракция преминава от тънките черва в дисталните черва, където се разцепва от микробиотата на дебелото черво, което води до производството на малки фенолни съединения, включително фенилпропионова, фенилоцетна, бензоена киселина и хидроксибензени, които впоследствие се абсорбират [ 9]. Трябва да се отбележи, че през последните няколко десетилетия стана ясно, че защитните ефекти на хранителните флавоноиди се приписват на техните метаболити, а не на техните родителски форми [10-12]. Независимо от това, Booth и колеги документираха дори в началото на 50-те години на миналия век наличието на различни флавоноидни метаболити, а именно 3,4-дихидроксифенилоцетна (DHPA), 3-хидроксифенил оцетна (3-HPAA) и хомованилова киселина в урината на различни животински видове след перорален прием накверцетин[13]; изследванията върху биологичния ефект на малките фенолни метаболити на флавоноидите са много по-нови. По-конкретно, през последните години изследванията върху метаболитната съдба на флавоноидите, както и проучванията, отчитащи биоактивността на техните получени от микроби метаболити, се превърнаха в гореща и интензивно изследвана тема в тази област. Нашата изследователска група показа, че няколко микробни метаболита, включително DHPA, 4-метил катехол и 3-(3-хидроксифенил) пропионова киселина, отпускащата аорта на плъх е вероятно физиологично постижими концентрации [14,15 ]. Доколкото ни е известно, 3-HPAA е един от най-слабо изследваните метаболити. Документирано е, че е метаболит на редица фенолни съединения, включително различни класове флавоноиди като флавоноли (кверцетин с неговия гликозид рутин, кемпферол), изофлавони и флаваноли (и двете олигомерни процианидини и техните мономерни единици, катехин и епикатехин) (Фигура 1) [16-20].

Тъй като 3-HPAA отпуска клетките на гладката мускулатура ex vivo [14], това проучване имаше за цел да тества дали този метаболит е в състояние да причини понижаване на артериалното кръвно налягане in vivo и да открие неговия механизъм на действие в серия от механични експерименти .

2. Материали и методи

2.1. Животни

Експериментите in vivo бяха проведени върху плъхове със спонтанна хипертония (SHR), получени от Чешката академия на науките, Прага, Чешка република. Животните се отглеждат в животновъдния център на Факултета по фармация и се поддържат при постоянна температура от 23-25 градуса с 12-часов цикъл тъмно/светло. На плъховете е осигурена стандартна диета и чешмяна вода ad libitum. Проучването (рег. №.4937 2019-9) е одобрено от Министерството на образованието, младежта и спорта, в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни, публикувано от Националния здравен институт на САЩ (8-мо издание, преработено 2011, ISBN-13:978-0-309-15400-0).

2.2.Химикали

Пентобарбитал, натриев нитропрусид, диметил сулфоксид (DMSO), L-Nw-нитро аргинин метилов естер (L-NAME), атропин, TRAM-34/1-[(2-хлорофенил)дифенилметил] -1Н-пиразол, индометацин, нифедипин, брадикинин, KCl, CaCl и UCL-1684/6,12,19, 20,25,26-хексахидро-5,27 :13,18:21,24-триетено-11,7-метено-7Н-дибензо[b,m][1,5,12,16]тетраазациклотрикозин{{ 29}},13-диум трифлуороацетат хидрат са закупени от Sigma-Aldrich (Steinheim, Германия). Bay K8644 е получен от Axon Medchem BV (Гронинген, Холандия). Тестваният метаболит 3-HPAA е закупен от Toronto Research Chemicals (Торонто, Онтарио, Канада). NaCl, NaHCO3 и D-глюкоза бяха осигурени от PENTA sro (Прага, Чешка република). MgSO4.7H2O беше закупен от Erba Lachema sro (Бърно, Чешка република), а KH2PO4 от Dr. Kulich Pharma sro (Hradec Kralové, Чехия) Република). Физиологичният разтвор е закупен от Baxter Czech spol. sro (Прага, Чехия) и хепарин от Zentiva (Прага, Чехия).

Натриев нитропрусид, L-NAME и атропин се разтварят в дестилирана вода. Базовите разтвори на TRAM-34（1 mM） и UCL-1684（100 μM） бяха приготвени като водни разтвори, допълнени съответно с 20 процента и 10 процента DMSO. Изходен разтвор на индометацин (1 mM) също се приготвя в 10 процента DMSO/вода и Bay K8644 (10 mM) и нифедипин (10 mM) се разтварят в чист DMSO. Крайната концентрация на DMSO в камерата за тъкани винаги е била<0.2%.the krebs="" solution="" contains="" the="" following="" (mm):="" nacl119,="" kcl4.7,="" cacl2="" 1.25,kh2po41.18,="" mgso4.7h2o1.17,="" nahco325,="" and="" d-glucose="">

2.3. Експерименти In Vivo

Дванадесет SHR плъха (средно тегло 356 ± 21 g, кръвно налягане при анестезия 211 ± 64/152 ± 45 mmHg, сърдечна честота 381 ± 37 bpm) бяха анестезирани ip с пентобарбитал (50 mg. kg-). Преобразувателят за налягане MLTO380/D беше свързан с лявата обща каротидна артерия и артериалното кръвно налягане със сърдечната честота беше записано с помощта на устройство Power Lab, свързано със софтуера LabChart 7 (ADInstruments, Сидни, Австралия). Лявата сафенозна вена се канюлира за интравенозно приложение на болус или инфузия. След операцията всеки плъх се оставя да се стабилизира за 15 минути преди експеримента. 3-HPAA се разтваря във физиологичен разтвор и се прилага по два протокола: (1) като единична болус доза, варираща от 0.001 до 10 mg kg{{18 }}(приложеният обем винаги е бил 0,1 mL, n=8); или (2) като четири последователни инфузии с продължителност 5 минути при дози 0,05, 0,25, 1 и 5 mg.kg-1.min-1 （n=4） със скорост на инфузия от 50 μL на минута с помощта на помпата за спринцовка "Genie" Kent （Kent Scientific Corporation, Torrington, CT, USA) (Фигура 2a). И в двата протокола следващата доза винаги се дава след стабилизиране на кръвното налягане за поне 5 минути. Като контрола, всяко животно се третира с физиологичен разтвор при същите условия, преди да се извърши първото приложение на 3-HPAA. След измерването, всеки плъх беше умъртвен чрез iv KCl (1 mL, 1 mol·L-). Телесната температура по време на експеримента се поддържа на 36,5±0,5 градуса с помощта на нагревателна плоча.

2.4.Ex vivo експерименти

2.4.1. Подготовка на тъканите

Екс vivo експериментите бяха проведени върху свински коронарни артериални пръстени (Фигура 2b). Свинските сърца (n= 11) са получени от местна кланица. Прасетата са здрави животни от двата пола, от стандартно отглеждане и под ветеринарен контрол, предназначени за консумация. Сърцата бяха обработени за експеримента приблизително 4 часа след клането на животното. Сърцата се потапят в разтвора на Кребс и лявата циркумфлексна коронарна артерия веднага се изрязва, отново се потапя в разтвора на Кребс и се почиства от прилепнала мазнина, съединителна тъкан и кръв. След това пречистената коронарна артерия се нарязва на цилиндрични пръстени с дължина приблизително 3 mm. За определени механични експерименти ендотелният слой беше механично разкъсан чрез леко триене на луминалната повърхност с форцепс. Пръстените се поддържат в тъканни вани, напълнени с разтвор на Кребс при кислородни условия (95 процента О и 5 процента СО2) при 37 градуса. Всеки артериален пръстен беше окачен между две телени куки от неръждаема стомана, едната от които фиксирана към държач, а втората свързана към трансдюсер и компютър, оборудван със SPEL Advanced Kymograph Software, v3.2 (Experimetria Ltd., Будапеща, Унгария). Тази подредба позволява измерване на изометрично напрежение. Препаратите се уравновесяват при напрежение от 2 g в продължение на 40 минути, през които разтворът на Кребс се сменя на всеки 10 минути. След това напрежението се настройва на 1 g (базова линия), всяка тъканна баня се пълни с 5 ml от разтвора на Кребс и беше извършен следният тест за жизнеспособност: коронарните пръстени бяха свити с KCl (крайната концентрация във ваната беше 40 mM) и когато се достигна платото, беше добавен брадикинин (300 nM), за да се потвърди непокътнат ендотел или оголени пръстени. След това коронарните пръстени се промиват няколко пъти с разтвор на Кребс.

2.4.2. Потвърждение на вазодилататорната активност на 3-HPAA върху коронарната артерия на свинете

Вазорелаксантната активност се измерва върху предварително свити с KCl (40 mM) артериални пръстени (Фигура 2b). След достигане на платото,3-HPAA беше кумулативно добавена към ваната в концентрации, вариращи от 100 μM до 1 mM.3-HPAA беше приготвена в разтвора на Кребс. Разтворът на Кребс без тестваното съединение се добавя към някои коронарни пръстени като контрола, като се използва същата процедура. Всяка доза се прилага след стабилизиране на релаксиращия отговор, причинен от предишната доза, и натриев нитропрусид (100 μM) се използва за предизвикване на максимална релаксация във всички експерименти в края на процедурата.

2.4.3. Механистични експерименти

В следващите експерименти механизмът на вазодилататорно действие на 3-HPAA е изследван върху непокътнати ендотелни коронарни пръстени, като се използва инхибитор на азотен оксид (NO) синтаза, L-NAME（100 μM）; антагонист на мускаринов рецептор, атропин (50 µM); циклооксигеназен （COX） инхибитор, индометацин （10 µM）; или инхибиторите на Ca2 плюс -активираните Kt канали с междинна и малка проводимост, TRAM-34（10 μM） и UCL-1684 （1 μM）, съответно (Фигура 2b). Атропин или инхибитори винаги се добавят 30 минути преди добавянето на KCl (40 тМ). След това, в отделен експеримент, участието на васкуларните Cay1.2 Ca2 плюс канали (L-тип) върху 3-HPAA-индуцираната вазорелаксация беше изследвано чрез предварително третиране на оголени от ендотел коронарни пръстени с 15 mM KCl, последвано от инкубиране с 3-HPAA в концентрация 1 mM за 30 min. След това, L-тип активатор на калциевия канал, Bay K8644, беше приложен кумулативно （100 pM-10μM） на тъмно, за да предизвика контрактилен отговор. KCl (80 mM) се използва за предизвикване на максимална контракция. Като отрицателни контроли се използват пръстени, инкубирани със съответния обем на носителя (разтвор на Кребс). В допълнение, пръстени, инкубирани с известния инхибитор на калциевите канали от L-тип нифедипин (150 пМ), се използват като положителни контроли. Изследваните целеви протеини и лигандите, използвани в механистичните експерименти, са обобщени в таблица 1.

2.5. Анализ на данни

GraphPad Prism 7.03 (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ) беше използван за анализ на данни. За in vivo експерименти разликите между индивидуалните болус дози от 3-HPAA и контролата (физиологичен разтвор) бяха сравнени с помощта на еднопосочна ANOVA, последвана от пост-хок тест на Dunnett. За инфузии беше използван двупосочен ANOVA, последван от пост-хок тест на Dunnett. За механистичните ex vivo експерименти, резултатите бяха сравнени чрез използване на несдвоен t-тест. За експерименти с Bay K8644 беше използвана двупосочна ANOVA, последвана от тест на Dunnett за множество сравнения. Данните са показани като средна стойност ± SEM.

3. Резултати

3.1. Ефект на 3-HPAA върху кръвното налягане и сърдечната честота in vivo при SHR

3.1.1. Прилагане на единичен болус

Наблюдава се значително понижение на средното, систолното и диастоличното кръвно налягане след болус приложение на {{0}}HPAA в дози, вариращи от 0.01 до 10 mg.kg-' (Фигури 3 и S1). Намаляването на систоличното кръвно налягане е очевидно от доза от 0,1 mg. kg-I (Фигура 3а), докато диастоличното кръвно налягане спада значително дори от 10 пъти по-ниска доза (0,01 mg. kg-') (Фигура 3b). В същия експеримент не е открит ефект върху сърдечната честота при нито един от 3-Дози HPAA (Фигура S2).

3.1.2. Инфузионно приложение

5-минутните инфузии на 3-HPAA доведоха до намаляване на средното, систоличното и диастоличното кръвно налягане (пълните резултати на фигура S3). Ефектът беше дозозависим, достигайки максимално прибл. 50 процента. Значителни промени бяха получени от двете най-високи дози, 1 и 5 mg·kg-1.min-I (Фигура 4). Освен това в този случай не са открити значителни промени в сърдечната честота (Фигура S4).

3.2. Потвърждение на вазодилататорните свойства на 3-HPAA върху свинска коронарна артерия

При експерименти ex vivo 3-HPAA индуцира вазодилатация на коронарната артерия на прасе по дозозависим начин (Фигура 5). С изключение на първата доза, се наблюдава вазодилатация. Резултатите обаче бяха значими само за най-високата концентрация (1 тМ). Същата концентрация беше използвана за по-нататъшно механично тестване ex vivo.

3.3. Механизмът на съдовите ефекти на 3-HPAA, изследван Ex Vivo върху коронарна артерия на свине

За да изследваме механизмите, лежащи в основата на 3-HPAA-индуцираната вазодилатация, ние сравнихме нейните ефекти върху коронарните артериални пръстени на свинете с интактен и оголен ендотелиум, предварително свити с KCl. Отстраняването на ендотела намалява вазодилататорния ефект (Фигура 6b). След това откритие беше тествано участието на ендотелен NO. Предварително третиране с инхибитор на eNOS, L-NAME (100 uM), също води до значително намаляване на 3-HPAA-индуцираната вазодилатация (Фигура 6с). За разлика от това, аналогично предварително третиране на коронарни пръстени с антагонист на мускаринов рецептор атропин (50 uM) или с блокери на IKCa или SKCa канали, TRAM-34（10 μM） и UCL-1684（1 μM）, съответно, или с COX инхибитора, индометацин (10 μM) не предизвиква никакви промени във вазодилатацията, произведена от 3-HPAA (Фигура 6d-g). Накрая решихме да проучим дали 3-HPAA може да действа чрез инхибиране на Cay1.2 калциевите канали (L-тип) върху васкуларните гладкомускулни клетки. Предварителното третиране на пръстените с 3-HIPAA (1 mM) няма значителен ефект върху контракцията, предизвикана от кумулативни дози Bay K8644（100 pM-10 μM）（Фигура 7）, докато инкубацията с известния Cav1.2 инхибитор на калциевия канал (L-тип) нифедипин (150 nM) значително намалява контракциите (положителна контрола).

Щракнете върху връзката за част 2 допълнителна информация
https://www.xjcistanche.com/news/part2-3-hydroxyphenylacetic-acid-a-blood-pre-54725696.html