Фоточувствителни пролекарствени наносглобки, съдържащи химиотерапевтична латентна функция, потенцират имунотерапията на рака
Dec 25, 2023
Резюме
Имунотерапията, комбинирана с ефективни терапевтични средства като химиотерапия и фотодинамична терапия, е успешна стратегия за активиране на противотуморни имунни отговори за подобрено противораково лечение. Въпреки това, разработването на мултифункционални биоразградими, биосъвместими, нискотоксични, но високоефективни и клинично достъпни трансформирани нано-имуностимуланти остава предизвикателство и е в голямо търсене. Тук докладваме и проектираме ново фотохимиотерапевтично нано-пролекарство COS-BA/Ce6 NPs без носители чрез комбиниране на три мултифункционални компонента, самосглобена естествена малка молекула бетулинова киселина (BA), водоразтворим хитозанов олигозахарид (COS), и ниско токсичен фотосенсибилизатор хлорин е6 (Ce6) за увеличаване на антитуморната ефикасност на имунната адювантна анти-PD-L1-медиирана имунотерапия на рак. Ние показваме, че проектираните нанолекарства притежават интелигентна и отличителна характеристика на "покой" в химиотерапевтичния ефект с желана по-ниска цитотоксичност и множество благоприятни терапевтични характеристики, включително подобрено генериране на 1 O2, предизвикано от намалената енергийна празнина на Ce6, реакция на pH, добра биоразградимост и биосъвместимост, осигуряваща високоефективна, синергична фотохимиотерапия. Освен това, когато се комбинира с анти-PD-L1 терапия, както химиотерапията, базирана на нано-сглобяване, така и химиотерапията/фотодинамичната терапия (PDT) могат ефективно да активират антитуморен имунитет при лечение на първични или отдалечени тумори, отваряйки потенциално привлекателни възможности за клинична имунотерапия.
Ползи от cistanche tubulosa-антитуморен
КЛЮЧОВИ ДУМИ
Имунотерапия на рак; Нано-имуностимуланти; Химиотерапевтичен латентност; Пролекарство; Самосглобяване; Естествена малка молекула; бетулинова киселина; Фотодинамична терапия
1. Въведение
Имунотерапията на рака, като стратегията за блокада на имунната контролна точка, използваща PD-L1 или CTLA-4 за борба с рака чрез активиране на имунната система на гостоприемника, несъмнено е революционизирала лечението на рака1,2. За съжаление, слабият имунен отговор и неефективните терапевтични ефекти значително ограничават неговите клинични перспективи3,4. Наскоро настоящи проучвания разкриха, че комбинация от имунотерапия с други модалности като химиотерапия5, фотодинамична терапия (PDT)6, фототермална терапия (PTT)7 и лъчетерапия8, може ефективно да предизвика антитуморна имуногенност чрез индуциране на раковите клетки да претърпят имуногенна клетъчна смърт ( ICD)9, което предполага потенциала на имунната модулация за активиране на антитуморни имунни отговори. Многобройни иновативни дизайни на наноматериали, базирани на тези синергични комбинации от имунотерапевтични стратегии, са постигнали значително подобрена противоракова активност, включително неорганични10, полимерни11 и биомиметични12 наночастици (NP). Въпреки това, разработването на мултифункционални биоразградими, биосъвместими, нискотоксични, но високоефективни и клинично налични трансформирани нано-имуностимуланти остава голямо предизвикателство и огромно търсене. Естествени биологични материали като нуклеинови киселини 13, протеини 12, пептиди 14, 15 и малки молекулярни природни продукти 16, 17 поради присъщите им предимства (напр. биосъвместимост, нетоксичност) предизвикаха значителен изследователски интерес за медицински приложения. Особено през последните години бяха открити последователно противоракови биоактивни терпеноидни естествени малки молекули (NSM), притежаващи функция за самосглобяване 18, 19. Например бетулиновата киселина (BA), ергостеролът (ET) и абиетиновата киселина (AA) могат да се самосглобяват в микронни или наноструктурирани частици. Тези NSMs са привлекателни градивни елементи за използване за разработване на антитуморни агенти за синергична химиотерапия и PDT. Доказано е, че те показват значителни ползи от лесно нано производство, по-добра биосъвместимост и биоразградимост, по-ниска токсичност с намалено увреждане на черния дроб и висок синергизъм в антитуморната терапия20e23. Това предоставя обещаващи алтернативи за разработване на клинично налични преводими нано-имуностимуланти за синергична имунотерапия. Въпреки това, като цяло по-силната липофилност на тези NSM води до неефективна клетъчна ендоцитоза, която отслабва тяхната противоракова активност и ограничава тяхната клинична стойност за лечение на рак24. Подобно на често съобщаваните нанокомпозити, съответните наноформулировки на NSM насърчават клетъчното усвояване, за да подобрят химиотерапевтичните ефекти, но също така по невнимание повишават риска от неспецифична цитотоксичност към нормалните клетки22. Следователно, как да се увеличи максимално противораковата ефикасност на терпеноидните NSM наноагенти, като същевременно се минимизира неговата токсичност за нормалната тъкан, си струва да се обмисли дълбоко като решаващ въпрос в процеса на синергична имунотерапия.
Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система
Стратегиите за пролекарство са широко прилагани за подобряване на клетъчното усвояване на липофилни малки молекули чрез увеличаване на хидрофилността25. Като цяло, амфифилните лекарства притежават по-висока ефективност на клетъчно усвояване от хидрофилните или липофилните лекарства26. Колкото по-висока е клетъчната фагоцитоза, толкова по-добра е терапевтичната ефикасност24. По този начин разработването на амфифилни терпеноидни NSMs пролекарствени молекули може да бъде потенциален метод за максимизиране на техните терапевтични ефекти. В допълнение, нанолекарствата, реагиращи на стимули към специфичната туморна микросреда (напр. киселинна, редокс реакция) имат голямо обещание за контролиране на освобождаването на лекарства, което е полезно при потискане на цитотоксичността на химиотерапевтичните лекарства 27, 28. Междувременно супрамолекулното сглобяване (напр. подход на повторно утаяване) беше ефективна стратегия за приготвяне на силно водоразтворими нанолекарства без носители 22, 29, които може да се очаква леко да намалят ефективността на фагоцитозата на амфифилните NSMs до известна степен, като по този начин отслабват техните предварителни проектирана цитотоксичност. Ние предполагаме, че реагиращите на стимули и напълно хидрофилни нанолекарства са допълнително установени на базата на пролекарство на амфифилни NSMs и могат ефективно да потискат неговата неспецифична цитотоксичност към нормалните клетки, като същевременно стимулират освобождаването на силно токсични амфифилни NSMs в туморни клетки, улеснявайки тяхното латентност в нормалните тъкани и активиране в мястото на тумора. Важно е да се избере подходящият водоразтворим и реагиращ на стимули прекурсор за модифициране на терпеноидни NSMs за получаване на амфифилни пролекарствени молекули. В продължение на години, хитозановите олигозахариди (COS), като разградените продукти на хитозана, не само имат добра разтворимост във вода и изобилие от eOH oreNH2 групи, които водят до добър отговор на рН, но също така имат полезни антитуморни действия чрез засилване на имунната функция на гостоприемника чрез регулиране на активността на имунни клетки като моноцитни макрофаги и лимфоцити30,31. Те гарантират огромната възможност за конструиране на целеви нано имуностимуланти, реагиращи на стимули, за синергична имунотерапия.
Тук, въз основа на горните съображения, в нашия експериментален дизайн, пентацикличен тритерпенов NSMs на бетулинова киселина (BA) се използва като мощно противораково средство32, COS беше въведен за синтезиране на амфифилна COS-BA молекула за подобряване на химиотерапевтичния ефект. Chlorin e6 (Ce6), широко използван фотосенсибилизатор с много ниска/без тъмна токсичност33, беше използван за конструиране на напълно водоразтворими без носители фоточувствителни пролекарства COS-BA/Ce6 NP, използвайки стратегия за директно съвместно сглобяване. COS-BA/Ce6 NP комбинират два терапевтични модалности, химиотерапия и фотодинамична терапия (PDT), които могат ефективно да увеличат представянето на туморни антигени към Т клетките, генерирайки стабилни имунологични отговори с помощта на имунен адювант анти-PD-L1 да предизвика високоефективна и синергична антитуморна химиотерапия/PDT/имунотерапия (Схема 1). Проектираните COS-BA/Ce6 NPs показаха интелигентна латентна функция с коварни химиотерапевтични ефекти, т.е. необлъчените съвместно сглобени NPs показаха забележително инхибирана in vitro цитотоксичност в сравнение с амфифилната COS-BA, независимо дали срещу рак или нормални клетки. Като се приписва на отличителното реагиращо на pH поведение, той има ниска токсичност и биобезопасност за нормалната тъкан in vivo, но е силно токсичен за туморната тъкан поради стимулиращото освобождаване на хиперактивен COS-BA в слабо киселинната туморна микросреда34. Доколкото ни е известно, понастоящем все още рядко се съобщава за проектираните нано лекарства, притежаващи тази химиотерапевтична функция на латентност. Междувременно, нанолекарството има множество благоприятни терапевтични характеристики като подобрено генериране на 1 O2 чрез намаляване на енергийната празнина (DEST) на Ce6, бърз биологичен метаболизъм и повишено натрупване на тумори, което доведе до ефективна и безопасна антитуморна комбинация от химиотерапия и PDT лечение. По-важното е, че както химиотерапията, базирана на NP, така и системите за химиотерапия/PDT могат ефективно да активират антитуморен имунитет чрез улесняване на пролиферацията на TNF-a и IFN-g-продуциращи CD8þ Т клетки в първични или отдалечени тумори. Предложеното от нас биоразградимо, биосъвместимо, уникално латентно, биобезопасно и високоефективно фотохимиотерапевтично нанолекарство постига значителни системни имунни терапевтични отговори, отваряйки атрактивни възможности за клинично приложение при лечение на отдалечен или метастатичен рак.
Схема 1 PDT и химиотерапия на съвместно сглобени COS-BA/Ce6 NPs потенцират анти-PD-L1 за индуциране на системна антитуморна имунотерапия. Въвеждането на водоразтворим COS може ефективно да подобри химиотерапевтичната активност на BA (изобразен като половин меч), което води до хиперактивно COS-BA амфифилно пролекарство (дълъг меч). Когато са сглобени съвместно с фотосенсибилизатор Ce6 (ножница), структурираните като черупка и pH-чувствителни нано-сглобки имаха интелигентна и отличителна функция на „покой“ с инхибирана химиотерапевтична токсичност към нормалните тъкани. Но след като пристигне и бъде стимулиран от киселинната (Hþ) туморна микросреда, силно активното амфифилно пролекарство COS-BA ще бъде освободено, което ще доведе до значителна химиотерапия. В допълнение, конструираните ко-сглобки показват отлична PDT активност с повишено генериране на синглетен кислород (1 O2), предизвикано от намалената енергийна празнина между синглетните и триплетните възбудени състояния (DEST) на Ce6. В комбинация с анти-PD-L1 блокада на контролна точка, освобождаването на тумор-асоциирани антигени след химиотерапия/PDT лечение може ефективно да активира системен антитуморен имунен отговор за имунотерапия на отдалечен рак.
2. Материали и методи
2.1. Синтез на COS-BA
Бетулинова киселина (40 mg, 0.1 mmol), EDC (38 mg, 0.2 mmol) и NHS (17 mg, 0.15 mmol ) се разтварят в 3 mL N,N-диметилформамид (DMF). След разбъркване при стайна температура в продължение на 3 0 минути, 96 mg воден разтвор на COS (1 mL) се добавят внимателно на капки към сместа и се разбъркват в продължение на 24 часа. След това реакционната смес се разрежда с CH2CI2 и се екстрахира многократно. Слоят CH2CI2 се изпарява и пречиства върху колона със силикагел. Нереагиралата ВА се отстранява първоначално с помощта на петролев етер: ацетон (5:1, v/v) като елуент и след това се променя на 3:1, за да се получи бял COS-BA (добив: 42%), където COS се идентифицира като димер ( n Z 2). 'Н NMR (40{{70}} MHz, CDC13) d: 8.98 (1H, s, BA-28 O] CeNH), 4.73 (1H, s, H -29a), 4.60 (1H, s, H-29b), 3.18 (1H, dd, JZ 4.8, 10.8 Hz, H-3), 2.95e3.93 (8H, m, COS), 2.64 (3H, s, CH3eCOS), 0.76 (3H, s, H-24), 0.83 (3H, s, H-25), 0.90 (3H, s, H{ {69}}), 0,97 (3Н, s, Н-26), 0,98 (ЗН, s, Н-27), 1,70 (ЗН, s, Н-30). 13C NMR (100 MHz, CDC13) d: 179.18 (CO, COS), 156.43 (C- 28), 150.97 (C-20), 109.03 (C-29), 78.74, 77.04 , 69.32, 69.22, 65.25, 58.14, 55.62, 55.21, 53.65, 53.22, 50.52, 45.96, 44.32,44.11, 41.85, 40.59, 38.68, 38.55, 37.32, 37. 04, 36.39, 35.31, 34.21, 31.81, 31.54, 31.17, 30.28 , 29.09, 27.80, 27.22, 25.74, 25.53, 20.91, 19.48, 18.12, 16.02, 15.87, 15.17, 14.65, 14.62. ESIeMS m/z: 814.5871 [M-6H] (C44H72N2O12).
2.2. Получаване на COS-BA/Ce6 NPs
Съвместно сглобени COS-BA/Ce6 NPs бяха приготвени чрез едноетапен метод на повторно утаяване. Обикновено първо се смесват 5 mL Ce6 (33 mmol/L) и 40 mL COS-BA (33 mmol/L) DMSO разтвори. Впоследствие сместа се инжектира бързо в 1 mL вода, съдържаща 10 mL NaOH (50 mmol/L) при ултразвук (KQ-250E, ShuMei, Kunshan, Китай). След обработка с ултразвук в продължение на 10 минути, COS-BA/Ce6 NPs бяха получени чрез центрофугиране при 13,000 rpm (TGL-16G, Xiangyi, Changsha, Китай) в продължение на 25 минути. Други състави с различни съотношения на COS-BA към Ce6 бяха получени по същата процедура с постоянно моларно съотношение на NaOH към Ce6 от 3:1.
2.3. Клетъчни линии
Човешки MCF-7, HepG2, LO2 и миши 4T1, L929 клетъчни линии се предоставят от Института по биохимия и клетъчна биология, SIBS, CAS (Китай). MCF-7, HepG2 и LO2 се култивират в DMEM среда с 10% фетален говежди серум (FBS, Gibco) и 1% пеницилин-стрептомицин антибиотик (Life Technology, САЩ) при 37°C. 4T1 и L929 се култивират в RMPI-1640 среда със същото съотношение като по-горе.
2.4. Клетъчно поемане и изследвания на ендоцитни пътища
За изследване на клетъчното поемане, 4T1 или LO2 клетки се инкубират със свободни Ce6 или COS-BA/Ce6 NPs (еквивалентна концентрация на Ce6: 1,7 mg/mL, COS-BA: 19,5 mg/mL, BA: 10 .8 mg/mL) за различно време. След промиване, фиксиране и оцветяване с DIPA (#D9542, Sigma), клетките бяха изобразени под флуоресцентен обърнат микроскоп (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Чанчун, Китай). Интензитетът на флуоресценция се определя с помощта на поточна цитометрия, използвайки мини системата Guava EasyCyte (Merck Millipore, Германия). За количествено определяне на ефективността на поглъщане, клетъчното натрупване на BA и COS-BA се измерва с помощта на HPLC (Agilent 1200, САЩ). Обикновено 4T1 клетките се третират със свободен COS-BA или BA (еквивалентен BA: 25 mg/mL) за 0,5 и 3 часа. След промиване с PBS, клетъчните пелети се събират и се подлагат на ултразвукова хомогенизация (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Ningbo, Китай) за клетъчен лизис. След това COS-BA или BA се екстрахират с хлороформ за HPLC анализ след лиофилизиране на пробите. Подвижната фаза беше вода (0,2% фосфорна киселина) и ацетонитрил при скорост на потока 1,0 mL/min и съответните обемни съотношения бяха 60:40 и 15:85 (v/v) за анализ на COS-BA и BA, съответно . Дължината на вълната на детекция е 213 nm. За изследване на ендоцитни пътища на COS-BA/Ce6 NPs, 4T1 клетки се посяват в 6-плаки с ямки и се инкубират за 24 часа преди да бъдат предварително третирани с различни инхибитори на ендоцитозата за 30 минути, включително инхибитор на микропиноцитоза [50 mmol/L , етил изопропил амилорид (EIPA) (#N132356, Aladdin)], клатрин-медииран инхибитор на ендоцитоза [20 mmol/L, хлорпромазин (#C7010, Solarbio)], caveolae-медииран инхибитор на ендоцитоза [25 mmol/L, нистатин ( #IN0260, Solarbio)] и инхибитор на подкисляването на лизозома [50 mmol/L, хлорохин фосфат (#C9720, Solarbio)]35. След това клетките бяха допълнително култивирани с 2 mL COS-BA/Ce6 NPs (Ce6: 1.7 mg/mL, COS-BA: 19.5 mg/mL) в продължение на 2 часа и изобразени под FIM (UP Optotech). Клетките, инкубирани без ендоцитен инхибитор при 37°С, бяха определени като контрола и при инкубация при ниска температура (4°С) за оценка на зависимата от енергията ендоцитоза. Междувременно, средният интензитет на флуоресценция на клетките също се определя чрез поточна цитометрия.
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity
【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2.5. Анализ на цитотоксичност
4T1 клетки се посяват в 96-ямкова плака. След това клетките бяха третирани с различни концентрации на COS-BA NPs в продължение на 24 часа. След това към ямката се добавя 10 mL багрило MTT (#M158055, Aladdin) (5 mg/mL) и се инкубира за още 4 часа, след което се добавят 150 mL DMSO за разтваряне на кристалите формазан . Абсорбцията на всяка ямка при 492 nm се записва от четец на микроплаки. За групата на облъчване, клетките се третират с лекарства в продължение на 4 часа, след това се облъчват в продължение на 10 минути с 675 10 nm светлина и се инкубират за допълнителни 20 часа. Цитотоксичността на COS-BA/Ce6 NP (1 mg/mL Ce6 съответства на 11,5 mg/mL COS-BA и 6,4 mg/mL BA) срещу други клетки (MCF-7, HepG2, LO2 и L929) също бяха определени чрез същия МТТ анализ само с различна среда. Междувременно индексът на комбинацията беше изчислен от софтуера CompuSyn 2.0, използвайки изчислението на теоремата на Chou Talalay36.
2.6. Модели на животни
Всички експериментални процедури бяха изпълнени съгласно протоколите, одобрени от Комитета за грижа и използване на животните към Харбинския медицински университет. 4T1 клетки се суспендират в среда RMPI-1640 и се инжектират подкожно в десния гръб на всяка женска мишка BALB/c (18e22 g, на възраст 6e7 седмици).
2.7. In/ex vivo флуоресцентно изображение
200 mL COS-BA/Ce6 NPs 5% разтвор на глюкоза (еквивалентен Ce6: 0,35 mg/mL, COS-BA: 4,02 mg/mL) се инжектира през вената на опашката в мишки, носещи тумор. След това се извършва флуоресцентно изобразяване на туморни места в предварително определено време, като се използва AniView 100/600 мултимоделна in vivo система за изображения на животни (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., Китай) с възбуждане при 630 nm. След 24 часа след инжектирането, основните органи (сърце, черен дроб, далак, бял дроб и бъбрек) и туморът бяха събрани за ex vivo флуоресцентно изобразяване. Освен това бяха оценени и ex vivo флуоресцентни изображения на тумори и основни органи в различно време след iv инжекции на Ce6 или COS-BA/Ce6 NPs.
2.8. In vivo химиотерапия/PDT
4T1-носещи мишки (75e100 mm3 ) са разделени на случаен принцип в шест групи (n Z 5): 1) 5% разтвор на глюкоза; 2) Ce6; 3) Ce6 с облъчване; 4) COS-BA (40,2 mg/kg, където BA: 22,3 mg/kg); 5) COS-BA/Ce6 NPs; 6) COS-BA/Ce6 NP с облъчване. За всяка група мишките се инжектират с 200 mL COS-BA/Ce6 NP (еквивалент на Ce6: 3,5 mg/kg от тялото) през опашната вена на дни 0, 2 и 4. За групите на облъчване, на 4 часа след инжектиране след всяко приложение, всички мишки бяха анестезирани с изофлуран и туморните места бяха облъчени с 675 10 nm (150 mW/cm2) светлина за 15 минути. Обемът на тумора и телесното тегло на мишките също се записват през ден. Обемите на тумора се изчисляват по формулата: VZ ширина2 дължина/2. След 14 дни лечение, туморите бяха изрязани и претеглени, за да се изчисли коефициентът на инхибиране на тумора (TIR) чрез често използваното уравнение: TIRZ (1 проба/контрола) 100%. Където пробата и контролата са средното тегло на тумора на всяка третирана група и групата с 5% воден разтвор на глюкоза, съответно.
2.9. In vivo химиотерапия/PDT/имунотерапия
За да се демонстрира потенциалът на COS-BA/Ce6 NPs, комбиниран с имунотерапия, двустранният туморен модел е проектиран чрез подкожно инжектиране на 4T1 клетки в левия и десния хълбок. Когато туморите достигнаха 75e100 mm3, мишките бяха разделени на пет групи. (1) Контрол; (2) COS-BA/ Ce6 NPs (COS-BA Z 40,2 mg/kg, където BA Z 22,3 mg/kg); (3) COS-BA/Ce6 NPs þ светлина; (4) COS-BA/Ce6 NPs þ анти-PDL1; (5) COS-BA/Ce6 NPs þ анти-PD-L1 þ светлина. На Ден 0, 200 mL 5% разтвор на глюкоза (Група 1) или COS-BA/Ce6 NPs (Ce6 Z 3,5 mg/kg) (Група 2, 3, 4, 5) бяха инжектирани iv в мишки. След 4 часа след инжектирането, десните тумори от групи 3 и 4 бяха облъчени в продължение на 15 минути. Мишките се анестезират с изофлуран и се търкалят на една страна, за да се избегне излагането на левите тумори. След това анти-PD-L1 антитяло (BioXcell, номер на продукта: BE0101, номер на клонинг: 10F.9G2) се инжектира iv в мишки за групи 4 и 5 на дни 2, 4 и 6 (15 mg на мишка на инжекция). Дължината и ширината на всеки тумор се наблюдават през ден. След 14 дни лечение, кръвният серум от мишки беше събран за оценка на интерферон-гама (IFN-g) (#KMC4021) и фактор на туморна некроза (TNF-a) (#BMS607-3) с помощта на ELISA анализ (eBioscience ). Туморите се събират, дисоциират, третират се с буфер за лизис на червени кръвни клетки и се промиват с PBS чрез центрофугиране. След това клетъчната суспензия се оцветява с анти-CD3-FITC (#MA1-10187, клон 145-2C11, eBioscience) и анти-CD8a-PE (#12-0081-85, клон 53-6.7, eBioscience). След това инфилтрацията на цитотоксични Т лимфоцити (CTL) в десния и левия тумор след различни лечения беше оценена чрез поточна цитометрия.
3. Резултати и обсъждане
3.1. Синтез, производство и характеризиране на COS-BA/Ce6 NPs
В това проучване ние проектираме нова пролекарствена малка молекула COS-BA на базата на водоразтворим хитозанов олигозахарид (COS), който може да повиши химиотерапевтичната активност на пентацикличната тритерпенова бетулинова киселина (BA) чрез подобряване на клетъчното усвояване чрез увеличаване на хидрофилността. COS (степента на полимеризация, DP: 2e6), използвана тук, е получена по описания по-горе метод30. След това COS-BA се синтезира чрез реакция на кондензация на дехидратация. В комбинация с анализа на главния компонент на COS, химическата структура на COS-BA се смяташе за дизахарид (DP:2) модифициран BA (Подкрепяща информация Фиг. S1), което беше потвърдено от 1Н NMR, 13C NMR и ESIeMS (Поддържаща информация Фиг. S2eS4). Анализът на представителния 1Н NMR показа отчетливия протонен сигнал на COS около 2.64e3.93 ppm и C]CH2 пикове (4.60, 4.73 ppm) на BA, демонстрирайки успешния синтез на COS-BA (фиг. 1A). За приготвянето на съвместно сглобения синергичен антитуморен реагент COS-BA/Ce6 NPs беше използван многостранен подход за повторно утаяване чрез сътрудничество с високоефективен фотосенсибилизатор Ce6. Чрез промяна на първоначалните моларни съотношения и двете формули за съвместно сглобяване на COS-BA/Ce6 могат да образуват сферични наноструктури с модулирани размери (Фиг. 1B и поддържаща информация Фиг. S5). При различни входни съотношения на COS-BA/Ce6, хидрофилните диаметри на COS-BA/Ce6 NP са близо 200e300 nm с отрицателен z-потенциал. Като се има предвид, че NPs, приготвени във формулировка 8: 1, показват по-нисък индекс на полидисперсност (PDI, 0.143) с относително по-малък размер (249 nm), достатъчно количество химиотерапевтично средство COS-BA също е необходимо за комбинаторното лечение. Затова избрахме формулировките на COS-BA/Ce6 (8:1) за следващото изследване. При тази оптимизация, COS-BA/Ce6 NPs показват тясно разпределение на размера (Фиг. 1C) и добра разтворимост във вода, което показва неговата колоидна природа (Фиг. 1D). За да се изследват причините зад това успешно съвместно сглобяване, поведението на първичното самосглобяване на свободния COS-BA беше изследвано с помощта на сканираща електронна микроскопия (SEM) (Фиг. 1E), което предполага, че COS-BA може да образува силно еднородна нано- сфера на w168 nm, което означава, че химическата модификация на COS не променя способността за самосглобяване на самата BA (подкрепяща информация, фиг. S6). Това е това свойство, което в крайна сметка предизвиква успешната конструкция на съвместните сглобки. Трябва да се отбележи, че освен твърдата наноструктура, потвърдена чрез трансмисионна електронна микроскопия (TEM), COS-BA/Ce6 NPs показаха различни COS-BA NPs без структура на черупката и средната дебелина на обвивката беше приблизително 2,35 nm. Другата физикохимична характеристика е обобщена на Фиг. 1F. Освен това, COS-BA/Ce6 NPs показват отрицателен z-потенциал от 5.38 mV и хидродинамичен размер от w249 nm, по-висок от този, получен от SEM (w182 nm). Едновременно с това ефективността на зареждане и капсулиране на Ce6 е съответно 8,1 и 96%, както е определено чрез високоефективна течна хроматография (HPLC). Също така, данните от FT-IR (фиг. 1G) допълнително потвърждават това съвместно сглобяване, тъй като COS-BA/Ce6 NPs показват характерните C]N, CeN и C]CH пикове на Ce6, появяващи се при 1633, 1078 и 633 cm 1 , съответно.
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
3.2. Механизъм за съвместно сглобяване и формиране на структурата на черупката
Впоследствие, за да разберем по-добре механизма на съвместно сглобяване, първо изследвахме процеса на първично образуване на NP. Ние открихме, че съвместното сглобяване на COS-BA с Ce6 може да бъде спонтанно, тъй като тези два вида могат също да образуват сферична наноструктура, дори и без ултразвук (Подкрепяща информация Фиг. S7), което може да се дължи на отрицателната промяна на свободната енергия на Гибс (DG ) в съвместни монтажи37. Това спонтанно сглобяване също предполага по-силно междумолекулно взаимодействие между COS-BA и Ce6. Като цяло, междумолекулните взаимодействия в надмолекулните самостоятелни (или ко-) сглобки са нековалентно p‒p-подреждане, водородни връзки и сили на Ван дер Ваалс 38,39. За този анализ след това изследвахме UV абсорбцията на COS-BA/Ce6 NP (фиг. 1H и F), което предполага червено изместени Soret (410 nm) и Qy (667 nm) ленти в сравнение с свободен Ce6 (съответно 405 и 665 nm). Междувременно може да се открие и значителната червено-изместена характерна абсорбция на COS-BA, което показва възможно междумолекулно натрупване на pp между COS-BA и Ce640. Нещо повече, след инкубиране с повърхностно активното вещество натриев додецил сулфат (SDS, 0,2% w/v) (Подкрепяща информация Фиг. S8), COS-BA/Ce6 NPs показаха ново изместена в синьо Qy лента при 641 nm и драстично възстановена флуоресценция, демонстрирайки че хидрофобните взаимодействия също са допринесли за съвместното сглобяване28. Тъй като тези асоциативни нековалентни взаимодействия, съвместните сглобки показват забележително потушаване на флуоресценцията (98,2%) във вода (фиг. 1I). Като цяло е разумно да се вярва, че p-p подреждането и хидрофобните взаимодействия могат да бъдат основните движещи сили за изграждането на съвместни сглобки. След това, за по-нататъшно визуализиране на процеса на сглобяване по-интуитивно и разкриване на основните причини, поради които могат да се образуват структурирани с черупки NP, ние изпълнихме опростен симулационен модел на молекулярна динамика (MD), съдържащ 16 оптимизирани COS-BA молекули и допълнителни две Ce6 във водна кутия . Първоначално оценихме възможното взаимодействие/свързване на самосглобяванията на COS-BA в рамките на 5 ns време на симулация (Фиг. 2A и поддържаща информация Фиг. S9). Ние открихме, че с изключение на многобройни вътрешномолекулни водородни връзки в COS фракцията, няколко двойки междумолекулни Н-връзки между COS-BA също могат да бъдат наблюдавани (Фиг. 2B и поддържаща информация Фиг. S10), което показва, че водородното свързване може да бъде едно на основните движещи сили за формиране на НП COS-BA. Особено интересно е, че при самосглобяването на COS-BA всички молекули на COS-BA образуват очевидно симетрична структура (фиг. 2C). Този завладяващ феномен ни мотивира да проучим възможната връзка между това свойство и образуването на черупково структурирани COSBA NP. След това се опитахме да разширим единиците на кутията. Изненадващо, свързаните кутии, състоящи се от COS-BA молекули, бяха подредени по правилен начин, което доведе до "ортогонални" кухи мрежови структури (Поддържаща информация Фиг. S11). По-важното е, че произволно изчислихме дебелината на молекулите на обвивката и открихме, че са в съответствие с TEM (w2.35 nm) (фиг. 2D). Тази тенденция за образуване на кухи мрежови структури може да е отговорна за образуването на черупкообразни NP. За да се тества тази идея, беше симулирана MD структурата на съвместни възли COS-BA/Ce6 (фиг. 2E и поддържаща информация, фиг. S12). Подобно на самосглобяванията на COS-BA, голям брой вътрешномолекулни и междумолекулни Н-връзки също бяха открити в съвместните сглобки (Фиг. 2F и поддържаща информация Фиг. S13). Освен това, възможното натрупване на pp между C]C на COS-BA и ароматния пръстен на Ce6 се наблюдава в ко-сглобките (фиг. 2G), което е в съответствие с данните от предишни UV изследвания. След разширяване на броя на кутиите, подобни кухи мрежови структури все още могат да бъдат намерени, само с намалена редовност и ортогоналност (подкрепяща информация Фиг. S14). Това може да е възможната причина за нееднородната морфология на COS-BA/Ce6 NPs в сравнение с COSBA NPs. Освен това, разстоянието между молекулните слоеве на обвивката също е близко до дебелината на обвивката (w2.35 nm) на NPs, както се вижда с помощта на TEM (фиг. 2H). Колективно спекулирахме, че образуването на структурирани с черупки COS-BA/Ce6 NPs или COS-BA NPs може до голяма степен да се дължи на тази тенденция на молекулите да се сглобяват в мрежови структури с куха черупка.
Фигура 1 Производство и характеризиране на модифицирани с хитозан олигозахариди бетулинова киселина (COS-BA) пролекарство-медиирани нано-сглобки COS-BA/Ce6 NPs. (A) Усилените ключови позиции на 'Н NMR на COS-BA. (B) Подготовка на съвместно сглобени COS-BA/Ce6 NP с различни съотношения COS-BA/Ce6. (C) Разпределение на размера на COS-BA/Ce6 NP, използвайки COS-BA и Ce6 (моларно съотношение, 8:1) като градивни елементи. (D) Водоразтворимостта и ефектът на Тиндал на ко-сглобките показват колоиден характер. (E) SEM и TEM изображения на свободни COS-BA самосглобявания и съвместно сглобени COS-BA/Ce6 NP. (F) Резюме на физикохимичните свойства на COS-BA/Ce6 NPs. (G) FT-IR спектри, (H) UV Vis спектри и (I) флуоресцентни емисионни спектри на свободен Ce6, COS-BA и съвместно сглобени COS-BA/Ce6 NPs във вода.
Фигура 2 Структури на (A) COS-BA самосглобяеми и (E) съвместно сглобени COS-BA/Ce6 NP след симулация на молекулярна динамика (MD) за 5 ns с моларно съотношение на структурна единица 8:1 (COS-BA /Ce6, изчислено въз основа на ефективността на натоварване Ce6). Линейният модел беше използван за H2O, а моделите на пръчици представляват COS-BA или Ce6 молекули, където C атомите на Ce6 са маркирани с лилаво. Информацията за водородната връзка между молекулите COS-BA в (B) техните самосглобки и (F) COS-BA/Ce6 NPs съвместни сглобки. (C) Привидно симетричната структура на молекулярната подредба на COS-BA след MD симулация. (G) Възможните молекулярни взаимодействия между COS-BA и Ce6 показват потенциално натрупване на pp. Посочената дебелина на молекулите на черупката в „ортогонална“ куха мрежова структура след разширяване на съответните MD кутии на (D) свободни COSBA самосглобявания и (H) COS-BA/Ce6 NPs съвместни сглобки.
3.3. Енергиен механизъм на повишено генериране на 1 O2
След това изследвахме допълнително генерирането на синглетен кислород (1 O2), един от критичните реактивни кислородни видове (ROS) за ефективността на PDT, използвайки DPBF (1,3-дифенилизобензофуран) като сонда. След продължително облъчване на смесените разтвори на COS-BA/Ce6 NPs с DPBF, UV абсорбцията на DPBF намалява по интензитет, което показва 1 генериране на O2 (фиг. 3A). След сравнение с референтния метиленово синьо (MB), F ( 1 O2) на COS-BA/ Ce6 NPs беше изчислен като 0.26, малко по-висок от свободния Ce6 (FZ0.19) (Фиг. 3B). Като цяло, енергията, абсорбирана от фотосенсибилизаторите, ще претърпи три пътя на релаксация, включващи флуоресценция, ефект на нагряване чрез вибрационна релаксация и генериране на ROS чрез междусистемно пресичане (ISC)41. В съответствие със значително потушената флуоресцентна емисия, COS-BA/Ce6 NPs също не насърчават никакъв топлинен ефект във водата (Подкрепяща информация Фиг. S15), което предполага подобрен ISC процес след съвместно сглобяване на Ce6 с COS-BA, като по този начин води към подобреното 1 поколение O2. За по-нататъшно изясняване на молекулярния механизъм на такъв ефект, ние се опитахме да оптимизираме и изчислим възможния едномолекулен модел на COS-BA/Ce6, състоящ се от потенциално pp подреждане, получено от MD симулация чрез функционална теория на плътността (DFT) (Фиг. 3C) . Учудващо, COS-BA/Ce6 показа наблюдавана UV абсорбция с червено изместване от 581,24 nm в сравнение с тази на свободния Ce6 (579,30 nm), което показва появата на натрупване на pp (фиг. 3D). Въпреки че сведената до минимум енергия геометрия на COS-BA/Ce6 показа леки структурни разлики с въведена MD конфигурация, отличителното pstacking между C]C или C]O връзки на COS-BA с порфиновия пръстен на Ce6 все още беше наблюдавано, което допълнително потвърждава, че над p‒p подреждане е възможно. Междувременно наскоро беше демонстрирано, че повишената ефективност на даряване на електрони чрез p-p подреждане може да улесни процеса на ISC42, докато скоростта на ISC (KISC) е пропорционална на (1/DEST) 2,43. Това означава, че по-ниската енергийна празнина (DEST) на фотосенсибилизатора ще подобри ISC процеса, насърчавайки ефективно генериране на ROS. Впоследствие изчисляваме най-ниското възбудено синглетно състояние (S1) и триплетното състояние (T1) на Ce6 и COS-BA/Ce6 (фиг. 3E), съответно. Резултатите показват, че COS-BA/Ce6 показва понижено DEST от 1,1892 eV в сравнение със свободния Ce6 (1,2001 eV), потвърждавайки подобрения ISC процес. Намаляването на DEST е полезно за производството на O2, което също е потвърдено в други нанофотосенсибилизатори44. Взети заедно, p-подреждането изглежда намалява DEST на Ce6 след съвместно сглобяване с COS-BA, като по този начин води до подобрено генериране на 1 O2.
![Figure 3 Energy mechanism of improved 1 O2 generation induced by COS-BA/Ce6 NPs. (A) UV Vis spectra of photodecomposition of 1,3-diphenylisobenzofuran (DPBF) after prolonged irradiation of COS-BA/Ce6 NPs. (B) In the first-order plots of DPBF UV absorption changes (DOD), the 1 O2 yield was evaluated using methylene blue (MB) (F Z 0.52) in DMSO as the reference compound. (C) Energy-minimized structures of a possible single-molecule COS-BA/Ce6 model viewed from the side and front, which was obtained according to the initial molecular configuration between Ce6 with COS-BA after MD simulation and following DFT calculations. (D) Predicted UV Vis absorption spectra transitions (vertical bars) of free Ce6 and an optimized COS-BA/Ce6 model. (E) Calculated energy levels of their lowest excited singlet state (S1) and lowest triplet state (T1), respectively, [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Where DEST was calculated as ES1 ET1.](/Content/uploads/2023842169/20231220105921392c9765b52f4ceb80db09f348c7b92e.png "Figure 3 Energy mechanism of improved 1 O2 generation induced by COS-BA/Ce6 NPs. (A) UV Vis spectra of photodecomposition of 1,3-diphenylisobenzofuran (DPBF) after prolonged irradiation of COS-BA/Ce6 NPs. (B) In the first-order plots of DPBF UV absorption changes (DOD), the 1 O2 yield was evaluated using methylene blue (MB) (F Z 0.52) in DMSO as the reference compound. (C) Energy-minimized structures of a possible single-molecule COS-BA/Ce6 model viewed from the side and front, which was obtained according to the initial molecular configuration between Ce6 with COS-BA after MD simulation and following DFT calculations. (D) Predicted UV Vis absorption spectra transitions (vertical bars) of free Ce6 and an optimized COS-BA/Ce6 model. (E) Calculated energy levels of their lowest excited singlet state (S1) and lowest triplet state (T1), respectively, [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Where DEST was calculated as ES1 ET1.")
Фигура 3 Енергиен механизъм на подобрено генериране на 1 O2, индуцирано от COS-BA/Ce6 NPs. (A) UV Vis спектри на фоторазлагане на 1,3-дифенилизобензофуран (DPBF) след продължително облъчване на COS-BA/Ce6 NPs. (B) В графиките от първи ред на промените на UV абсорбцията на DPBF (DOD), добивът 1 O2 беше оценен с помощта на метиленово синьо (MB) (FZ 0.52) в DMSO като референтно съединение. (C) Сведени до минимум структури на възможен едномолекулен COS-BA/Ce6 модел, гледан отстрани и отпред, който е получен според първоначалната молекулярна конфигурация между Ce6 с COS-BA след MD симулация и след DFT изчисления. (D) Предсказани преходи на UV Vis абсорбционни спектри (вертикални ленти) на свободен Ce6 и оптимизиран COS-BA/Ce6 модел. (E) Изчислени енергийни нива на тяхното най-ниско възбудено синглетно състояние (S1) и най-ниско триплетно състояние (T1), съответно [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Където DEST беше изчислено като ES1 ET1.
3.4. Характеристики на пасивност при химиотерапия
След това, за да се потвърди концепцията на дизайна в настоящото проучване, че разработването на амфифилна COS-BA молекула може ефективно да увеличи терапевтичния ефект на BA чрез подобряване на клетъчното усвояване чрез увеличаване на хидрофилността и междувременно допълнително конструиране на реагиращи на стимули и напълно хидрофилни COS-BA/Ce6 NP улесняват латентността му в нормалните тъкани и активирането в туморните места. За да тестваме тази хипотеза, първо изследвахме поведението на освобождаване на лекарството на COS-BA/Ce6 NPs в различни буферни разтвори (фиг. 4A). Резултатите показват, че COS-BA/Ce6 NPs показват рН-реагиращо поведение с кумулативно освобождаване на Ce6 от 88% при рН 5,6 и 57% при рН 7,4 след 24 часа, съответно. Тази характеристика вероятно е възникнала от разрушаването на множество водородни връзки, които съществуват в COS-BA/Ce6 NPs след въвеждането на кисел Hþ45, като по този начин води до повишено освобождаване на Ce6 (фиг. 4B). Това беше допълнително потвърдено от разглобяването на COS-BA/Ce6 NPs след инкубация директно в кисела среда (фиг. 4C). Тази функция, реагираща на рН, може да бъде от полза за ефективна противотуморна терапия поради слабо киселинната туморна микросреда34. Междувременно COS-BA/Ce6 NPs имаха по-добра стабилност, тъй като не можеха да се наблюдават значителни промени в размера или PDI след инкубация в PBS и 1640-RMPI среда за клетъчна култура в продължение на 10 дни (Подкрепяща информация Фиг. S16), което би било важно за потенциалното им използване за по-нататъшни биомедицински приложения. Впоследствие бяха проведени допълнителни изследвания чрез оценка на цитотоксичността на свободен липофилен BA (контактен ъгъл q: 133.3) и амфифилен COS-BA (q: 52) (Фиг. 4D) чрез стандартни анализи на метил тиазолил-дифенил тетразолиев бромид (MTT). Както е предвидено, или за 4T1 ракови клетки, или за нормални LO2 хепатоцити, отделните COS по същество нямат противоракова активност при относително ниски дози. Това може да се дължи на антипролиферативните ефекти на COS, който се активира чрез индуциране на NF-kB сигнален път само при високи концентрации (приблизително на ниво милиграм)30. Като има предвид, че COS-BA има забележително повишена цитотоксичност с изключително ниски стойности на IC50 (6,03 mg/mL за 4T1 и 9,92 mg/mL за LO2) в сравнение с тези на BA (17,63 mg/mL за 4T1 и 20,53 mg/mL за LO2) дори при същите масови концентрации (фиг. 4E и J). Получените резултати предполагат, че модификацията на водоразтворим COS значително повишава ефективността на клетъчното усвояване на липофилния BA, като по този начин води до силната противоракова активност на COS-BA. За да се определи количествено ефективността на усвояване, натрупването на BA или COS-BA в 4T1 клетки се определя директно чрез HPLC (подкрепяща информация, фиг. S17). Резултатите ясно подкрепят, че амфифилната COS-BA проявява значително по-високо усвояване от свободната BA (приблизително 36-кратно след 3 часа инкубация), демонстрирайки повишената химиотерапевтична активност на COS-BA. Горното заключение беше допълнително подкрепено от значително подобрената цитотоксичност на амфифилния COSBA срещу HepG2 и MCF-7 ракови клетки (Подкрепяща информация Фиг. S18), които са в съответствие с концепцията на дизайна. След съвместно сглобяване с Ce6 открихме, че COS-BA/Ce6 NPs без облъчване проявяват забележително инхибирана цитотоксичност срещу 4T1 ракови клетки в сравнение с еквивалентния COS-BA, особено при 11,5 mg/mL, но основната PDT активност не е засегната ( Фиг. 4F). За да потвърдим по-пълно това явление, ние допълнително изследвахме in vitro цитотоксичността на COS-BA/Ce6 NPs срещу други ракови клетки, включително MCF-7 и HepG2. Интересно е, че амфифилният COS-BA показва много по-силна цитотоксичност срещу MCF-7 клетки (фиг. 4G), но химиотерапевтичната активност намалява значително след съвместно сглобяване с Ce6, т.е. необлъчени COS-BA/Ce6 NPs. Подобни резултати се наблюдават и при HepG2 клетки само с леко намаление (фиг. 4H). За по-нататъшна подкрепа на горните заключения, ние също оценихме химиотерапевтичните ефекти на нано-възли и COS-BA срещу нормални миши фибробластни L929 клетки и човешки LO2 хепатоцити (Фиг. 4I). Резултатите показват, че сглобените COS-BA/Ce6 NPs значително намаляват оригиналното силно токсично амфифилно лекарство COS-BA, показвайки отлична биосъвместимост. Чрез анализиране на цитотоксичността, стойностите на IC50 на амфифилния COS-BA са значително по-ниски от тези на съвместно сглобените COS-BA/Ce6 NP, независимо от ракови или нормални клетки (фиг. 4J). Това означава, че конструирането на напълно хидрофилни и реагиращи на стимули нано сглобки може ефективно да потисне високата цитотоксичност на амфифилното лекарство COS-BA предварително. Като се има предвид отличителната характеристика, реагираща на pH, изглежда, че COS-BA/Ce6 NPs ще бъдат латентни в нормални тъкани с желана ниска химиотерапевтична токсичност, но активни в туморни тъкани поради тяхното стимулиращо освобождаване на силно токсичен COS-BA в слабо киселинен тумор микросреда. Взети заедно, за разлика от широко докладваната неофункционализация на химиотерапевтични реагенти, които имат повишена противоракова активност 22, 23, амфифилните COS-BA медиирани нано-сглобки не само проявяват интелигентна характеристика на „покой“ с коварни химиотерапевтични ефекти, но също така запазват специализирана PDT активност, показвайки огромен потенциал за интелигентна противотуморна терапия.
Фигура 4 (A) In vitro профили на освобождаване на Ce6 от COS-BA/Ce6 NPs в PBS (pH 7,4, 6,5 или 5,6), съдържащ Tween 80 (0.5%, v/v) при 37 C. (B) Възможният механизъм, отговарящ на pH, който Hþ задейства разглобяването на NP. (C) Разглобяване на COS-BA/Ce6 NP след директна инкубация във вода с приблизително pH 4.0. (D) Контактният ъгъл на свободните BA, Ce6, COS-BA и COS-BA/Ce6 NP, съответно. (E) Клетъчна цитотоксичност на свободен BA, COS и амфифилен COS-BA срещу представителен рак 4T1 и нормални LO2 клетки. Клетъчна жизнеспособност на (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) HepG2 ракови клетки след инкубиране със свободни COS-BA, COS-BA/Ce6 NP с/без облъчване при посочена еквивалентна концентрация на COS-BA за 24 ч. (I) Клетъчна цитотоксичност на свободни COS-BA, необлъчени COS-BA/Ce6 NP срещу нормални LO2 и L929 клетки. (J) IC50 анализ на COS-BA срещу рак и нормални клетки. Данните са изразени като средно SD (n Z 6). *P ˂ 0.05, **P ˂ 0.01 и ***P ˂ 0.001 показват значителните разлики.
За да се изследват възможните причини зад тази характеристика на латентност на химиотерапията, зависимото от времето клетъчно поглъщане на COS-BA/Ce6 NPs беше оценено последователно чрез инкубиране с 4T1 ракови клетки. Резултатите показват, че въпреки че COS-BA/Ce6 NPs показват забележително потушаване на флуоресценцията, те все още показват повишена фагоцитна ефективност в сравнение със свободния Ce6 поради по-силната цитоплазмена червена флуоресценция, както е определено чрез количествен анализ на поточна цитометрия (Фигура 5A). Тази подобрена клетъчна интернализация на NP може да се припише на ендоцитоза21. Взети заедно, ние спекулирахме, че въпреки че силно водоразтворимите ко-сглобки COS-BA/Ce6 NPs (контактен ъгъл q: 36.7) показват подобрена клетъчна ендоцитоза в сравнение с липофилния Ce6 (q: 132.6, близо до BA), намалената ефективност на фагоцитозата на NPs могат да се появят в сравнение с амфифилна COS-BA молекула, като по този начин изглеждат потиснати химиотерапевтичната цитотоксичност на COS-BA/Ce6 NPs. С други думи, ефективността на клетъчно поглъщане от висока към ниска като такава последователност: амфифилна COS-BA, хидрофилна COS-BA/Ce6 NPs, липофилна BA или Ce6. По-важното е, че неадекватното разглобяване на клетъчните NPs може да бъде друга важна причина за отслабения химиотерапевтичен ефект, като всички те могат да бъдат свързани с латентността на интелигентната химиотерапия на COS-BA/Ce6 NPs. Освен това, тъй като разглобяването на NPs беше специално проведено в киселата среда на туморните клетки, за да се демонстрира функцията, реагираща на рН, ние допълнително се опитахме да сравним ефектите на поглъщане на COS-BA/Ce6 NPs в нормални LO2 клетки (фиг. 5B) . Въпреки това, COS-BA/Ce6 NPs не показват значително инхибирана Ce6 червена флуоресценция в LO2 клетки. Обратно, поведението на поглъщане от LO2 е подобно на това на 4T1 раковите клетки, което предполага, че COS-BA/Ce6 NPs също могат да се разглобяват дори в нормални клетки, което може да е резултат от вътреклетъчните компартменти със слабо киселинно pH (ендозоми/лизозоми), съществуващи вътре както ракови, така и нормални клетки46. Тъй като клетъчното поглъщане на NPs зависи от процеса на ендоцитоза, директната инкубация на лекарството може да не подчертае pH-чувствителността на COS-BA/Ce6 NPs на клетъчно ниво. Независимо от това, туморната микросреда (TME) е силно кисела в сравнение с нормалните тъкани47. Независимо от вътреклетъчния рак или TME, COS-BA/Ce6 NPs могат да реагират на pH и да бъдат разглобени, за да предизвикат освобождаването на силно токсичния COS-BA. Докато в нормалните тъкани COS-BA/Ce6 NP могат да бъдат разглобени само след влизане в нормална клетъчна среда, намалявайки вероятността от освобождаване на COSBA. Следователно, ние заключаваме, че характеристиката на латентността на химиотерапията на COS-BA/Ce6 NPs към туморната микросреда е валидна и надеждна и идеята за дизайн в настоящото изследване е осъществима.
3.5. In vitro химиотерапия/PDT противоракова ефикасност на COS-BA/Ce6 NPs
Освен това, преди подробна in vitro химиотерапия/PDT противоракова ефикасност на COS-BA/Ce6 NPs и за по-нататъшно разкриване на механизма на ендоцитоза, ние изследваме четирите основни пътя на ендоцитоза чрез добавяне на съответните ендоцитни инхибитори, включително хлорпромазин (медииран от клатрин), хлорохин фосфат ( инхибитор на подкисляването на лизозома), нистатин (медииран от кавеоли) и инхибитор на макропиноцитоза EIPA (етилизопропил амилорид) (фиг. 5C и D). Ние наблюдаваме, че въвеждането на нистатин и хлорпромазин може по-ефективно да инхибира фагоцитната ефективност от EIPA и хлорохин фосфат, показвайки значително намалена клетъчна флуоресценция в сравнение с нормалните 37 C. Тези резултати показват, че COS-BA/Ce6 NPs са интернализирани чрез множество механизми, главно чрез клатрин и кавеоли-медиирани ендоцитозни пътища. Тъй като увеличеното генериране на 1 O2 чрез междумолекулни взаимодействия, COS-BA/Ce6 NPs показват значително повишен междуклетъчен ROS добив от този на Ce6, както е показано от по-силната зелена флуоресценция на DCFH сондата (фиг. 5E), което предполага по-висока фотодинамична ефективност. МТТ анализите показват, че COS-BA/Ce6 NPs при облъчване извършват забележително засилен ефект на инхибиране върху 4T1 клетки, отколкото този на еквивалент Ce6, докато с относително умерена цитотоксичност без облъчване (фиг. 5F). Показателно е, че IC50 на Ce6 (0,53 mg/mL) в COS-BA/Ce6 NPs е много по-нисък от свободния Ce6 (1,39 mg/mL) (фиг. 5G), което предполага забележително подобрена ефикасност на PDT, която е допълнително демонстрирано перфектно от цитотоксичността на COSBA/Ce6 NPs срещу човешки MCF-7 и HepG2 ракови клетки (Подкрепяща информация Фиг. S19). По същия начин, в сравнение със свободния Ce6, относително по-ниските стойности на IC25, IC50 и IC75 също се наблюдават в съвместни сглобки (фиг. 5G). Междувременно, в сравнение само с Ce6 PDT и единична химиотерапия на NPs на тъмно, COS-BA/Ce6 NPs при облъчване постигнаха по-ефективна комбинирана химиотерапия/PDT срещу горните три ракови клетки, показвайки синергизъм (индекс на комбинация: CI ˂ 1) ( Фиг. 5I). Освен това, двойното оцветяване с флуоресценция на живи/мъртви клетки с калцеин-ацетоксиметилов естер (калцеин-АМ) и пропидиев йодид (PI) допълнително потвърди, че COS-BA/Ce6 NP могат ефективно да индуцират клетъчна апоптоза и некроза, тъй като третираните клетки бяха почти оцветени с червен PI флуоресцентен сигнал, когато се култивира за допълнителни 10 часа след облъчване (фиг. 5H). Междувременно необлъчените COS-BA/Ce6 NPs (по-висока доза Ce6: 3,2 mg/mL) също имат определена химиотерапевтична активност, както се вижда от AM и PI сигналите едновременно. Тази забележително подобрена PDT активност на COS-BA/Ce6 NPs беше допълнително потвърдена чрез AM/PI оцветяване след третиране за допълнителни 20 часа (Подкрепяща информация Фиг. S20). Освен това, при добавяне на натриев азид (SA) и D-манитол (DM), отделно специален гасител на 1 O2 и $OH48, към третирани с COS-BA/Ce6 NPs-PDT 4T1 клетки, очевидно повишената клетъчна жизнеспособност предполага, че Фотореакции от тип I ($OH) и тип II (1 O2) настъпват едновременно в COSBA/Ce6 NPs-медииран PDT процес (фиг. 5J). Освен това, COS-BA/Ce6 NP особено притежават по-добра кръвна съвместимост, както е посочено от незначителната хемолиза на червените кръвни клетки (фиг. 5K), което предполага потенциал за биомедицински приложения чрез интравенозно приложение.
3.6. In vivo биоразпределение на COS-BA/Ce6 NPs
Впоследствие, преди изследването на разпределението in vivo, ние след това оценихме фармакокинетиката на COS-BA/Ce6 NPs чрез мониторинг на концентрацията на Ce6 в кръвта след интравенозно инжектиране с еквивалентни Ce6 или COS-BA/Ce6 NPs. Профилите концентрация-време на Ce6 в кръвта (Фиг. 6A) и сравнителните фармакокинетични параметри (Таблица с поддържаща информация S1) ясно потвърждават, че COS-BA/Ce6 NPs имат продължителна циркулация в кръвния поток, което може да позволи по-голямо натрупване при тумора сайтове. По-специално, COS-BA/Ce6 NPs показват бързо елиминиране от кръвта в рамките на 2 часа, което предполага благоприятна биоразградимост. Съответно, след това изследвахме in vivo биоразпределението и способността за натрупване на тумор на COS-BA/Ce6 NPs (фиг. 6B и C). Подобно на универсално докладваните Ce6 нанокомпозити33, COS-BA/Ce6 NP могат да бъдат разпределени бързо в цялото тяло. Особено през първите 4 часа, групите показват очевидно по-силна флуоресцентна емисия в местата на тумора, отколкото свободния Ce6, което предполага подобрената способност за задържане и насочена към тумора способност за натрупване на COS-BA/Ce6 NP, вероятно приписвана на ефекта на пасивно задържане на повишена пропускливост (EPR). осигурени от наночастиците14. След 6 часа след инжектирането интензитетът на флуоресценция в местата на тумора постепенно намалява бързо. Трябва да се отбележи, че за разлика от често съобщаваните нанокомпозити със значително повишено натрупване на тумор в сравнение със свободното положително лекарство29, COS-BA/Ce6 NPs не показват много забележимо натрупване в местата на тумора 24 часа след инжектирането, отколкото свободния Ce6 (фиг. 6C), който беше допълнително подкрепено от изображенията на изрязания тумор (фиг. 6D и E). Отличната биоразградимост на NP може да е отговорна за въвеждането на естествени малки органични молекули. Това се наблюдава и при други терпеноиди, медиирани от малки молекули нано-сглобки49. Освен това, COS-BA/Ce6 NPs също показаха подобно тъканно разпределение като свободния Ce6 (фиг. 6E), а средният интензитет на флуоресценция ex vivo беше като цяло по-нисък от този, представен in vivo, което допълнително предполага добра биоразградимост. Освен това, като се има предвид тясната разлика в нивото на флуоресценция между 2 и 4 часа след инжектирането на NPs и Ce6, както и експерименталната работоспособност, позволяваща достатъчни интервали за облъчване, 4 часа след приложението беше избрана като светлинна времева точка за последваща PDT терапия.
Като се има предвид не много забележимото натрупване на тумор за 24 часа в сравнение със свободния Ce6, за по-нататъшно валидиране на увеличения EPR ефект, който COS-BA/Ce6 NP имат, ние незабавно наблюдавахме ex vivo флуоресцентните изображения на тумори в различно време след интравенозно инжектиране с нанолекарства ( Фиг. 6F и G). Забележително е, че или на 20 min, или на 12 h след инжектирането, COS-BA/Ce6 NPs наистина показват по-силна флуоресцентна емисия в туморните места, отколкото свободния Ce6, демонстрирайки отлична и подобрена способност за натрупване на тумор. Междувременно, с течение на времето, интензитетите на флуоресценция, задържани в туморната тъкан, постепенно отслабват (фиг. 6G), което е напълно в съответствие с резултатите от in vivo животински флуоресцентни изображения. Ясно е, че този бърз биологичен метаболизъм и повишеното натрупване на тумори избягват потенциалната дългосрочна токсичност на натрупване, гарантирайки високоефективна антитуморна терапия с по-добра биобезопасност.
Фигура 5 In vitro противоракова ефикасност на COS-BA/Ce6 NPs. Клетъчна интернализация на (A) 4T1 ракови клетки и (B) LO2 нормални клетки, инкубирани в свободни Ce6 или COS-BA/Ce6 NPs за 0.5 и 3 часа, и съответен поточен цитометричен анализ на интензитета на флуоресценция. (C) Инхибиране на специфични изследвания на ендоцитния път и (D) съответен интензитет на флуоресценция на клетки, измерен чрез поточна цитометрия след инкубиране с COSBA/Ce6 NP с/без ендоцитни инхибитори, включително хлорпромазин, хлорохин, нистатин и етилизопропил амилорид (EIPA). Скала Z 20 mm. (E) Клетъчно генериране на ROS, индуцирано от свободни Ce6 или COS-BA/Ce6 NP (еквивалент на Ce6: 1,6 mg/mL). Скала Z 20 mm. (F) Клетъчна жизнеспособност на 4T1 клетки след различни обработки за 24 часа. (G) IC25, IC50, IC75 анализ на свободни Ce6 и COS-BA/Ce6 NPs срещу 4T1, MCF-7 и HepG2 клетки, съответно. (H) Калцеин-AM/пропидиев йодид (PI) живо/мъртво оцветяване на третирани с COS-BA/Ce6 NPs (Ce6: 1,6 mg/mL) 4T1 клетки след инкубиране за допълнителни 10 часа, както и необлъчени COS- BA/Ce6 NPs (Ce6: 3,2 mg/mL). Скали Z 50 мм. (I) Комбиниран индекс (CI) на COS-BA/Ce6 NPs върху 4T1, MCF-7 и HepG2 клетки, както е определено чрез изчисление по теоремата на Chou Talalay. (J) Механизми на PDT (тип I и тип II), индуцирани чрез облъчване на COS-BA/Ce6 NPs и оценени съответно със специфичен 1 O2 и $OH гасител натриев азид (SA) и D-манитол (DM). (K) Процентна хемолиза на червени кръвни клетки след инкубиране с COS-BA/Ce6 NPs в продължение на 4 часа. Данните са изразени като средно SD (n Z 3). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 и ***P ˂ 0,001 показват значителните разлики.
Фигура 6 In vivo кръвообращение и биоразпределение на COS-BA/Ce6 NPs. (A) Профили концентрация-време на Ce6 в кръвта след iv инжекции на еквивалентен Ce6 или съвместно сглобени COS-BA/Ce6 NP (n Z 3). (B) Флуоресцентни изображения на цялото тяло на 4T1 мишки, носещи тумор след iv инжекции на посочените лекарства в различни моменти от време. (C) Среден интензитет на флуоресценция, получен от туморните места в (B). (D) Ex vivo флуоресцентни изображения на тумори и основни органи, изрязани от горните мишки на 24 часа, и съответния (E) количествен резултат от интензитета на флуоресценция (n Z 3). (F) Ex vivo флуоресцентни изображения на тумори и основни органи в различно време след iv инжекции на Ce6 или COS-BA/Ce6 NPs и (G) съответен анализ на интензитета на флуоресценция на тумори. Данните са изразени като средно SD (n Z 3).
3.7. In vivo химиотерапия/PDT комбинаторно противотуморно лечение
Мотивирана от уникалната характеристика на латентност, добра биоразградимост и PDT активност, in vivo химиотерапия/PDT комбинирана антитуморна терапия беше изследвана. 4T1 мишки, носещи тумор, бяха произволно разделени на 6 групи и инжектирани интравенозно с еквивалентен Ce6 (3,5 mg/kg тяло) на всеки 2 дни за общо три дози. 4 часа след инжектирането, туморните места на мишки в светлинните групи бяха облъчени за 15 минути (фиг. 7А). Междувременно съответните туморни обеми или телесни тегла се записват през ден. След 14 дни лечение (фиг. 7B), свободният Ce6 с облъчване и свободният COS-BA са неефективни при потискане на тумора, вероятно поради ограниченото натрупване на лекарство в туморната тъкан. За разлика от това, след облъчване на COS-BA/Ce6 NPs, се наблюдава най-значимото инхибиране на тумора, което потвърждава отличната ефективност на комбинацията химиотерапия/PDT. Средното тегло на тумора (Фиг. 7D) и съответните снимки на разрязани тумори (Фиг. 7E) демонстрират най-добрата антитуморна ефикасност на COS-BA/Ce6 NPs при облъчване, тъй като третираните мишки показват най-малките размери на тумора от тези на други групи. Средното съотношение на инхибиране на тумора на третирани с PDT COS-BA/Ce6 NP достигна 80,3%, по-високо от това на свободния Ce6 PDT (42,4%) и свободния COS-BA (38,5%). Трябва да се отбележи, че въпреки че предишни in vitro проучвания показват, че COS-BA/Ce6 NPs без светлина показват латентна функция на химиотерапевтична активност, те все още изпълняват повишена антитуморна ефективност (49,5%) в сравнение със свободния COS-BA (фиг. 7D). Спекулирахме, че две възможни причини допринасят за този резултат, едната е по-високото натрупване на тумор на COS-BA/Ce6 NPs поради широко докладвания EPR ефект. Друг фактор е слабо киселинната туморна микросреда, която стимулира освобождаването на силно токсичен COS-BA. Поради по-високата критична концентрация на мицели (CMC, 187 mg/mL) на COS-BA (Подкрепяща информация Фиг. S21), той може да съществува в мономерно състояние в туморната среда, като по този начин благоприятства подобрената химиотерапия на необлъчени COS- BA/Ce6 NP. Освен това, за по-нататъшна проверка на превъзходната противоракова ефикасност на COS-BA/Ce6 NPs, беше извършено оцветяване на тумори с хематоксилин и еозин (H&E) (Фиг. 7G).
Фигура 7 Проучване за ефикасност с модел на подкожен 4T1 ксенографт. (A) Схематична илюстрация на in vivo PDT лечение. (B) Профили на туморен растеж, (C) промени в телесното тегло и (D) изрязани туморни тегла, съдържащи съотношения на туморно инхибиране на 4T1-носещи мишки след различни лечения в посочените групи (n Z 5 за всяка група). (E) Изображения на изрязани тумори от представителни мишки след лечение. (F) Серумен биохимичен анализ след лечение с COS-BA/Ce6 NPs за 14 дни. (G) Представително H&E оцветяване на изрязани туморни участъци след различни лечения. Скала Z 50 mm. (H) TUNEL оцветяване на свободни Ce6 и COS-BA/Ce6 NPs PDT-третирани туморни срезове. Скалата Z 20 mm **P <0,01 показва значителните разлики.
Резултатите показват, че третираните с COS-BA/Ce6 NPs-PDT туморни срезове показват сериозно влошаване на тъканите и ядрена недостатъчност, докато в другите групи се наблюдава умерена тъканна некроза. Едновременно с това, в сравнение със свободната Ce6 светлина, COS-BA/Ce6 NPs при облъчване забележително увеличават броя на TUNEL-позитивните клетки, показващи по-силно кафяво ядрено оцветяване (фиг. 7H), допълнително потвърждавайки отличната комбинирана терапия с химиотерапия/PDT. Освен това не са наблюдавани очевидни вариации на телесното тегло във всички групи (фиг. 7C). Дори ако COSBA/Ce6 NPs или Ce6 леките групи имат умерена загуба на телесно тегло по време на прилагане, телесните тегла се връщат към нормалното след няколко дни. Не може да се открие видимо увреждане или възпалителна лезия в основните органи, събрани в края на третирането (Подкрепяща информация Фиг. S22), като и двете показват ниска/без системна токсичност и добра биобезопасност на COS-BA/Ce6 NPs. Освен това, въпреки че COS-BA/Ce6 NPs се натрупват главно в чернодробната тъкан, съответните маркери на чернодробната функция (ALT, AST и ALP) не показват значителни промени в сравнение с нормални здрави мишки (фиг. 7F), което предполага по-добра биосъвместимост. В допълнение, маркерите за бъбречна функция (BUN, CRE и UA) и биохимичните параметри (ALB и TBIL) също изглеждат подобни на нормалните мишки, което допълнително предполага по-добра биобезопасност. Ясно е, че тази пролекарствена органична малка молекула COS-BA-медиирана съвместна група COS-BA/Ce6 NP притежава множество благоприятни терапевтични характеристики, които отварят привлекателни възможности за приложения в клиничната медицина.
3.8. Антитуморен имунитет на комбинирана химиотерапия/PDT и анти-PD-L1 блокада
Напоследък множество новаторски проучвания показват, че комбинацията от имунотерапия на рак с други модалности на лечение може ефективно да предизвика тумор-специфични имунни отговори за елиминиране на първични или отдалечени тумори1. Окуражени от уникалната функция на латентност на химиотерапията и отличната антитуморна ефикасност на химиотерапия/PDT на COS-BA/Ce6 NPs, ние се чудим дали може също така да предизвика имунологични отговори с помощта на имунен адювант anti-PD-L1, за да предизвика високоефективна антитуморна терапия . Може ли да лекува отдалечени тумори, които не могат да бъдат лекувани директно чрез PDT лечение, като по този начин предоставя алтернативна стратегия за клинични противоракови приложения? За да се тества тази хипотеза, в това изследване беше създаден модел на "два тумора" и подробни експериментални процедури бяха показани на Фиг. 8А. Обикновено два 4Т1 тумора се инокулират в левия и десния хълбок на всяка мишка. Като се има предвид, че анти-PD-L1 сам по себе си няма забележим имунотерапевтичен ефект50, експериментите бяха разделени на 5 групи, включително нетретирана група, COS-BA/Ce6 NPs, COS-BA/Ce6 NPs с анти-PD-L1, COS- BA/Ce6 NPs със светлина, COS-BA/Ce6 NPs със светлина и анти-PD-L1. След единична iv инжекция на NP (Ce6: 3,5 mg/kg), десните тумори (първичен тумор) в светлите групи бяха облъчени в продължение на 15 минути, за да се оценят имунологичните ефекти на PDT/химиотерапията, докато левите тумори (отдалечени тумори) във всички групи без никакво лечение са избрани за индивидуална химиотерапия. Впоследствие, на Дни 2, 4 и 6, мишките в имунните групи бяха инжектирани iv с анти-PD-L1 антитяло (15 mg на мишка на инжекция) за общо три дози. Показателно е, че независимо от лечението с PDT или не, COS-BA/Ce6 NPs плюс анти-PD-L1 могат ефективно да инхибират прогресията на първичния тумор (фиг. 8B). И съответните средни съотношения на инхибиране на тумора поотделно достигат 86.7% (облъчване) и 76,5% (без облъчване), много по-високо от индивидуалната химиотерапия (5,7%) или химиотерапия/PDT (27,4%) лечение (Фиг. 8C) . Снимките на дисектирани тумори (Фиг. 8D) и мишки, носещи 4T1- (Подкрепяща информация Фиг. S23) след 14 дни лечение също визуално подкрепят горното заключение. Тези резултати предполагат, че както базираната на NPs химиотерапия, така и химиотерапията/PDT могат ефективно да активират антитуморен имунитет. Междувременно, най-поразителното, анти-PD-L1 блокада плюс NPs също предложи забележителен туморен инхибиращ ефект върху необлъчени отдалечени (вляво) тумори (фиг. 8E и F), като цяло по-силен от COS-BA/Ce6 NPs самостоятелно, което беше също потвърдено от съответните дисектирани тумори и изображения на мишки след лечение (Фиг. 8D и Фиг. S23), допълнително демонстрирайки ефективния антитуморен имунен отговор, индуциран от COS-BA/Ce6 NPs.
За да се изследва напълно този ефективен антитуморен имунен отговор, CD8+ цитотоксичните Т лимфоцити (CTLs), критичен имуноцит за имунотерапия на рак4, бяха допълнително оценени чрез анализиране на имунните клетки в десния или левия тумор след 14 дни лечение. Беше установено, че COS-BA/Ce6 NPs плюс анти-PD-L1 с или без лечение с PDT индуцира силна CD8þ CTL инфилтрация в първичните тумори (Фиг. 8H и J). CD8þ CTL инфилтрацията е до 11,3% след COS-BA/Ce6 NPs-базирана химиотерапия/PDT плюс анти-PD-L1 лечение, малко по-висока от COS-BA/Ce6 NPs плюс анти-PD-L1 (9,63%), и много по-висока от тази в други групи без анти-PD-L1, включително лечение с COS-BA/Ce6 NPs базирана химиотерапия (5,12%) или само химиотерапия/PDT (4,07%). По подобен начин, в сравнение с неимунизираните групи, значително повишена CTL инфилтрация също се наблюдава в левите (отдалечени) тумори за мишки след COS-BA/Ce6 NPs плюс antiPD-L1 с или без PDT лечение (фиг. 8I и K), допълнително което предполага високоефективни имунни отговори, предизвикани от химиотерапия или комбинирана терапия с химиотерапия/PDT. Междувременно, след въвеждането на анти-PD-L1, както базираната на COS-BA/Ce6-химиотерапия, така и химиотерапията/PDT доведоха до стабилно производство на множество цитокини, които играят централна роля в регулирането на цитотоксичните функции на CTLs8, включително туморни некрозисфактор-алфа (TNF-a) (Фиг. 8L) и интерферон-гама (IFN-g) (Фиг. 8M) в серумните проби на мишки след 14 дни лечение, което допълнително потвърждава, че има ефективни антитуморни имунни отговори. Освен това, не са наблюдавани видими промени в телесното тегло в различни групи на лечение (фиг. 8N), което показва благоприятната биобезопасност на тази комбинирана химиотерапия/PDT/имунотерапия. Взети заедно, открихме, че въпреки че анти-PD-L1 плюс COSBA/Ce6 NPs със светлина показват малко по-висок коефициент на инхибиране на тумора (86.7%) в сравнение с необлъчената група (76.5%) срещу правилните тумори поради влиянието на PDT (фиг. 8B-D), не се наблюдават значителни разлики в терапевтичните ефекти върху левите тумори в присъствието (77,8%) или отсъствието (78,4%) на PDT (фиг. 8E-G). Предполагаме, че следните възможни причини водят до това явление. Първо, за механизма на химиотерапията или PDT, засилващи имунологичните ефекти на анти-PD-L1 блокадата на контролната точка, натрупващите се проучвания показват, че тези методи на лечение могат да предизвикат остро възпаление в областта на тумора, като по този начин увеличават представянето на тумор-свързани антигени към T клетки, като по този начин индуцира раковите клетки да се подложат на ICD8,9. Туморните клетки, подложени на ICD, биха регулирали нагоре сигналите „изяж ме“ чрез излагане на калретикулин (CRT) върху повърхностите на имуногенно умиращи туморни клетки и сигнали за „опасност“ чрез освобождаване на група 1 с висока подвижност (HMGB1), насърчавайки активирането на дендритни клетки за активиране на CTL, чиято активност може да бъде подобрена от анти-PD-L1, което води до значително подобрена противоракова имунотерапия51.
Фигура 8 Антитуморен ефект на COS-BA/Ce6 NPs-базирана химиотерапия/PDT плюс блокада на контролни точки анти-PD-L1 имунотерапия. (A) Схематична илюстрация на базирана на CNPs химиотерапия/PDT с анти-PD-L1 терапия. (BeD) (B) Профилите на туморен растеж, (C) средни туморни тегла и (D) изображения на изрязани тумори от представителни мишки за първични (вдясно) тумори след различни лечения за 14 дни, както е посочено. (EeG) (E) Кривите на туморен растеж, (F) средни туморни тегла и (G) изображения на изрязани тумори за необлъчени отдалечени (вляво) тумори след различни лечения, както е посочено. (H) Популациите на CD8þ Т клетки в десните тумори и (J) процентите на CTL инфилтрация бяха количествено открити чрез поточна цитометрия след 14 дни лечение. (I, K) Популации от CD8+ Т клетки в леви тумори на ден 14 бяха количествено открити чрез поточна цитометрия (n Z 3). Секреция на цитокини в серума след 14 дни лечение, включително (L) IFN-g и (M) TNF-a, измерени чрез ELISA анализ (n Z 3). (N) Промени в телесното тегло на мишки по време на различни лечения. *P < 0.05, **P < 0.01 и ***P < 0.001 показват значителните разлики.
Второ, в тази работа, COS-BA/Ce6 NP могат да бъдат разпределени върху левия и десния тумор едновременно, както лявата химиотерапия, така и дясната химиотерапия/PDT имат огромен потенциал да индуцират туморни клетки, подложени на ICD. Междувременно COS-BA/Ce6 NPs се прилагат само в една доза, имунотерапията зависи главно от три дози анти-PD-L1, независимо дали химиотерапия или химиотерапия/PDT, те са само праймери. Терапевтичните разлики в индуцирането на ICD на туморни клетки между индивидуалната химиотерапия и комбинираните лечения с химиотерапия/PDT може да не са много забележими. Процентът на CD8+ CTL в левия (Фигура 8I и K) и десния тумор (Фигура 8H и J) също подкрепя горните спекулации, не се наблюдава значителна разлика в CD8+ CTL в присъствието или отсъствието на PDT. Следователно, COS-BA/Ce6 NPs плюс анти-PD-L1 със или без облъчване постигнаха подобна противоракова ефективност срещу левите тумори. Освен това, тъй като 4T1 клетките експресират ниски нива на PD-L152, анти-PD-L1 самостоятелно е широко доказано, че има видим имунотерапевтичен ефект върху 4T1 рак на гърдата 53,54. Въпреки ефектите на ICD, медиирани от COS-BA/Ce6 NPs, изискват по-нататъшно изследване, представените резултати показват, че COS-BA/Ce6 NPs постигат забележително подобрени имунни отговори с помощта на анти-PD-L1. Като цяло, изглежда, че COS-BA/Ce6 NPs наистина потенцират имунотерапията на рак с анти-PD-L1, а не само комбинирана терапия. Въпреки че анти-PD-L1 плюс COS-BA/Ce6 NPs с или без PDT лечение не показват значителни разлики в терапевтичните ефекти, и двете показват очевидно повишена антитуморна ефикасност в сравнение с една доза COS-BA/Ce6 NPs. С други думи, дори и без леко лечение, след въвеждането на имунния адювант antiPD-L1, имуногенността на туморните остатъци след COS-BA/Ce6 NPs химиотерапия може да бъде подсилена, което води до забележителни системни антитуморни имунни отговори, което води до ефективно потискане първични или далечни тумори. По този начин трябва да е възможно да се елиминират първични и метастатични тумори по време на клинична противоракова имунотерапия с повтарящи се лечения с NPs. Ясно е, че тези резултати заедно предоставят доказателства за високоефективни и синергични антитуморни имунни отговори, индуцирани от COS-BA/Ce6 NPs в комбинация с анти-PD-L1 блокада, или с химиотерапия самостоятелно, или в комбинация с химиотерапия/PDT.
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
4. Изводи
В обобщение, ние целенасочено проектирахме, синтезирахме и разработихме биосъвместими, биоразградими, ниско токсични, но високоефективни и клинично достъпни трансформирани фотохимиотерапевтични нано-пролекарства COS-BA/Ce6 NPs чрез комбиниране на три многофункционални компонента, самосглобена естествена малка молекула бетулинова киселина (BA), водоразтворим COS и ниско токсичен фотосенсибилизатор Ce6 за комбинирана химиотерапия/PDT. Впоследствие той задейства високоефективни и синергични антитуморни имунни отговори в комбинация с анти-PD-L1 блокада, с химиотерапия самостоятелно или в комбинация с химиотерапия/PDT. По-конкретно, ние показваме, че молекулното подреждане на кухата мрежа може да улесни образуването на наночастици със структурирана черупка. Модификациите на водоразтворимия COS могат значително да подобрят противораковата активност на липофилни естествени малки молекули чрез конструиране на амфифилно пролекарство. Ние също така показваме, че получените нанолекарства са показали множество благоприятни терапевтични характеристики, особено интелигентна функция на „покой“ с коварни химиотерапевтични ефекти. В съчетание с отличителната чувствителност към pH, тези съвместни сглобки имат ниска токсичност и биобезопасност с нормалната тъкан, но са силно токсични за туморните тъкани. Заедно с подобреното генериране на 1 O2, добра биоразградимост и биосъвместимост, всички те допринесоха за високоефективната, синергична и сигурна противоракова химиотерапия/PDT/ имунотерапия. По-специално, индивидуалната химиотерапия без PDT лечение може да активира системни антитуморни имунни отговори, отваряйки атрактивни възможности за клинично синергична имунотерапия с противоракова химиотерапия. Като цяло, тази работа предоставя обещаваща представа за разработването на естествени многофункционални силно биоактивни и нискотоксични нано-имуностимуланти за клинична имунотерапия.
Препратки
1. Sang W, Zhang Z, Dai YL, Chen XY. Последните постижения в базираната на наноматериали синергична комбинирана имунотерапия на рак. Chem Soc Rev 2019; 48: 3771e810.
2. Li XY, Guo XM, Ling JB, Tang Z, Huang GN, He LZ и др. Ракови имунотерапии, базирани на наномедицина, разработени чрез препрограмиране на свързани с тумор макрофаги. Наномащаб 2021; 13:4705e27.
3. Chao Y, Xu LG, Liang C, Feng LZ, Xu J, Dong ZL и др. Комбинираната локална имуностимулираща радиоизотопна терапия и блокада на системна имунна контролна точка придават мощен антитуморен отговор. Nat Biomed Eng 2018; 2: 611e21.
4. Wen YY, Chen X, Zhu XF, Gong YC, Yuan GL, Qin XY и др. Интегрираните наночастици с фототермична химиотерапия с отговор на туморната микросреда засилват индукцията на имуногенна клетъчна смърт за ефективно лечение на колоректален рак. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11:43393e408.
5. Peng JR, Xiao Y, Yang Q, Liu QY, Chen Y, Shi K и др. Вътреклетъчното агрегиране на пептидно препрограмирани малки молекулни наноагрегати подобрява химиотерапията на рака и комбинаторната имунотерапия. Acta Pharm Sin B 2021;11:1069e82.
6. Song W, Kuang J, Li CX, Zhang MK, Zheng DW, Zeng X и др. Подобрена имунотерапия, базирана на фотодинамична терапия за ерадикация както на първичен, така и на белодробен метастазен тумор. ACS Nano 2018; 12: 1978e89.
7. Wang C, Xu LG, Liang C, Xiang J, Peng R, Liu Z. Имунологични реакции, предизвикани от фототермална терапия с въглеродни нанотръби в комбинация с анти-CTLA-4 терапия за инхибиране на ракови метастази. Adv Mater 2014; 26: 8154e62.
8. He CB, Duan XP, Guo NN, Chan C, Poon C, Weichselbaum RR и др. Наномащабните координационни полимери на сърцевината и обвивката съчетават химиотерапия и фотодинамична терапия, за да потенцират имунотерапията при рак на блокадата на контролните точки. Nat Commun 2016; 7: 12499.
9. Galluzzi L, Buque A, Kepp O, Zitvogel L, Kroemer G. Имуногенна клетъчна смърт при рак и инфекциозни заболявания. Nat Rev Immunol 2017; 17: 97e111.
10. Chiang CS, Lin YJ, Lee R, Lai YH, Cheng HW, Hsieh CH и др. Комбинация от базирани на фукоидан магнитни наночастици и имуномодулатори подобрява локализираната в тумора имунотерапия. Nat Nanotechnol 2018; 13: 746e54.
11. Zheng XL, Ge JC, Wu JS, Liu WM, Guo L, Jia QY и др. Биоразградима нановезикула, производна на хипокретин, като тераностик, управляван от близка инфрачервена светлина, за двойно фотоактивно изобразяване и терапия на рак. Биоматериали 2018; 185: 133e41.
12. Спайсър CD, Jumeaux C, Gupta B, Stevens MM. Пептид и протеинови наночастици конюгират многостранни платформи за биомедицински приложения. Chem Soc Rev 2018; 47: 3574e620.
13. Mei YL, Wang RB, Jiang W, Bo Y, Zhang TF, Yu JL и др. Скорошен напредък в наноматериалите за доставяне на нуклеинова киселина в имунотерапията на рак. Biomater Sci 2019; 7: 2640e51.
14. Zheng YL, Ye JX, Li ZY, Chen HJ, Gao Y. Скорошен напредък в соно фотодинамичната терапия на рак: от разработени нови сенсибилизатори до базирани на нанотехнологии стратегии за повишаване на ефикасността. Acta Pharm Sin B 2021;11:2197e219.
15. Li SK, Zou QL, Li YX, Yuan CQ, Xing RR, Yan XH. Интелигентни пептидни супрамолекулни фотодинамични метало-нано лекарства, проектирани чрез многокомпонентно координационно самосглобяване. J Am Chem Soc 2018; 140:10794e802.
16. Zhi KK, Wang JC, Zhao HT, Yang X. Самосглобен гел с натурален продукт с малка молекула за доставка на лекарства: пробив в ново приложение на натурални продукти с малка молекула. Acta Pharm Sin B 2020; 10: 913e27.
17. Yang X, Ma C, Chen ZM, Liu J, Liu FY, Xie RB и др. Единични наночастици, сглобени от малки молекули, посредничат за ефективно перорално доставяне на лекарства. Nano Res 2019;12:2468e76.
18. Zhi KK, Zhao HT, Yang X, Zhang H, Wang JC, Wang J и др. Естествени гелатори и общ метод за получаването им от организми. Наномащаб 2018; 10: 3639e43.
19. Cheng JJ, Fu SY, Qin Z, Han Y, Yang X. Самосглобени естествени дитерпенови киселини с малка молекула с благоприятна противоракова активност и биобезопасност за синергично подобрена антитуморна химиотерапия. J Mater Chem B 2021; 9: 2674e87.
20. Wang JC, Zhao HT, Zhi KK, Yang X. Изследване на естествения активен процес на зареждане с лекарства с малки молекули и високоефективна синергична антитуморна ефикасност. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:6827e39.
21. Cheng JJ, Zhao HT, Yao L, Li Y, Qi BK, Wang J, et al. Прости и многофункционални естествени самосглобяеми стероли с медиирани от противоракова активност супрамолекулни фотосенсибилизатори за подобрена противотуморна фотодинамична терапия. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11: 29498e511.
22. Cheng JJ, Zhao HT, Wang JC, Han Y, Yang X. Биоактивна естествена малка молекула, настроена съвместно сглобяване на фоточувствителни лекарства за високоефективна синергична и подобрена фотохимиотерапия тип I. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:43488e500.
23. Wang JC, Zhao HT, Qiao WS, Cheng JJ, Han Y, Yang X. Наномедицински носител чрез съвместно сглобяване на естествени малки продукти за синергично подобрени антитуморни с тъканно защитни действия. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:42537e50.
24. Xi JC, Liu HP. Последните постижения в дизайна на самодоставящи се амфифилни лекарства и ваксини. Adv Ther 2019; 3: 1900107.
25. Zhang RS, Qin XF, Kong FD, Chen PW, Pan GJ. Подобряване на клетъчното усвояване на терапевтичните единици чрез взаимодействие с компонентите на клетъчната мембрана. Drug Deliv 2019; 26: 328e42.
26. Pujals S, Giralt E. Богати на пролин, проникващи в амфипатични клетки пептиди. Adv Drug Deliv Rev 2008;60:473e84.
27. Karimi M, Ghasemi A, Sahandi Zangabad P, Rahighi R, Moosavi Basri SM, Mirshekari H, et al. Интелигентни микро/наночастици в реагиращи на стимули системи за доставяне на лекарства/гени. Chem Soc Rev 2016; 45: 1457e501.
28. Cheng JJ, Li XY, Wang S, Han Y, Zhao HT, Yang X. Тритерпенови пролекарства без носители с реакция на глутатион и биобезопасност за синергично подобрена фотохимиотерапия. ACS Appl Mater интерфейси 2021;13:245e56.
29. Li XS, Lee SY, Yoon J. Супрамолекулярните фотосенсибилизатори подмладяват фотодинамичната терапия. Chem Soc Rev 2018; 47: 1174e88.
30. Zou P, Yuan SJ, Yang X, Guo YZ, Li LN, Xu CW и др. Структурна характеристика и антитуморни ефекти на хитозановите олигозахариди срещу ортотопичен чернодробен тумор чрез NF-kB сигнален път. J Funct Foods 2019; 57: 157e65.
31. Zhai XC, Yuan SJ, Yang X, Zou P, Li NL, Li GY и др. Хитозановите олигозахариди индуцират апоптоза при човешки бъбречен карцином чрез зависим от вида на реактивния кислород стрес на ендоплазмения ретикулум. J Agric Food Chem 2019; 67: 1691e701.
32. Deng G, Ma C, Zhao HT, Zhang SQ, Liu J, Liu FY и др. Антиедемна и антиоксидантна комбинирана терапия за исхемичен инсулт чрез заредени с глибурид наночастици бетулинова киселина. Тераностика 2019; 9: 6991e7002.
33. Liu K, Xing RR, Zou QL, Ma GH, Mo¨hwald H, Yan XH. Просто пептидно настроено самосглобяване на фотосенсибилизатори към противоракова фотодинамична терапия. Angew Chem Int Ed Engl 2016; 55: 3036e9.
34. Li Y, Lin JY, Wang PY, Luo Q, Lin HR, Zhang Y и др. Нанолекарство, вдъхновено от туморна микросреда, реагиращо на обръщане на формата и самонасочване на вируса, за фототермична химиотерапия с почти инфрачервена II фототерапия. ACS Nano 2019;13:12912e28.
35. Sawada SI, Sato YT, Kawasaki R, Yasuoka JI, Mizuta R, Sasaki Y, et al. Наногел хибриден монтаж за вътреклетъчно доставяне на екзозома: ефекти върху ендоцитозата и сливането чрез инженерство на повърхностен полимер на екзозома. Biomater Sci 2020; 8: 619e30.
36. Chou TC. Теоретична основа, експериментален дизайн и компютъризирана симулация на синергизъм и антагонизъм в проучвания за комбиниране на лекарства. Pharmacol Rev 2006; 58: 621e81.
37. Zhao YP, Zhao YN, Ma QS, Sun B, Wang QP, Ding Z и др. Двуфункционални нанопръчки без носители чрез самосглобяване на чисти лекарствени молекули за синергична химио-фотодинамична терапия. Int J Nanomed 2019; 14: 8665e83.
38. Ma X, Zhao YL. Биомедицински приложения на супрамолекулни системи, базирани на взаимодействия гост-гост. Chem Rev 2015; 115: 7794e839.
39. Qin XH, Zhang MZ, Hu X, Du Q, Zhao ZP, Jiang Y и др. Наноинженерство на новоразработено производно на хлорин е6 за усилена фотодинамична терапия чрез регулиране на метаболизма на лактат. Наномащаб 2021; 13:11953e62.
40. Du Q, Qin XH, Zhang MZ, Zhao ZP, Li Q, Ren XM и др. Нанолекарство без носители, регулируемо на митохондриалния метаболизъм, за усилване на чувствителността на фототермалната терапия. Chem Commun (Camb) 2021; 57: 8993e6.
41. Li XS, Yu S, Lee D, Kim G, Lee B, Cho Y, et al. Лесен надмолекулен подход към активируема нанотераностика, управлявана от нуклеинова киселина, която преодолява недостатъците на фотодинамичната терапия. ACS Nano 2018; 12:681e8.
2. Gilson RC, Black KC, Lane DD, Achilefu S. Хибридният TiO2-рутениев нано-фотосенсибилизатор синергично произвежда реактивни кислородни видове както в хипоксични, така и в нормоксични условия. Angew Chem Int Ed Engl 2017; 56: 10717e20.
43. Xu SD, Yuan YY, Cai XL, Zhang CJ, Hu F, Liang J и др. Настройване на синглетно-триплетната енергийна празнина: уникален подход към ефективни фотосенсибилизатори с характеристики на емисии, предизвикани от агрегиране (AIE). Chem Sci 2015; 6: 5824e30.
44. Wu WB, Mao D, Xu SD, Kenry, Hu F, Li XQ и др. Полимеризация, повишена фоточувствителност. Chem 2018; 4: 1937e51.
45. Kundu PK, Samanta D, Leizrowice R, Margulis B, Zhao H, Bo¨rner M, et al. Светлинно контролирано самосглобяване на нечувствителни към светлина наночастици. Nat Chem 2015; 7: 646e52.
46. Miyazaki M, Yuba E, Hayashi H, Harada A, Kono K. Базирани на хиалуронова киселина рН-чувствителни полимер-модифицирани липозоми за клетъчно-специфични вътреклетъчни системи за доставяне на лекарства. Bioconjug Chem 2018; 29: 44e55.
47. Zhang JY, Liu ZN, Lian P, Qian J, Li XW, Wang L, et al. Селективно изобразяване и смърт на ракови клетки чрез превключваема рН близка инфрачервена флуоресценция и фототермични ефекти. Chem Sci 2016; 7: 5995e6005.
48. Cheng JJ, Tan GH, Li WT, Zhang HY, Wu XD, Wang ZQ и др. Лесен синтез на подпомогнати от хитозан многофункционални магнитни Fe3O4@ SiO2@CS@pyropheophorbide-a флуоресцентни наночастици за фотодинамична терапия. Нов J Chem 2016; 40: 8522e34.
49. Cheng JJ, Wang S, Zhao HT, Liu Y, Yang X. Изследване на механизма за самосглобяване и ефективна синергична антитуморна химиофототерапия на фоточувствително нанолекарство, медиирано от биоразградимо и реагиращо на глутатион пролекарство на урсолова киселина. Biomater Sci 2021; 9: 3762e75.
50. Yang Y, Xu J, Sun Y, Mo LT, Liu B, Pan XS и др. Базирана на аптамер логическа изчислителна реакция върху живи клетки, за да се даде възможност за терапия за блокиране на имунна контролна точка без антитела. J Am Chem Soc 2021; 143: 8391e401.
51. Kuai R, Yuan WM, Son SJ, Nam J, Xu Y, Fan YC и др. Елиминиране на установени тумори с комбинирана химиоимунотерапия на базата на нанодиск. Sci Adv 2018; 4: eaao1736.
52. Lesniak WG, Chatterjee S, Gabrielson M, Lisok A, Wharram B, Pomper MG и др. Откриване на PD-L1 в тумори с помощта на [(64)Cu]атезолизумаб с PET. Bioconjug Chem 2016; 27: 2103e10.
53. Sagiv-Barfi I, Kohrt HEK, Czerwinski DK, Ng PP, Chang BY, Levy R. Терапевтичният антитуморен имунитет чрез блокада на контролни точки се засилва от ибрутиниб, инхибитор както на BTK, така и на ITK. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:E966e72.
54. Liang C, Chao Y, Yi X, Xu J, Feng LZ, Zhao Q и др. Медиирана от наночастици вътрешна радиоизотопна терапия за локално повишаване на пропускливостта на туморната васкулатура за синергично подобрени терапии за рак. Биоматериали 2019; 197: 368e79.
Може да харесаш също
-
100 процента натурален екстракт от Cistanche Deserticola
-
Засилване на имунитета Cistanche
-
Подобряване на паметта, ефекти на добавката Cistanche Tub...
-
Wecistanche Black Platinum 50 градуса
-
Cistanche Диетична добавка Антиоксидантна подкрепа Фениле...
-
Cistanche Диетична добавка Имуномодулаторни фенилетаноидн...