Екстрактът от семена на Phoenix Dactylifera L. проявява антиоксидантни ефекти и намалява меланогенезата

Хуей-Чун Хуанг1 , Шр-Шиуан Уанг2, Цанг-Чи Цай3, Уанг-Пинг Ко3 и Tsong-Min Chang2,*

Резюме:Предистория: Начинът на действие на екстракта от семена на Phoenix dactylifera в грижата за кожата никога не е бил изследван. Методи: Семената на P. dactylifera L. се екстрахират чрез ултразвукова екстракция. Антиоксидантните характеристики на екстракта се определят от 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH) и 2,2'-азино-ди-(3-етилбензтиазолин сулфонова киселина) (ABTS плюс) анализи и методи за почистване. Общото фенолно съдържание, редуциращият капацитет, хелатообразуването на желязо (II) йони и вътреклетъчните реактивни кислородни видове (ROS) също бяха изследвани. Ефектите на екстракта от семена на P. dactylifera L. върху меланогенезата са оценени спектрофотометрично чрез анализ на активността на тирозиназата на гъбите, определяне на вътреклетъчната активност на тирозиназата и съдържанието на меланин. Нивата на експресия на протеини, свързани с меланогенезата, се анализират чрез Western blotting. Резултати: Резултатите показват, че P.dactylifera L.екстрактът от семена проявява очевиден антиоксидантен капацитет и значително намалява вътреклетъчното съдържание на ROS при концентрации от {{0}}.245 и 0,49 (mg/mL). Освен това, екстрактът намалява експресията на меланокортин 1 рецептор (MC1R), микрофталмия-свързан транскрипционен фактор (MITF), тирозиназа, свързан с тирозиназа протеин-1 (TRP1) и свързан с тирозиназа протеин-2 ( TRP2) и инхибира меланогенезата в B16F10 клетки. Заключения: Нашите резултати разкриха, че екстрактът от семена на P. dactylifera L. отслабва меланогенезата в клетки B16F10 чрез понижаване на сигналните пътища на протеин киназа A (PKA). Следователно, екстрактът може да се използва като вид средство за избелване на кожата в продуктите за грижа за кожата.

Ключови думи: Phoenix dactylifera;тирозиназа; меланин; ROS; PKA

cistanche pharma specialе вид средство за избелване на кожата.

1. Въведение

Антиоксидантите се прилагат широко за предотвратяване или лечение на разстройства, свързани с оксидативния стрес, в козметичните и дерматологични области. През последните няколко десетилетия антиоксидантите се използват и в козметичната индустрия за предотвратяване или забавяне на стареенето на кожата. Съобщава се, че свободните радикали и реактивните кислородни видове (ROS) са свързани с няколко заболявания, като стареене и свързани с възрастта заболявания [1]. Интересното е, че увреждането на кожата от свободните радикали, причинено от UV-облъчване и ROS, играе важна роля в процеса на фотостареене на кожата [2,3]. Съобщава се, че антиоксидантите пречат на процеса на окисляване чрез извличане на свободни радикали и ROS или чрез хелатиране на окислително-каталитични метали [4]. Следователно има драстично увеличение в броя на приложенията на антиоксиданти или антиоксидантни хранителни добавки за намаляване на оксидативния стрес или предизвиканото от оксидативен стрес увреждане в тялото [5,6]. Въпреки това е доказано, че някои химически антиоксиданти, включително натриев аскорбат, терт-бутил хидроксианизол (BHA), натриев ериторбат и терт-бутил хидрокситолуен (BHT), насърчават канцерогенните ефекти върху човешкото здраве [7]. Следователно през последните десетилетия се наблюдава бърз растеж на изследванията върху естествените антиоксиданти, получени от растения. Важно е, че беше установено, че повишаването на нивото на ROS може да ускори пигментацията на кожата. Сред ROS, получени от меланоцити и кератиноцити, азотният оксид, NO, стимулира синтеза на меланин чрез повишаване на нивата на протеинова експресия на тирозиназа и свързан с тирозиназата протеин 1 (TRP1) [8,9]. Ефектът на ROS върху производството на меланин е изследван с помощта на различни антиоксиданти, като N-ацетил цистеин, за премахване на действието на UVB-индуцирания -меланоцит-стимулиращ хормон (-MSH) [10].

Меланинът се произвежда и секретира от меланоцити, които са разпределени в базалния слой на епидермиса на кожата [11]. Първите две стъпки от пътя на меланогенезата при хората са хидроксилирането на L-тирозин до 3-4-дихидрокси фенилаланин (L-DOPA) и окислението на L-DOPA до о-допахинон. Тирозиназата (EC 1.14.18.1) е ограничаващ скоростта ензим, който катализира и двете от първите две реакции по време на меланогенезата [12]. Меланинът играе жизненоважна роля в защитата на кожата срещу увреждане на ултравиолетовото (UV) слънчево лъчение и също така е отговорен за оцветяването на косата, кожата и очите. Съобщава се, че различни дерматологични заболявания, като старчески петна, мелазма, постинфламаторна меланодермия, лунички и места на актинично увреждане, в резултат на натрупване на прекомерно ниво на епидермален меланин [13]. Инхибиторите на синтеза на меланин се прилагат все повече в продуктите за грижа за кожата за лечение или профилактика на кожни хиперпигментни нарушения [14,15]. В допълнение, антиоксиданти, като арбутин или коджикова киселина [16], са използвани при лечението на хиперпигментация [17]. Напоследък козметиката за избелване на кожата заема голяма част от козметичните продукти. Не само жените с тъмна кожа, но и тези, които се опитват да се справят с тъмните петна по кожата си, възникващи от ултравиолетова светлина, бременност или напреднала възраст, широко използват тези продукти за избелване на кожата.

Меланогенезата се регулира от множество фактори. Например, за свързания с тирозиназа протеин -1 (TRP1), свързан с микрофталмия транскрипционен фактор (MITF) и свързан с тирозиназа протеин -2 (TRP2) се съобщава, че регулират производството на меланин [18–20 ]. Рецепторът на меланокортин 1 (MC1R) също има важна роля в индуцирания от -MSH синтез на меланин [21]. Има няколко сигнални пътя, участващи в производството на меланин. Сред различните сигнални пътища, регулиращи производството на меланин, цикличното AMP (cAMP)-медиирано активиране на протеин киназа A (PKA) играе критична роля в регулирането на меланогенезата [22]. В cAM-PKA сигналния път, cAMP индуцира активирането на PKA [23], което е последвано от фосфорилиране на cAMP отговор елемент-свързващ протеин (CREB). CREB е вътреклетъчен транскрипционен фактор, който стимулира експресията на гена на микрофталмичния фактор (MITF), който е важен в меланогенезата. MITF е транскрипционен фактор, който се свързва с промоторните региони на меланогенните гени тирозиназа, TRP1 и TRP2, регулирайки тяхната експресия [24,25]. След това вътреклетъчното съдържание на меланин се увеличава [26]. Съобщава се, че -MSH повишава нивата на cAMP и обикновено се прилага за активиране на фосфорилирането на CREB и след това за повишаване на нивата на MITF протеин [27].

Експресията на MITF се регулира от няколко сигнални пътя. c-Jun N-терминална киназа (JNK) и р38 митоген-активирана протеин киназа (MAPK) участват в активирането на експресията на MITF и последващата повишена експресия на тирозиназа. Сигналите за активиране на екстрацелуларна реагираща киназа (ERK) също повишават фосфорилирането на CREB и последващата експресия на MITF, което модулира синтеза на меланин [28,29]. Следователно се съобщава, че няколко агента за избелване на кожата инхибират транскрипционната активност на MITF чрез намаляване на нивата на протеинова експресия на тирозиназа, TRP1 и TRP2 чрез регулиране надолу на p38MAPK-медиирано MITF фосфорилиране. Освен това е описано, че пътят на ERK участва в регулирането на MITF по време на меланогенезата [30,31]. Активирането на ERK фосфорилира MITF, което води до разграждане на MITF, което води до намаляване на съдържанието на меланин [32,33].

Оксидативният стрес може да бъде резултат или от свръхпроизводство на ROS, или от намалена антиоксидантна защита [1]. Търсенето и приложенията на естествените антиоксиданти остават във фокуса на многобройни изследователски екипи по целия свят. Напоследък се наблюдава нарастващ интерес към изследването и разработването на фитохимикали, като естествени антиоксиданти и фенолни съединения от различни природни източници, които могат да се използват като хранителни добавки, козметика против стареене и медицински продукти [34]. Phoenix dactylifera L. е една от основните овощни култури, произвеждани в Близкия изток и Северна Африка [35,36]. Предишни проучвания съобщават, че плодовете на P. dactylifera L. проявяват антиоксидантна, абсорбираща свободните радикали, антимикробна и противовъзпалителна активност [37,38]. Функционалните ефекти на P. dactylifera L. не са ограничени само до самите плодове, но и до техните семена, които са вид страничен продукт от плодовете [39,40]. Благодарение на своите антиоксидантни свойства, екстрактите от семена на P. dactylifera L. могат да служат като източник на антиоксидантни вещества, които действат срещу оксидативния стрес [41–43]. Въпреки това са проведени малко проучвания за приложенията на семената на P. dactylifera L. за разработването на козмецевтични продукти. Тези семена обикновено се изхвърлят като отпадъци, но значението им като функционална козметична съставка е подчертано тук. Към днешна дата няма доклади относно механизма на действие на екстракта от семена на P. dactylifera L. в областта на козметиката за грижа за кожата или ефектите на екстракта от семена върху производството на меланин. Фокусът на настоящото изследване беше да се определи потенциалът на екстракта от семена на P. dactylifera L. като инхибитор на меланогенезата за козметичната индустрия.

Механизмите, лежащи в основата на инхибиторните ефекти на екстракта от семена на P. dactylifera L. върху меланогенезата, все още не са изследвани. Целта на настоящото проучване беше да се изследват антиоксидантните характеристики и потенциалните механизми на действие на екстракта от семена на P. dactylifera L. върху меланогенезата чрез изследване на транскрипционните регулатори на MITF и фосфорилирането на регулаторите на MAPK и PKA сигналните пътища.

прясна цистанче

2. Материали и методи

2.1. Химикали и реактиви

Химическите реагенти, използвани в изследването, са закупени от Sigma-Aldrich Chemical Co. (Сейнт Луис, MS, САЩ). Антителата бяха от Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, USA), а ECL реагентът беше от Millipore (Billerica, MA, USA).

2.2. Приготвяне и извличане на екстракт от семена на P. dactylifera

Изсушените плодове на P. dactylifera L. са събрани през 2019 от традиционни магазини, разположени в град Медина, Саудитска Арабия. Семената на P. dactylifera L. се измиват напълно, излагат се на слънчева светлина, сушат се на въздух за един ден и след това се сушат при 80 ◦C за 2 часа в пещ. Дехидратираните семена се пулверизират до фин прах (#50 меша) със специална мелница (Retsch ултра центробежна мелница и машина за пресяване, тип ZM1, Хаан, Германия). Прахът се събира в запечатана стъклена бутилка и се съхранява при 25 ◦C до употреба. Стрити на прах изсушени семена на P. dactylifera L. (2 g) се поставят в чаша за екстракция, съдържаща 10 mL дестилирана вода. След това беше извършена ултразвукова екстракция с модела ULTRAsonikTM 57H (250 W, C и A Sales Industrial Supplies, Yucaipa, CA, USA). Работната честота е 45 kHz за 30 минути. След екстракцията, пробите се центрофугират при 4500 rpm за 50 минути при 25 ◦C с Eppendorf Centrifuge 5810 R (Хамбург, Германия). Супернатантите се събират и филтруват с найлонов филтър (размер на порите: 0.45 μm) и филтратът се концентрира до 9.8 mg/mL.

2.3. Анализ с ултра-ефективна течна хроматография (UPLC) на екстракт от семена на P. dactylifera и ферулинова киселина

Екстрактът от семена на P. dactylifera се анализира с помощта на ACQUITY UPLC H клас с фотодиоден детектор (Waters, Milford, MA, USA). Колоната беше ACQUITY UPLC BEH C18 колона, 130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm. Подвижна фаза А е 0,5 процента оцетна киселина, а подвижна фаза В е ацетонитрил. За времеви точки 0 и 5 минути, процентното съотношение на A/B е 95/5; за 20 минути, процентното съотношение на A/B е 5/95; за времеви точки 21 и 25 минути, процентното съотношение на A/B е 95/5. Като положителен стандарт се използва ферулова киселина (1 ppm).

2.4. Анализ на DPPH изчистваща активност

В този анализ витамин С ({{0}}.5 mg/mL) и BHA (0.1 mg/mL) са използвани като антиоксидантни стандарти. Екстрактът от семена на P. dactylifera L. при различни концентрации (0.0049, 0,0245 и 0,049 mg/mL) се добавя към 2,9 mL DPPH (60 μM) разтвор. Антиоксидантните компоненти в екстракта от семена могат да дарят водород на DPPH и да превърнат DPPH в редуцирана форма. Полученото намаление на абсорбцията при 517 nm беше записано с помощта на UV-Vis спектрофотометър [44].

2.5. ABTS плюс анализ на капацитета за почистване

ABTS плюс способността за почистване на екстракта от семена на P. dactylifera L. беше сравнен с този на витамин С ({{0}}.9 mg/mL) и BHA ({{10}}). 9 mg/mL). За този анализ беше използван ABTS plus. Катионът първо се получава чрез взаимодействие на разтвора на ABTS (7 тМ) с калиев персулфат (2,45 тМ) и сместа се оставя да престои на тъмно най-малко 6 часа преди употреба. Абсорбцията при 734 nm се измерва 10 min след смесване на различни концентрации на екстракта от семена (0,0098, 0,049 и 0,098 mg/mL) с 1 mL ABTS плюс разтвор [45].

2.6. Определяне на общо фенолно съдържание

Общото фенолно съдържание се определя с помощта на реактива на Folin-Ciocalteu [46] и като положителен стандарт се използва галова киселина (2 ug/mL). Различни концентрации на екстракт от семена на P. dactylifera L. (0.{0196, 0.098 и 0,196 mg/mL) се приготвят в 80 процента метанол; 100 μL екстракт се прехвърлят в епруветка и се добавят 0,5 mL реагент на Folin–Ciocalteu (предварително разреден 10-кратно с дейонизирана вода) и се смесват. Сместа се оставя да престои при стайна температура в продължение на 5 минути; Добавят се 1.5 mL 20 процента натриев карбонат. След престояване при стайна температура в продължение на 2 часа, абсорбцията се отчита при 760 nm с помощта на UV-Vis спектрофотометър.

2.7. Определяне на редуциращия капацитет

Витамин C ({{0}}.008 mg/mL) или BHA (4,8 mg/mL) бяха използвани като положителни стандарти в този анализ. Редуциращият капацитет на екстракта от семена се определя съгласно метода, описан от Oyaizu [47]. Различни концентрации на екстракт от семена на P. dactylifera L. (0.0073, 0,036, 0,073 mg/mL) се смесват с фосфатен буфер (2,5 mL, 0,2 М, pH 6,6 ) и калиев ферицианид [K3Fe (CN)6] (2,5 mL, 1 процент w/v). Сместа се инкубира при 50 ◦C за 20 минути. Към сместа се добавя трихлороцетна киселина (2,5 mL, 10 процента w/v), която след това се центрофугира при 1000 × g за 10 минути. Горният слой от разтвора (2,5 mL) се смесва с дестилирана вода (2,5 mL) и FeCl3 (0,5 mL, 0,1 процента w/v) и се измерва абсорбцията при 700 nm.

2.8. Измерване на капацитета за хелатиране на железни (II) йони

За измерване на капацитета за хелатиране на Fe2 плюс йони на екстракт от семена на P. dactylifera L., EDTA (0.02, 0.{04 и { {10}}.08 mg/mL) се използва като положителен стандарт. Различни концентрации на екстракта от семена (0.0196, 0.098 и 0.196 mg/mL) се добавят към разтвор на FeCl2 (0.05 mL, 1 mM). Реакционната смес реагира с ферозин (0.1 mL, 1 mM), след това сместа се определя количествено до 1 mL с метанол и се инкубира при 25 °C за 10 минути. Абсорбцията на реакционната смес се измерва при 562 nm [48].

2.9. Анализ на клетъчната жизнеспособност

Анализът на клетъчната жизнеспособност се извършва с помощта на метода MTT [49]. Клетките бяха изложени на различни концентрации на екстракт от семена на P. dactylifera L. (0.049, 0.245 и 0,49 mg/mL) за 24 часа при 37 ◦C и 5 процента CO2 в овлажнен инкубатор и разтворът на МТТ се добавя към ямките. Неразтворимото производно на МТТ се солюбилизира с етанол-DMSO (1:1 смесен разтвор). Абсорбцията на ямките при 570 nm се измерва с помощта на четец на микроплаки. B16F10 клетки (BCRC60031) са получени от Центъра за събиране и изследване на биоресурси (BCRC), град Хсинчу, Тайван. Клетките се поддържат в DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA), допълнен с 10% фетален говежди серум и 1% антибиотици. В допълнение, ефектът на семена от P. dactylifera L. върху жизнеспособността на клетките B16F10 също беше оценен чрез метода за изключване на трипаново синьо. След третиране с екстракт от семена, клетките бяха трипсинизирани и центрофугирани за събиране на пелетата. Клетъчната пелета се ресуспендира в 300 μL среда за клетъчна култура DMEM. Малка аликвотна част от клетъчна суспензия (20 μL) се смесва внимателно с 10 μL трипаново синьо (4 процента в PBS). Броят на клетките беше преброен (нежизнеспособните клетки бяха сини и жизнеспособните клетки бяха неоцветени) с помощта на хемоцитометър под микроскоп.

2.10. Измерване на тирозиназната активност на гъбите

Разтворът на гъбена тирозиназа (10 μL, 200 единици) се добавя към 96-ямкова микроплака. Реакционната смес съдържа 5 mM L-DOPA, разтворен във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) (50 mM, pH 6,8), и екстракт от семена на P. dactylifera L. (0.049, 0.245 и 0,49 mg/mL), коджикова киселина (200 mM; 0,03 mg/mL) или арбутин (2 mM; 0,54 mg/mL). Сместа за анализ се инкубира при 37 °C в продължение на 30 минути и абсорбцията на произведения допахром се измерва при 490 nm. Измерването на активността на гъбната тирозиназа се провежда, както е описано по-горе [50].

2.11. Определяне на съдържанието на меланин

Клетките B16F10 бяха третирани с -MSH (100 nM) в продължение на 24 часа и след това третирани или с екстракт от семена на P. dactylifera L. (0,0245–0,147 mg/mL) или арбутин (0,54 mg/mL) за допълнителни 24 часа. След третиране клетъчните пелети се разтварят в разтвор на NaOH (1 N) при 60 °C в продължение на 60 минути. Съдържанието на меланин се открива при 405 nm, както е описано по-рано от Tsuboi [51].

Cistanche инхибира производството на меланин.

2.12. Измерване на вътреклетъчната тирозиназна активност

Вътреклетъчната тирозиназна активност се определя, както е описано по-горе [52]. Клетките бяха третирани с -MSH (100 nM) за 24 часа и след това с екстракт от семена на P. dactylifera L. (0.0245–0,147 mg /mL) или арбутин (0,54 mg/mL) за 24 часа. След третиране, клетъчните екстракти (100 μL) се смесват с прясно приготвен разтвор на L-DOPA (0, 1 процента в PBS) и се инкубират при 37 ◦ C и се измерва абсорбцията при 490 nm.

2.13. Western blotting експеримент

Клетките бяха третирани с екстракт от семена на P. dactylifera L. ({{0}}.0245, 0.0368, 0.{ {14}}49 и 0.147 mg/mL) или арбутин (0,54 mg/mL) и след това лизирани в PBS, съдържащ недиетичен P-40 (1 процент), натриев деоксихолат (0,5 процента), натриев додецил сулфат (SDS, 0.1 процента), апротинин (5 ug/mL), фенилметилсулфонил флуорид (100 ug/mL), пепстатин А (1 ug/mL) и EDTA (1 mM) при 4 ◦C за 20 минути. Общите лизати се определят количествено с помощта на микро BCA комплект (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Протеините (30 ug) се разделят чрез SDS-полиакриламидна гел електрофореза и се прехвърлят електрофоретично към поливинилиден флуоридна мембрана. Мембраната се блокира в 5% обезмаслено мляко в PBST (PBS с 0,05% Tween-20) и се инкубира при 4 ◦C за една нощ със следните първични антитела, разредени в PBST: MITF Ab (1:1000), TRP1 Ab (1:6000), TRP2 Ab (1:1000), MC1R Ab (1:500), GAPDH Ab (1:1500), тирозиназа Ab (1:2000), p-p38 Ab (1:500), p38 Ab (1:500), p-JNK Ab (1:500), JNK Ab (1:500), p-ERK Ab (1:500), ERK Ab (1:500), p-CERB Ab (1: 500) и CERB Ab (1:200), всички от Santa Cruz Biotech (Далас, Тексас, САЩ)). Свързаните антитела се откриват чрез вторично антитяло, конюгирано с пероксидаза от хрян (Amersham Corp.), последвано от система за откриване ECL (Amersham) съгласно инструкциите на производителя.

2.14. PKA инхибиторен анализ

Клетките бяха третирани с -MSH (100 nM) в продължение на 24 часа, последвано от 1 час добавяне на 10 μM от PKA регулатор H89. След третиране към клетките се добавят екстракт от семена на P. dactylifera L. (0,147 mg/mL) и Н89 и се инкубират за още 23 часа. Съдържанието на меланин се определя, както е описано по-горе.

2.15. Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с помощта на post hoc теста на Tukey, който беше използван за сравнения на измерени данни, с помощта на статистическия пакет за социални науки (SPSS) версия 22.0 статистически софтуер (SPSS Inc., Чикаго, Илинойс, САЩ). * p < 0.05="" се="" счита="" за="" значимо,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p=""><>

3. Резултати

3.1. UPLC анализ на екстракт от семена на P. dactylifera L

Резултатите от UPLC анализа са показани на Фигура 1A, B. Фигура 1A изобразява припокрития пик на екстракт от семена на P. dactylifera L. и ферулова киселина при 330 nm. Фигура 1B показва подобни спектри на сканиране между 220 и 500 nm за екстракт от семена на P. dactylifera L. и ферулова киселина.

3.2. Антиоксидантни характеристики на P. dactylifera L. Екстракт от семена

Антиоксидантната активност на екстракта от семена на P. dactylifera L. in vitro разкри наличието на антиоксидантен потенциал. В DPPH анализ, витамин С ({{0}}.05 mM; 0.53 mg/mL) и терт-бутил хидроксианизол (BHA) (0 .1 mg/mL) са използвани като положителни антиоксидантни стандарти. Капацитетът на извличане на DPPH на екстракта е 49,97 ± 2,9 процента, 81,36 ± 0.56 процента и 78,53 ± 3,83 процента от контролата за концентрациите на екстракта на 0.0{{ 31}}49, 0.0245 и 0.049 (mg/mL), съответно. За сравнение, капацитетът за почистване на витамин С и BHA е съответно 90,12 ± 0,31 процента и 90,44 ± 0,49 процента (Фигура 2А).

Този радикален катион ABTS е син на цвят и е реактивен към повечето антиоксиданти. По време на тази реакция синият ABTS радикален катион се превръща обратно в безцветната си неутрална форма. Реакцията се наблюдава спектрофотометрично. Капацитетът на ABTS плюс изчистване на екстракта е 5,69 ± 1,36 процента, 18,81 ± 0.68 процента и 66,82 ± 8,51 процента от контролата при концентрации на 0.0{{16 }}98, 0.{{20}}49 и 0.098 mg/mL, съответно. За разлика от това, ABTS плюс способността за почистване на витамин С (0,9 mg/mL) и BHA (0,9 mg/mL) са съответно 95,52 ± 0,12 процента и 40,3 ± 0,83 процента. Резултатите на Фигура 2B показват, че екстрактът от семена извлича значително количество от ABTS плюс радикала.

За да се определи общото фенолно съдържание на екстракта от семена на P. dactylifera L., като положителен стандарт се използва галова киселина (2 ug/mL). Резултатите във Фигура 2C показват, че общото фенолно съдържание в 0.0196, 0.{{20}}98 и 0. 196 (mg/mL) от екстракта са съответно 33,43 ± 2,33 процента, 117,22 ± 7,81 процента и 195,4 ± 10.91 процента. Еквивалентите на галова киселина (GAE) на гореспоменатите концентрации на екстракти от семена бяха съответно 0.068 ± 0,01, 0,365 ± 0,01 и 0,642 ± 0,03 (Фигура 2C).

3.3. Инхибиторни ефекти на екстракт от семена на P. dactylifera L. върху меланогенезата

Резултатите, показани на Фигура 4А, показват, че 0.049 mg/mL екстракт от семена на P. dactylifera L.не упражняват инхибиторен ефект върху активността на гъбичната тирозиназа. От друга страна, процентите на ензимно инхибиране са 8,34 ± 2,67 процента и 33 ± 2,36 процента от контролата за 0.245 и 0.49 mg/mLP. dactylifera L. лечение с екстракт от семена, съответно. В допълнение, процентите на инхибиране на тирозиназата на коджикова киселина (200 μM; 0.03 mg/mL) и арбутин (2 mM; 0,54 mg/mL ) са съответно 56,26 ± 5,06 процента и 64,56 ± 2,88 процента от контролата (Фигура 4А). По този начин, по-високите концентрации на екстракт от семена на P. dactylifera L. (0,245 и 0,49 mg/mL) могат да представляват инхибиторни нива на гъбена тирозиназа.

На Фигура 4B резултатите показват, че само 0.147 mg/mL екстракт от семена на P. dactylifera L. може значително да намали съдържанието на меланин в B16F10 меланомни клетки. След третиране съдържанието на меланин в клетките B16F10 е 80.66 ± 5,43 процента от това на контролата. За положителния стандарт, арбутин (0.54 mg/mL), оставащото вътреклетъчно съдържание на меланин е 61,19 ± 8,17 процента от това на контролата. Резултатите показват, че 0,147 mg/mL екстракт от семена на P. dactylifera L. показва по-малък ефект от арбутина. Останалите стойности на активността на вътреклетъчната тирозиназа са 85,1 ± 8,1 процента и 73,7 ± 11,9 процента съответно за 0,098 и 0,147 mg/mL екстракт от семена на P. dactylifera L. Останалата вътреклетъчна активност на тирозиназа е 64,3 ± 14,9 процента от контролата, след като клетките са третирани с арбутин (Фигура 4С). Резултатите показват, че по-високите концентрации на екстракт от семена на P. dactylifera L. все още показват по-малък инхибиторен ефект върху -MSH-индуцираната тирозиназна активност в B16F10 клетки, отколкото арбутин.

3.4. Екстрактът от семена на P. dactylifera L. инхибира нивата на експресия на протеини, участващи в меланиногенезата

Western blots бяха използвани за изследване на нивата на експресия на свързани с меланогенезата протеини в B16F10 клетки (Фигура 5А). Резултатите показват, че третирането с различни концентрации на екстракт от семена на P. dactylifera L. води до намалени нива на MC1R, MITF, тирозиназа, TRP1 и TRP2. Инхибиторните ефекти на екстракта върху протеиновата експресия са очевидни при концентрация от {{10}}.147 mg/mL. Кратната промяна в нивото на протеинова експресия за MC1R беше 0.74 ± 0.02; за MITF беше {{20}}.51 ± 0.03; за тирозиназа беше 0.54 ± 0.26; за TRP-1 беше 0,57 ± 0,15; и за TRP-2 беше 0,49 ± 0,1 (Фигура 5B).

Нивата на експресия на сигнални протеини, свързани с меланогенезата, бяха изследвани с помощта на Western blots (Фигура 5С). Резултатите показват, че 0.147 mg/mL третиране с екстракт от семена на P. dactylifera L. очевидно води до намалени нива на p-p38, p-JNK, p-ERK и p-CREB. Кратната промяна на нивото на протеинова експресия за p-p38 беше 0.88 ± 0.15; за p-JNK беше 0.68 ± 0.39; за p-ERK беше 0.65 ± 0.23; и за p-CREB беше 0.44 ± 0.07 (Фигура 5D).

3.5. Екстрактът от семена на P. dactylifera L. не засяга експресията на тирозиназа, TRP1, TRP2 или MITF ген

Нивата на генна експресия на протеини, свързани с меланогенезата, като тирозиназа, TRP1, TRP2 и MITF, бяха изследвани чрез количествена полимеразна верижна реакция в реално време (RT-PCR). Относителните нормализирани нива на експресия на тирозиназа/GAPDH за 0.{0367, 0.049 и 0.147 mg/mL от P. Третирането с екстракт от семена на dactylifera L. е съответно 3,51 ± 0.52, 2,38 ± 0.24 и 1,64 ± 0.55. За TRP-1/GAPDH, относителните нормализирани нива на експресия за 0.0367, 0.049 и {{4{{43} }}}.147 mg/mL от третирането с екстракт от семена на P. dactylifera L. беше 1,64 ± 0.2, 1,15 ± 0.02 и 0. 89 ± 0.07, съответно. Относителните нормализирани нива на експресия на TRP-2/GAPDH за 0.0367, 0.049 и 0.147 mg /mL екстракт от семена на P. dactylifera L. бяха съответно 1.08 ± 0.13, 0.85 ± 0.01 и 0.7 ± 0.05. За MITF/GAPDH относителните нормализирани нива на експресия за 0,0367, 0,049 и 0,147 mg/mL от третирането с екстракт от семена на P. dactylifera L. са съответно 1,48 ± 0,19, 1,03 ± 0,02 и 0,74 ± 0,05 (Фигура 6).

4. Обсъждане

Съобщава се, че меланогенезата увеличава клетъчния оксидативен стрес. В допълнение, няколко антиоксиданта, ROS акцептори, инхибитори акцептори и инхибитори могат да инхибират UV-медиирания синтез на меланин [54]. Следователно, антиоксиданти, ROS акцептори и инхибитори на меланогенезата се прилагат все повече в козметиката за избелване на кожата за предотвратяване на нежелана хиперпигментация на кожата [14]. Установено е също, че стимулирането на металотионеин, ендогенен антиоксидант, може да потисне меланогенезата в меланоцитите [55]. Човешката кожа често е изложена на окислителни замърсители от околната среда или UV светлина и се уврежда от външни фактори на околната среда. По-специално се съобщава, че UV облъчването индуцира генерирането на ROS в кожата и насърчава липидната пероксидация на клетъчната мембрана [56]. За да противодейства на оксидативния стрес, кожата е оборудвана със специални антиоксидантни системи [57].

За да се изясни антиоксидантната активност на екстракта от семена на P. dactylifera L., DPPH и ABTS плюс активността за отстраняване на радикали, общото фенолно съдържание, редуциращият капацитет и капацитетът на екстракта за хелатиране на метални йони бяха определени, както е описано по-горе [47,48]. Екстрактът от семена на P. dactylifera L. проявява значителна антиоксидантна активност във всички гореспоменати аналитични изследвания. Резултатите показват антиоксидантния потенциал на екстракта от семена на P. dactylifera L. в различни диапазони с различна ефективност. DPPH-почистващата активност на екстракта от семена, показана на Фигура 2А, е различна от тази на ABTS плюс, показана на Фигура 2В, което може да е резултат от различни механизми на взаимодействията антиоксидант-радикали. В допълнение, стехиометрията на реакциите между антиоксидантните компоненти в екстракта от семена може да варира, което води до разлика в капацитета за отстраняване на свободните радикали [58]. Потенциалните антиоксиданти в екстракта от семена на P. dactylifera L. могат да преобразуват Fe3 плюс/ферицианиден комплекс в желязна форма и редуциращият капацитет служи като индикатор за антиоксидантната активност на екстракта от семена, показан на фигура 2D. Установено е, че коджиковата киселина [59] действа като инхибитор на тирозиназата, тъй като коджиковата киселина действа като метален хелатор за хелатиране на медните йони и инхибира тези йони, навлизащи в активното място на тирозиназата. Следователно, антиоксидантите в екстракта от семена могат да образуват неразтворими метални комплекси с железни йони и след това да инхибират взаимодействието между метални йони и липиди. По-високият капацитет за хелатиране на метални йони на екстракта от семена показва неговата потенциална антиоксидантна активност и възможни инхибиторни ефекти върху активността на тирозиназата (Фигура 2E).

Принципът на анализа на вътреклетъчния ROS е, че DCFH-DA дифундира през клетъчната мембрана и се ензимно хидролизира до DCFH от естераза; тогава DCFH реагира с ROS (като H2O2), за да се получи DCF. Бързото повишаване на DCF показва окисление на DCFH от вътреклетъчни радикали [60]. Идеята зад търсенето на нови антиоксиданти за дейности по избелване на кожата се крие в хипотезата, че оксидативният стрес в резултат на UV лъчение може да допринесе за стимулиране на синтеза на меланин. Съобщава се, че UV облъчването произвежда ROS в кожните тъкани, което може да индуцира производството на меланин чрез активиране на тирозиназа [61]. Освен това се съобщава, че няколко агента за избелване на кожата могат да инхибират меланогенезата чрез взаимодействие с медни йони в активното място на тирозиназа или с о-хинони, за да блокират полимеризацията на междинните продукти в пътя на синтеза на меланин [62]. Освен това, витамин С или витамин Е може да намали окисляването на вече съществуващи меланинови частици. Следователно тези витамини са широко използвани в продукти за избелване на кожата [63]. Интересното е, че нашите резултати демонстрират антиоксидантните характеристики на екстракта от семена на P. dactylifera L., което показва, че екстрактът от семена на P. dactylifera L. може да действа като избелваща кожата съставка в козметиката.

МТТ анализът е добре известен колориметричен анализ, който измерва активността на клетъчните NADH/NADPH-зависими оксидоредуктазни ензими, които редуцират МТТ до лилаво оцветени формазанови багрила. Този анализ може да се приложи за изследване на потенциалната цитотоксичност на лекарствени агенти и токсични материали, тъй като тези агенти повишават или инхибират клетъчната жизнеспособност. Резултатите, показани на Фигура 3A, са в съответствие с тези от анализа за изключване на Trypan blue на Фигура 3B, което показва, че екстрактът от семена на P. dactylifera L. няма цитотоксичен ефект върху жизнеспособността на меланомните клетки B16F10.

Гъбената тирозиназа обикновено се използва като целеви ензим за скрининг на потенциални инхибитори на меланогенезата. Първо беше установено, че диапазонът на дозиране ({{0}}.049–0,49 mg/mL) на екстракта от семена на P. dactylifera L. може да инхибира активността на тирозиназата на гъбите. Резултатите, показани на Фигура 4А, показват, че екстрактът от семена показва по-слабо инхибиторно въздействие върху активността на тирозиназата на гъбите, отколкото коджиковата киселина. Тирозиназата играе основна роля в първите две стъпки от пътя на меланогенезата. За да се изясни истинският инхибиторен ефект на екстракта от семена на P. dactylifera L. върху производството на меланин, бяха определени съдържанието на меланин B16F10 и вътреклетъчната тирозиназна активност. Резултатите, представени на Фигура 4B, показват, че по-висока концентрация на екстракт от семена на P. dactylifera L. упражнява очевиден инхибиращ ефект върху образуването на меланин. Данните показват, че екстрактът от семена на P. dactylifera L. наистина блокира меланогенезата в клетките на меланома. С това резултатите, представени на фигура 4C, бяха в съответствие с резултатите, показани на фигура 4B. В гореспоменатите клетъчни експерименти -MSH се използва като индуктор за стимулиране на синтеза на меланин. Съобщава се, че -MSH свързва рецептора на меланокортин 1 (MC1R) и активира вътреклетъчната аденилат циклаза, която от своя страна катализира ATP до cAMP и активира cAMP-зависимата PKA. Резултатите във Фигура 5А разкриват, че екстрактът от семена на P. dactylifera L. инхибира експресията на MC1R, като по този начин блокира производството на меланин, индуцирано от -MSH медиирано вътреклетъчно регулиране нагоре на cAMP. Освен това, cAMP-медиираният PKA сигнален път е инактивиран и меланогенезата е инхибирана. За да потвърдим заключението, ние проведохме експерименти с PKA инхибитора и данните, показани на Фигура 4D, показват, че инхибиторният ефект на екстракта от семена на P. dactylifera L. (0,147 mg/mL) върху меланогенезата в B16F10 клетки е потиснат от H{{ 24}}лечение. H89 (N-[2-p-бромоцинамиламино-етил]-5-изохинолинсулфонамид) е селективен и мощен инхибитор на PKA. Резултатите показват, че cAMP-медиираната PKA сигнализация е повлияна от екстракт от семена на P. dactylifera L.

Тирозиназата, TRP1 и TRP2 са трите основни ензима, които регулират синтеза на меланин в клетките на бозайниците [64]. Освен това MITF е основният транскрипционен регулатор на тирозиназа, TRP1 и TRP2 и е най-важният регулатор на пигментацията на меланоцитите [65]. Резултатите на Фигура 5А показват, че екстрактът от семена на P. dactylifera L. намалява нивата на експресия на протеини на тези протеини, свързани с меланогенезата, инхибира активността на тирозиназата и намалява съдържанието на меланин в клетките B16F10.

В това проучване екстрактът от семена на P. dactylifera L. потиска фосфорилирането на CREB и активирането на PKA. Тези данни предполагат, че пътят на cAMP-PKA може да е отговорен за антимеланогенезата, индуцирана от екстракт от семена на P. dactylifera L. (Фигура 5C).

Съобщава се, че MAPK модулират меланогенезата [66]. Семейството MAPK включва три типа протеин кинази, включително екстрацелуларна реагираща киназа (ERK), c-Jun N-терминална киназа (JNK) и p38 MAPK. p38 MAPK може да активира свързващия протеин на отговорния елемент на cAMP (CREB и CREB активира експресията на MITF, което допринася положително за синтеза на меланин [67]. Резултатите на фигура 5C предоставят доказателство, че екстрактът от семена на P. dactylifera L. може да инактивира CREB, JNK и p38, от своя страна, инхибират експресията на MITF (Фигура 5А). Тези резултати предполагат, че индуцираният от екстракта от семена dactylifera L. антимеланогенен ефект може да бъде медииран от регулиране надолу на пътищата на PKA. Освен това се съобщава, че облъчването с ултравиолетова светлина играе имат забележимо място в началото на няколко кожни заболявания, включително лющене, набръчкване и хиперпигментация [68] Резултатите предполагат, че екстрактът от семена на P. dactylifera L. намалява производството на меланин, което може да се дължи на изчерпването на вътреклетъчните ROS.

За да оценим ефекта на екстракта от семена на P. dactylifera L. върху производството на клетъчен меланин, ние определихме нивата на mRNA в клетки B16F10, третирани с -MSH и екстракт от семена на P. dactylifera L. Третираните с -MSH клетки показват повишени нива на MITF, тирозиназа, TRP-1 и TRP-2, както се очакваше. Интересното е, че клетките, третирани с екстракт от семена на P. dactylifera L., показват намаляване на експресията на иРНК на тези гени, свързани с меланогенезата. Въпреки това, не съществува статистически значима разлика между колоните, което показва, че екстрактът от семена на P. dactylifera L. не влияе върху нивата на генна експресия на MITF, тирозиназа, TRP1 и TRP2.

Това е нашият продукт.

За повече информация, моля, щракнете тук.

Съобщава се, че основната фенолна киселина, открита в семената на P. dactylifera L., е феруловата киселина [69]. Доказано е, че феруловата киселина ефективно инхибира синтеза на меланин в меланомни клетки B16 чрез инхибиране на индуцираното от казеинкиназа 2- фосфорилиране на тирозиназа по дозозависим начин [70]. Тези доклади подкрепят нашите резултати, показани на Фигура 1 – феруловата киселина във водния екстракт от семена на P. dactylifera L. допринася за инхибирането на меланогенезата в клетки B16F10. Разбира се, други функционални компоненти в екстракта от семена трябва да бъдат изследвани в близко бъдеще.

Нашите резултати показват, че екстрактът от семена на P. dactylifera L. инхибира меланогенезата в клетките B16F10 чрез понижаване на PKA сигналните пътища. Следователно, екстрактът от семена на P. dactylifera L. може да се използва като ефективен агент за избелване на кожата.

5. Изводи

Това е първият доклад за механизма на действие на водния екстракт от семена на P. dactylifera L. при синтеза на меланин. Настоящото проучване демонстрира участието на cAMP/PKA/CREB пътя в депигментиращия ефект на екстракта от семена на P. dactylifera L. Нашите резултати показват, че екстрактът от семена на P. dactylifera L. инхибира меланогенезата в клетките B16F10 чрез понижаване на PKA сигналните пътища. Следователно, екстрактът от семена на P. dactylifera L. може да се използва като нов дерматологичен антимеланогенезен агент и ефективен агент за избелване на кожата.