Инхибирането на тромбоцитите предотвратява активирането на възпаление на NLRP3 и индуцираното от сепсис бъбречно увреждане

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Marivee Borges-Rodriguez и др

Резюме:

Тромбоцитите, клетъчните медиатори на тромбозата, се активират по време на сепсис и все повече се разпознават като медиатори на имунния отговор. Активирането на тромбоцитите е значително повишено при пациенти със сепсис в сравнение с пациентите в интензивното отделение. Въпреки тази корелация, ролята на активираните тромбоцити в приноса към патофизиологията на сепсиса остава неясна. По-рано демонстрирахме активиране на инфламазома на NOD-подобен рецепторен протеин 3 (NLRP3) в индуцирани от сепсис тромбоцити от плъхове с пункция на цекално лигиране (CLP). Активираните тромбоцити са свързани с повишен белодробен оток и гломерулно увреждане при CLP спрямо SHAM контроли. В това проучване ние изследвахме дали инхибирането на активирането на тромбоцитите би намалило активирането на NLRP3 и бъбречното и белодробното увреждане в отговор на CLP. CLP се извършва при мъжки и женски плъхове Sprague Dawley (SD) (n=10/група), за да се предизвика абдоминален сепсис, а SHAM плъхове служат като контроли. Подгрупа CLPanimals беше лекувана с клопидогрел (10 mg/kg/ден, CLP плюс CLOP) за инхибиране на активирането на тромбоцитите. На 72 часа след CLP бяха оценени тромбоцитната активация и сглобяването на инфламазома на NLRP3, IL-1 и IL-18 бяха измерени в плазмата и бяха оценени тъканите, бъбречната и белодробната патология и бъбречната функция. Активираните тромбоцити бяха 7,8 ± 3,6 процента в Sham, 22 ± 6 процента в CLP и значително намаляха до 14,5 ± 0.6 процента в CLP плюс CLOP (n=8–10/група, p < 0,05)="" .="" сглобяването="" на="" инфламазома="" на="" nlrp3="" се="" инхибира="" в="" тромбоцитите="" на="" clp="" плюс="" clop="" животни="" спрямо="" clp.="" значимите="" повишения="" на="" плазмените="" и="" бъбречните="" il-1="" и="" il-18="" в="" отговор="" на="" clp="" бяха="" намалени="" при="" лечение="" с="" клопидогрел.="" бъбречно="" увреждане,="" но="" не="" и="" белодробна="" хистология="" или="" бъбречна="" функция,="" се="" подобрява="" при="" clp="" плюс="" clop="" спрямо="" clp.="" тези="" данни="" предоставят="" доказателства,="" че="" активираните="" тромбоцити="" могат="" да="" допринесат="" за="" индуцирано="" от="" сепсис="" бъбречно="" увреждане,="" вероятно="" чрез="" активиране="" на="" nlrp3="" в="" тромбоцитите.="" тромбоцитите="" могат="" да="" бъдат="" терапевтична="" цел="" за="" намаляване="" на="" бъбречното="" увреждане="" при="" септични="">

Ключови думи:сепсис; NLRP3; тромбоцити; клопидогрел; многоорганно увреждане; ендотелна активация;възпаление

екстракт от Cistanche Tubolosa: противовъзпалително

1. Въведение

Сепсисът е животозастрашаващ нерегулиран възпалителен отговор на гостоприемника към инфекциозен агент [1] и една от водещите причини за смърт в света. Най-малко 1,7 милиона възрастни в Америка развиват сепсис и почти 270 000 американци умират в резултат на сепсис годишно [2]. Сепсисът води до многоорганна дисфункция, включително остро белодробно увреждане (ALI) [3],остърбъбрекнараняване(AKI) [4,5], хематологична дисфункция и дисфункция на централната нервна система, наред с други. Все по-голям брой органи, участващи в сепсиса, се свързва с повишена смъртност [6]. Текущите модалности на лечение се фокусират върху поддържащи грижи; въпреки това смъртността остава висока. Съобщава се, че приблизително 35 до 50 процента от смъртните случаи в болницата се дължат на сепсис [7]. От решаващо значение е да се идентифицира терапевтична цел, която може да подобри смъртността поради сепсис.

Признато е, че тромбоцитите имат роля в имунитета [8, 9], освен ролята им в хемостазата и тромбозата. Тромбоцитопенията се наблюдава често при сепсис и се смята, че възниква поради активиране и консумация на тромбоцити; въпреки това, неговата роля в болестния процес остава неясна. Тромбоцитопенията е свързана с развитието на (мултиорганна недостатъчност) MOF и повишена 90-дневна смъртност [10–14]. Тромбоцитите могат да бъдат неразделна част от възпалителния отговор на сепсис. Потенциален механизъм, чрез който тромбоцитите могат да допринесат за многоорганно увреждане, е чрез активиране на NOD-подобния рецепторен протеин 3 инфламазома (NLRP3). NLRP3 е цитозолен имунен сигнализиращ рецептор, който води до медиирано от каспаза{11}} разцепване и активиране на IL-1B и IL-18 и е замесен в патогенезата на възпалителни болестни процеси като астма [15 ], Паркинсон [16], възпалително заболяване на червата [17] и сепсис [18]. Доказано е, че инхибирането на NLRP3 възпалително сглобяване е защитно срещу индуцирано от сепсис увреждане на органи [19–23]. По-рано демонстрирахме, че инфламазомата NLRP3 се активира в тромбоцитите в отговор на лигиране-пункция на цекума (CLP) и е свързана с многоорганно увреждане в отговор на полимикробен сепсис в 72-часов CLP модел на плъх. В настоящото проучване предположихме, че блокирането на активирането на тромбоцитите с клопидогрел (CLOP) би намалило активирането на инфламазома на NLRP3, бъбречното и белодробното увреждане в отговор на полимикробен сепсис.

флавоноиди от цистанче: противовъзпалително

2. Резултати

2.1. Активиране на плоча и сглобяване на NLRP3 инфламазома

Използвайки поточна цитометрия, ние определихме процента на активиране на тромбоцитите сред групите. Ние открихме, че активирането на тромбоцитите е повишено при CLP плъхове с 22 ± 6 процента, в сравнение с SHAM 7,8 ± 3,6 процента (p < 0.{{10}}5),="" и="" атенюирано="" при="" clp="" плюс="" плъхове="" clop="" с="" 14,5="" ±="" 0,6="" процента="" (p=""><0,05, фигура="" 1).="" nlrp3="" възпалително="" сглобяване="" в="" тромбоцитите="" беше="" оценено="" чрез="" визуализиране="" на="" ко-локализацията="" на="" nlrp3="" със="" свързан="" с="" апоптоза="" петноподобен="" протеин="" (asc),="" използвайки="" имуноцитохимия="" (фигура="" 2).="" ко-локализацията="" на="" инфламазомни="" компоненти="" в="" clp="" тромбоцитите="" е="" 83="" пъти="" по-голяма="" в="" сравнение="" с="" фиктивните="" тромбоцити="" (фигура="" 2c).="" освен="" това,="" сглобяването="" на="" инфламазомата="" е="" намалено="" в="" тромбоцитите="" на="" clp="" плюс="" clop="" в="" сравнение="" с="">

2.2. Свързани с инфламазома цитокини

Активирането на NLRP3 води до освобождаване на провъзпалителни цитокини IL-1 и IL-18 в техните активни форми. Измерихме и двата цитокина в плазмата,бял дроб, ибъбрекхомогенатина SHAM, CLP и CLP плюс CLOP чрез ELISA. Плазменият IL{{0}} значително се повишава от 9 ± 21 pg/mL в Sham до 77 ± 31 pg/mL в CLP (p < {{10}}.0="" 5,="" фигура="" 3a).="" приложението="" на="" clopidogrel="" показва="" понижение="" на="" плазмения="" il-1="" 48="" ±="" 38="" pg/ml;="" въпреки="" това="" намалението="" не="" е="" статистически="" значимо="" в="" сравнение="" с="" clp="" (p="">< 0.05="" срещу="" sham).="" по="" подобен="" начин,="" бъбречният="" il-1="" е="" повишен="" при="" clp="" 4="" ±="" 3="" pg/mg,="" в="" сравнение="" с="" sham="" 2,5="" ±="" 0.9="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" фигура="" 3b).="" лечението="" с="" клопидогрел="" значително="" намалява="" бъбречния="" il-1="" до="" 1,8="" ±="" 0,8="" pg/mg="" (p="">< 0,05).="" в="" белите="" дробове="" il-1="" е="" значително="" повишен="" от="" 70="" ±="" 16="" pg/mg="" при="" sham="" до="" 106="" ±="" 36="" pg/mg="" при="" clp="" (p="">< 0,05)="" и="" не="" се="" различава="" значително="" при="" животни,="" третирани="" с="" клопидогрел="" (80="" ±="" 23="" pg="" g,="" фигура="">

Плазменият IL{{0}} не се открива при SHAM плъхове; средният плазмен IL-18 обаче е 26 ± 6 pg/mL в CLP. Важно е, че приложението на Clopidogrel води до по-ниски нива на плазмения IL-18 (12 ± 9 pg/mL; p < 0.{{20}}5,="" фигура="" 3d).="" по="" подобен="" начин,="" бъбречният="" il{{10}}="" е="" повишен="" при="" clp="" (396="" ±="" 65="" pg/mg)="" в="" сравнение="" с="" sham="" (317="" ±="" 73="" pg/mg;="" p="">< 0,05).="" лечението="" с="" clopidogrel="" намалява="" бъбречния="" il-18="" до="" 214="" ±="" 70="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" фигура="" 3e).="" в="" белите="" дробове="" il-18="" беше="" значително="" повишен="" от="" 704="" ±="" 219="" pg/mg="" при="" sham="" до="" 999="" ±="" 158="" pg/mg="" при="" clp="" (p="">< 0,05)="" и="" остана="" повишен="" при="" животни,="" третирани="" с="" клопидогрел="" 1014="" ±="" 235="" pg/mg="" (="" p="">< 0,05="" спрямо="" sham,="" фигура="">

2.3. Ендотелно активиране

Измерихме плазмените нива на ангиопоетин {{0}} и ендокан като маркери за ендотелна активация в групи Sham, CLP и CLP плюс CLOP чрез ELISA. Плазменият ендокан е значително увеличен от 1234 ± 327 pg/mL в Sham до 1978 ± 306 pg/mL в CLP (p < {{20}}.05="" спрямо="" sham).="" ендокан="" е="" значително="" намален="" до="" 1521="" ±="" 283="" pg/ml="" при="" clp="" плъхове,="" третирани="" с="" clopidogrel="" (p="">< 0,05="" спрямо="" clp,="" фигура="" 4a).="" подобни="" резултати="" са="" открити="" за="" ангиопоетин-2.="" ангиопоетин-2="" е="" значително="" повишен="" от="" 5603="" ±="" 2142="" pg/ml="" при="" sham="" до="" 56="" 767="" ±="" 40,000="" pg/ml="" при="" clp="" (p="">< 0,05="" спрямо="" sham)="" и="" е="" значително="" намален="" при="" плъхове,="" третирани="" с="" клопидогрел="" до="" 22,486="" ±="" 13,616="" pg/ml="" (p=""><0,05 спрямо="" clp,="" фигура="">

2.4. Травма на белия дроб

Хистологичният анализ на белите дробове от всяка група демонстрира значително увеличение на неутрофилната инфилтрация със среден резултат от {{0}}.6 ± 0.2 при CLP плъхове в сравнение с резултат от {{6} }.10 ± {{10}}.10 при фалшиви плъхове (p < 0.05).="" ние="" също="" така="" наблюдавахме,="" че="" прилагането="" на="" клопидогрел="" на="" clp="" плъхове="" не="" променя="" неутрофилната="" инфилтрация="" (резултат="" 0.5="" ±="" 0.4,="" фигура="" 5а).="" подобни="" резултати="" бяха="" открити="" при="" дебелина="" на="" алвеоларната="" стена="" със="" значително="" увеличение="" на="" clp="" със="" средна="" дебелина="" от="" 1,2="" ±="" 0,1="" µm="" в="" сравнение="" с="" 0,8="" ±="" 0,3="" µm="" при="" плъхове="" sham="" (p=""><0,05). прилагането="" на="" клопидогрел="" на="" clp="" плъхове="" не="" подобрява="" дебелината="" на="" алвеоларната="" стена="" (фигура="">

2.5. Травма на бъбреците

Както вече публикувахме, GFR значително намалява от 2,1 ± 0.8 mL/min/100 g, но при плъхове Sham до {{10}} .7 ± 0.2 mL/min/100 g, но при CLP плъхове (p < 0.05).="" прилагането="" на="" клопидогрел="" показва="" подобрена="" gfr="" до="" 1,3="" ±="" 0,5="" ml/min/100="" g,="" но="" в="" сравнение="" с="" clp,="" обаче="" не="" е="" статистически="" значима="" (фигура="" 6а).="" хистологичният="" анализ="" показва="" повишено="" гломерулно="" увреждане="" в="" групата="" на="" clp="" в="" сравнение="" с="" sham.="" лечението="" с="" клопидогрел="" значително="" подобрява="" гломерулното="" увреждане="" при="" clp="" животни="" (фигура="">

Cistanche ползи за здравето: по-добра бъбречна функция

3. Дискусия

Сепсисът е нерегулиран имунен отговор към инфекциозен агент, често свързан с мултиорганна недостатъчност и известна с висока смъртност. Има нужда от идентифициране на нова терапия, която може да модулира възпалителния отговор и да намали смъртността. Предполага се, че тромбоцитите играят роля в имуномодулацията. Естествено, коагулационната каскада и активирането на тромбоцитите са били важен фокус на изследването. Приложението на протеин С, антикоагулантен ендогенен ензим, се свързва с подобрена преживяемост при пациенти с тежък сепсис [24]. В Япония насоките за сепсис включват използването на времево приложение на антитромбин при септични пациенти с DIC и са показали подобрени резултати [25]. Това предполага, че инхибирането на активирането на тромбоцитите може да подобри резултатите при сепсис. Възпалителният отговор по време на сепсис определено е сложен и може да включва повече от един път. По-рано публикувахме, че тромбоцитите от модела на CLP полимикробния сепсис са увеличили сглобяването/активирането на NLRP3 на тромбоцитите и са свързани с белодробно и бъбречно увреждане [26]. В това проучване ние се заехме да определим ролята на инхибирането на тромбоцитите във възпалителния отговор в същия модел, използвайки инхибитора на P2Y12, Clopidogrel.

Както беше публикувано по-рано, активирането на тромбоцитите се повишава в отговор на полимикробен сепсис в CLP модела в сравнение с плъхове Sham. Установихме, че прилагането на клопидогрел намалява активирането на тромбоцитите при CLP плъхове и интересното е, че също се наблюдава намаляване на сглобяването на NLRP3 инфламазома в тромбоцитите. Открихме също тенденция за намаляване на циркулиращите IL-1B и IL-18 в плазмата на животни, третирани с Clopidogrel, в сравнение с групата на CLP. В предишно публикувано проучване ние докладвахме, че директното инхибиране на NLRP3 инфламазома с MCC950 води до намалени IL-1B и IL-18 в плазмата [27]. Това предполага, че инхибирането на активирането на тромбоцитите с клопидогрел и намаляването на възпалителните цитокини в този модел на сепсис се медиира отчасти от механизмите на NLRP3. Следователно е необходимо да се извършат допълнителни проучвания за по-ясно определяне на възпалителните пътища, медиирани от NLRP3 в тромбоцитите.

Multi-organ failure (MOF) occurs frequently in sepsis. Previously published studies reported that in mice, the CLP model caused significant pulmonary damage; and depletion of platelets reduced CLP-induced edema and neutrophil recruitment in the bronchoalveolar space by >60 процента [28]. По-рано публикувахме, че повишеното активиране на тромбоцитите е свързано с множествена органна дисфункция и увреждане в модела на CLP плъх [26]. Нашите данни показват значително намаление на IL-1 и IL-18 вбъбрецина третирани с клопидогрел животни. Комбинацията от остра бъбречна недостатъчност и сепсис е свързана със 70 процента смъртност, в сравнение с 45 процента смъртност само при пациенти с остра бъбречна недостатъчност [29]. Скоростта на гломерулна филтрация (GFR) е показател забъбрекфункцияи намалява с повишено бъбречно увреждане. Лечението с клопидогрел подобрява бъбречното увреждане при CLP плъхове, което предполага, че активирането на тромбоцитите може да играе роля в развитието на предизвикана от сепсис AKI.

ползи от екстракта от цистанче: подобрява функцията на бъбреците

В съответствие с ролята си в причиняването на MOF, развитието на ALI и синдром на остър респираторен дистрес (ARDS) е често срещано явление при пациенти със сепсис и често води до необходимост от механична вентилация при тази популация пациенти. Доказателствата сочат, че активирането на тромбоцитите играе важна роля в развитието на MOF при септични пациенти [8,30]. Предишни проучвания подкрепиха това чрез показване на намалена неутрофилна инфилтрация в белите дробове на CLP-индуцирани септични мишки след изчерпване на тромбоцитите [28]. Освен това, Liverani et al. съобщават, че мишки, предварително третирани с клопидогрел, са резистентни към индуциран от сепсис ALI [31]. Настоящото проучване обаче не успя да покаже значими доказателства за намаляване на IL- 1, неутрофилна инфилтрация или дебелина на алвеоларната стена в белите дробове. Това може да се дължи на използването на различни животински видове, доза клопидогрел и други разлики в експерименталния план.

Капилярното изтичане е важна характеристика на сепсиса. Известно е, че протеини като съдовия растежен фактор ангиопоетин -2 насърчават възпаление, ендотелна дисфункция и са свързани с повишена болнична смъртност при пациенти със сепсис [32]. Ендокан е друг маркер за дисфункция на ендотелните клетки и е свързан с тежестта на заболяването и изхода на септични пациенти [33]. Ние също така открихме, че тези маркери за ендотелна активация и дисфункция са повишени в CLP модела и намалени в групата на лечение с Clopidogrel. По подобен начин наблюдаваме леко, но незначително увеличение на GFR в групата, лекувана с клопидогрел. Това предполага, че активирането на тромбоцитите има някакъв модулиращ ефект върху възпалителния отговор на сепсиса.

В това проучване, инхибирането на активирането на тромбоцитите не доведе до значителни подобрения във функцията на органа. Възможно е избраната доза от 10 mg/kg/ден да е била достатъчна за отслабване на активирането на тромбоцитите, активирането на NLRP3, цитокините и маркерите за ендотелно активиране, но не е довело до отслабване на белодробното увреждане или подобряване на бъбречната функция. Liverani, et al. преди това е използвал начална доза от 30/mg/kg/ден при мишки от див тип и P2Y12 нокаут, което се е превърнало в инхибиране на индуцирано от сепсис белодробно увреждане [31]. В същото проучване клопидогрел е прилаган преди предизвикване на сепсис. Тази основна разлика може да обясни липсата на значителни подобрения в белодробната или бъбречната функция, наблюдавани в нашето проучване.

Докато настоящото проучване предполага роля за активирането на тромбоцитите в допринасянето за възпаление и ендотелно активиране в отговор на сепсис, има ограничения, които трябва да се отбележат. Първо, докато бяха измерени маркери за ендотелна активация, допълнителни експерименти за оценка на ендотелната функция са оправдани. Освен това приносът на други тромбоцитни фактори не е контролиран в това проучване. По този начин все още има въпроси без отговор относно това как тромбоцитите допринасят за предизвиканата от сепсис патология и органна недостатъчност.

Ролята на Clopidogrel за намаляване на смъртността при сепсис е противоречива с доклади за намаляване на честотата на ARDS и механична вентилация, но без намаляване на смъртността [34]. Необходимо е да се извършат допълнителни изследвания, за да се определи точният механизъм, чрез който тромбоцитите допринасят за органно увреждане и дисфункция при сепсис. Това проучване подкрепя по-нататъшното изследване на тромбоцитите като терапевтична цел при септични пациенти.

Cistanche tubolosa ползи за здравето: подобрява бъбречната функция

4. Материали и методи

4.1. Животни

Използвани са женски и мъжки плъхове Sprague Dawley, закупени от Envigo (Индианаполис, IN, САЩ). Всички експериментални процедури, изпълнени в това проучване, са в съответствие с насоките на Националния институт по здравеопазване за използване и грижа за животни. Всички протоколи бяха одобрени от Комитета за институционална грижа и използване на животните към Медицинския център на Университета на Мисисипи. Грижите и обработката на животните бяха в съответствие с насоките на Националния институт по здравеопазване за етично отношение към животните.

4.2. Лигиране и пункция на цекума

Всички наши in vivo експерименти бяха проведени с мъжки и женски плъхове на възраст от 12- до 13- седмица с тегло приблизително 225–325 g. Животните бяха разделени на случаен принцип в две групи: група за фиктивна операция (SHAM, n=10) и група за пункция на лигиране на цекума (CLP, n=10). Под анестезия с изофлуран CLP операцията беше извършена върху подгрупа плъхове, за да се индуцира абдоминален полимикробен сепсис, както описахме по-рано [26,27]. Предварително загрят физиологичен разтвор (20 mL/kg, 37 ◦C) се инжектира подкожно веднага след операцията за реанимация. Фалшиво оперираните животни претърпяват същата хирургична процедура без лигиране или пункция на цекума. Плъховете бяха поставени обратно в клетките си след операцията и храната и водата бяха осигурени ad libitum. На 24-ия час след CLP предишният разрез беше отворен отново и некротичният цекум беше внимателно изрязан. Коремната кухина се промива с 10 mL топъл стерилен физиологичен разтвор. Коремният разрез отново беше затворен на слоеве. На животните се прилага широкоспектърен антибиотик ежедневно (Naxcel 5 mg/kg) и се постига аналгезия с бупренорфин SR (1,2 mg/kg) през 72-часовия експериментален период. Тромбоцитната агрегация се блокира чрез ежедневно приложение на клопидогрел (10 mg/kg/ден) в продължение на 3 дни в подгрупа CLP плъхове (CLP плюс CLOP; n=12) чрез езофагеална сонда в продължение на 3 дни. В края на протокола животните бяха умъртвени под дълбока анестезия. Взети са кръв и тъкани за допълнителен анализ.

4.3. Изолиране на тромбоцити

Артериалната кръв се изтегля в киселинно-цитратно-декстрозни вакуумни епруветки и се центрофугира при 200 × g за 20 минути, за да се получи богата на тромбоцити плазма. Богата на тромбоцити плазма (PRP) се смесва с равен обем HEP буфер (140 mmol/L NaCl, 2,7 mmol/L KCl, 3,8 mmol/L HEPES, 5 mmol/L EGTA, рН 7,4), съдържащ 1 µM PGE1. След това тази смес се центрофугира при 100 × g за 20 минути, за да се утаят останалите RBC и WBC, в които 40 µL от супернатантата се използват за преброяване на тромбоцитите. След това PRP се центрофугира при 800 × g за 20 минути, супернатантата се изхвърля и утайката се ресуспендира в буфер на Tyrode (134 mmol/L NaCl, 12 mmol/L NaHCO3, 2,9 mmol/L KCl, 0,34 mmol/L Na2HPO4,1 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L HEPES), съдържащ 5 mmol/L глюкоза и 3 mg/mL BSA.

4.4. Поточна цитометрия

Прясно изолираните тромбоцити (106) се ресуспендират в 50 uL буфер на Tyrode. Тромбоцитите се инкубират (RT за 30 минути) с флуоресцеин изотиоцианат (FITC) -конюгиран анти-миши CD41 (клон MWReg30, BioLegend, Сан Диего, Калифорния, САЩ) и алофикоцианин (APC) конюгиран анти-миши/плъх CD62P (клон RMP{ {9}}, Biolegend). Най-малко 10 000 събития на врата бяха получени с помощта на MACsQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec, Auburn, Калифорния, САЩ) и анализирани с помощта на софтуер FlowLogic (Innovation, Сидни, Австралия). Тромбоцитите се отличават със специфично свързване на анти-CD41 и характерно разсейване напред и настрани. Тромбоцитите, оцветени положително за CD41 и CD62P, бяха определени като активирани тромбоцити.

4.5. Конфокална и светлинна микроскопия

Тромбоцитите (107) от плъхове Sham или CLP или стимулирани с или без LPS бяха оставени да се придържат към перманокс слайдове (Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Прилепналите клетки се фиксират в 10 процента формалин за 30 минути, промиват се 3 пъти с PBS за 10 минути при стайна температура и се пермеабилизират с ледено студен 100 процента метанол за 10 минути. Предметните стъкла се блокират в PBS с 10 процента кози и заешки серум за 1 час, промиват се и се инкубират със заешко анти-NLRP3 антитяло (NBP2-12446, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) за 2 часа при RT. След това слайдовете се промиват и се инкубират с анти-заешки Alexa Fluor 488 (A11070, Thermo FisherScientifific) в продължение на 1 час при RT. Предметните стъкла се промиват отново и се инкубират с Alexa Fluor647-конюгирано заешко анти-ASC антитяло (NBP1-78977AF647, Novus Biologicals) за 1 час при стайна температура. Контролите бяха обработени идентично, с изключение на пропускането на първичните антитела. Препаратите бяха монтирани в Cytoseal 60 (Thermo Fisher Scientific) и анализирани на Nikon C1 (Nikon Inc., Melville, NY, USA) конфокален сканиращ микроскоп. Изображенията бяха заснети с помощта на микроскоп Nikon Eclipse 55i, оборудван с цветна камера Nikon-Fi1 (Nikon) и анализирани с помощта на софтуер NIS-Elements D 3.0.

4.6. Количествено определяне на биомаркери за ендотелна активация и цитокини

Плазмените нива на ангиопоетин-2 (MANG20, R&D Systems, Minneapolis, MN, САЩ) и ендокан-1 (MBS039900, MyBioSource, Сан Диего, Калифорния, САЩ) бяха измерени като маркери за ендотелна дисфункция чрез ELISA съгласно към протокола на производителя. плазма,бъбрек, и белодробен IL-1 (RLB00, R&D Systems) и IL-18 (ab213909, Abcam, Бостън, Масачузетс, САЩ) бяха количествено определени чрез ELISA съгласно протокола на производителя.Бъбреции белодробни лизати се приготвят с BioPlex Cell Lysis Kit (171304011, BioRad, Hercules, СА, САЩ) съгласно протокола на производителя.

4.7. Оценка на белодробно увреждане

Histological evaluation was performed on the lungs via hematoxylin and eosin (H&E)staining. A lung lobe was formalin-fixed. The tissue was subsequently paraffin-embedded and 5-µm sections were stained with (H&E). Sections were evaluated for neutrophil infiltration into the alveolar space. Five sections were scored in a blinded fashion on a scale of0–2 with 0 representing o neutrophils in the alveolar space, 1 representing 1–5 neutrophils in the alveolar space, and 2 representing >5 неутрофили в алвеоларното пространство. Изображенията бяха заснети с помощта на микроскоп Nikon Eclipse 55i, оборудван с цветна камера Nikon DS-Fi1 (Nikon Inc.) при 40X с помощта на софтуер NIS-Elements D 3.0. Дебелината на алвеоларната стена се измерва с помощта на софтуер NIS-Elements D 3.0. Данните бяха нормализирани до фалшиви стойности.

4.8. Оценка на бъбречно гломерулно увреждане

Бъбрециwere collected, weighed, and fixed in a 10% buffered formalin solution. Paraffin sections (3 µm) were prepared and stained with Periodic acid-Schiff to assess the degree of glomerular injury on approximately 30 images per section, per rat. Thirtyglomeruli per section were scored in a blinded fashion on a 0–4 scale with 0 representing a normal glomerulus, 1 representing a 25% loss, 2 representing a 50% loss, 3 representing a 75% loss, and 4 representing >75 процента загуба на капиляри в кичура. Изображенията бяха заснети с помощта на същия микроскоп, камера и софтуер, както беше споменато по-рано.

4.9. Измерване на бъбречната функция

По време на CLP процедурата, катетър беше вкаран в югуларната вена и екстериоризиран подкожно в задната част на врата. Катетърът се промива с хепаринизиран физиологичен разтвор всеки ден до края на тридневния протокол. В последния ден от протокола, плъховете претърпяха кратка анестезия с изофлуран, за да се сглоби устройството NIC-Kidney (MediBeacon; Манхайм, Германия), направено от два светлоизлъчващи диода, които възбуждат FITC синистрин при 480 nm, фотодиод, който излъчва светлина при 531 nm, микропроцесор и батерия. Това устройство беше прикрепено към гърба на плъха с помощта на двустранен адхезивен пластир (MediBeacon) и закрепено с яке за гризачи към обръснат участък на гърба на плъха. Плъховете бяха оставени да се възстановят в отделни клетки за 15 минути и беше записано измерване на базовата линия. След измервания на базовата линия, болус инжекция на FITC-синистрин (5 mg/100 g телесно тегло; FTC-FS001, MediBeacon) беше приложена през югуларната вена, последвана от болус инжекция на стерилен физиологичен разтвор. По време на период от два часа след болус инжекцията, кинетиката на екскреция на FITC-синистрин беше измерена транскутанно и беше използвана за изчисляване на полуживота на елиминиране (t1/2) на FITC-синистрин с помощта на модел с едно отделение със софтуера за оценка MDPLab (MediBeacon), за да изчисли GFR от валидиран емпирично извлечен коефициент на преобразуване [35,36].

преглед на cistanche: подобрява функцията на бъбреците

4.10. Статистически анализ

Анализът на мощността определя, че n от 10–12 животни/група ще постигне степен (1- ) от 0.80 и вероятност за грешка от тип 1 ( ) от 0,05 за откриване на разлика от най-малко 5-10 процента в активирането на тромбоцитите между плъховете Sham и CLP. Всички данни са изразени като средно ± SD. Всички данни бяха проверени за съответствие с разпределението на Гаус чрез теста за нормалност на D'Agostino-Pearson. Статистическите анализи бяха извършени с еднопосочен ANOVA с теста за множество сравнения на Tukey като post hoc анализ. Стойност p <0,05 се="" счита="" за="" статистически="">

Авторски принос:

Концептуализация, CAS, JMW и DCC; методология, JMW andD.CC; валидиране, OKT, JMW и DCC; формален анализ, MB-R., CAS, OKT, JMW и D.CC; разследване, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW и DCC; ресурси, JMW и DCC; обработка на данни, MB-R., CAS и DCC; писане - първоначална подготовка на проекта, MB-R. и CAS; писане—преглед и редактиране, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW и DCC; визуализация, MB-R., CAS, JMW и DCC; надзор, ОКТ и ДКЦ; администриране на проекти, ДКЦ; придобиване на финансиране, DCC Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране:

Изследванията, докладвани в тази публикация, са подкрепени от Националния институт по общи медицински науки на Националните институти по здравеопазване под номер на награда P20GM104357 и P30GM103328. Това изследване е финансирано от Националния сърдечно-бял дроб и кръвен институт на Националните здравни институти под номера на наградата F31HL149257 (OKT), R00HL130456 (DCC) и R01HL151407 (DCC) и Националния институт по диабет и храносмилателни иБъбрекЗаболяванияна Националните здравни институти под номер на награда R01DK109133 (JMW) Съдържанието е единствено отговорност на авторите и не представлява непременно официалните възгледи на Националните здравни институти.

Изявление на институционалния съвет за преглед:

Всички експериментални процедури, изпълнени в това проучване, са проведени в съответствие с насоките на Националния институт по здравеопазване за използване и грижа за животни. Всички протоколи бяха одобрени от Институционалния комитет за грижа и използване на животните към Медицинския център на Университета на Мисисипи (протокол 1487A, одобрен на 02.07.2019 г.). Грижите и обработката на животните бяха в съответствие с насоките на Националния институт по здравеопазване за етично отношение към животните.

Декларация за наличност на данни:

Всички данни в подкрепа на отчетените резултати са представени в ръкописа и са свободно достъпни.

Конфликти на интереси:

Авторите не изразяват конфликт на интереси.

Препратки

1. Греко, Е.; Lupia, Е.; Боско, О.; Визио, Б.; Montrucchio, G. Тромбоцити и мулти-органна недостатъчност при сепсис. Вътр. J. Mol. Sci. 2017, 18, 2200.
2. Рий, С.; Дантес, Р.; Epstein, L.; Мърфи, DJ; Сиймор, CW; Ивашина, TJ; Кадри, СС; Ангъс, окръг Колумбия; Danner, RL; Фиоре, AE; et al. Честота и тенденции на сепсис в болници в САЩ, използващи клинични данни срещу данни за искове, 2009–2014 г. JAMA 2017, 318, 1241–1249.
3. Ким, WY; Hong, SB Сепсис и синдром на остър респираторен дистрес: Последна актуализация. Tuberc. Respir. дис. (Сеул) 2016, 79, 53–57.
4. Алобаиди, Р.; Басу, РК; Goldstein, SL; Bagshaw, SM Свързано със сепсис остро бъбречно увреждане. Семин. Нефрол. 2015, 35, 2–11.
5. Умбро, И.; Gentile, G.; Тинти, Ф.; Muresan, P.; Mitterhofer, AP Последни постижения в патофизиологията и биомаркерите на предизвикано от сепсис остро бъбречно увреждане. J. Инфектирайте. 2016, 72, 131–142.
6. Билевичус, Е.; Драгосавац, Д.; Драгосавац, С.; Араухо, С.; Фалкао, Алабама; Terzi, RG Мултиорганна недостатъчност при септични пациенти. Браз. J. Инфектирайте. дис. 2001, 5, 103–110.
7. Лю, В.; Escobar, GJ; Грийн, JD; Soule, J.; Whippy, A.; Ангъс, окръг Колумбия; Iwashyna, TJ Смъртни случаи в болница при пациенти със сепсис от 2 независими кохорти. JAMA 2014, 312, 90–92.
8. Кац, JN; Колапа, КП; Becker, RC Отвъд тромбозата: Универсалният тромбоцит при критично заболяване. Сандък 2011, 139, 658–668.
9. Смит, СС; McEver, RP; Weyrich, AS; Morrell, CN; Hoffman, MR; Arepally, GM; Френски, Пенсилвания; Dauerman, HL; Бекер, RC; Platelet Colloquium, P. Функции на тромбоцитите извън хемостазата. J. Thromb. Хемост. 2009, 7, 1759–1766.
10. de Stoppelaar, SF; van 't Veer, C.; van der Poll, T. Ролята на тромбоцитите при сепсис. Thromb. Хемост. 2014, 112, 666–677.
11. Наваз, М.; Дикфелд, Т.; Bogner, C.; Фатех-Могадам, С.; Neumann, FJ Функция на тромбоцитите при септични синдроми на множествена органна дисфункция. Интензивно лечение Med. 1997, 23, 379–385.
12. Лайос, Н.; Delierneux, C.; Хего, А.; Huart, J.; Gosset, C.; Lecut, C.; Maes, N.; Geurts, P.; Джоли, А.; Lancellotti, P.; et al. Прогноза за сепсис при критично болни пациенти чрез маркери за активиране на тромбоцитите при приемане в интензивно отделение: Проспективно пилотно проучване. Интензивно лечение Med. Exp. 2017, 5, 32.
13. Russwurm, S.; Vickers, J.; Meier-Hellmann, A.; Spangenberg, P.; Бредъл, Д.; Reinhart, K.; Losche, W. Активирането на тромбоцитите и левкоцитите корелира с тежестта на септичната органна дисфункция. Shock 2002, 17, 263–268.
14. Вандершурен, С.; De Weerdt, A.; Малбрейн, М.; Vankersschaever, D.; Франс, Е.; Уилмър, А.; Bobbaers, H. Тромбоцитопения и прогноза в интензивното лечение. Крит. Care Med. 2000, 28, 1871–1876.
15. Теофанис, Е.; Семитеколу, М.; Морианос, И.; Санитас, К.; Xanthou, G. Насочване към NLRP3 възпалителна активация при тежка астма. J. Clin. Med. 2019, 8, 1615.
16. Haque, ME; Akther, М.; Джакария, М.; Ким, IS; Азам, С.; Choi, DK Насочване към микроглиалната NLRP3 инфламазома и нейната роля при болестта на Паркинсон. MOV. Разстройство. 2020, 35, 20–33.
17. Лиу, Л.; Dong, Y.; Йе, М.; Джин, С.; Янг, Дж.; Joosse, ME; Sun, Y.; Джан, Дж.; Лазарев, М.; Брант, SR; et al. Патогенната роля на NLRP3 инфламазомна активация при възпалителни заболявания на червата както при мишки, така и при хора. Колит на J. Crohn 2017, 11, 737–750.
18. Даниелски, Л. Г.; Джустина, АД; Бонфанте, С.; Баричело, Т.; Petronilho, F. Инфламазомата NLRP3 и нейната роля в развитието на сепсис. Възпаление 2020, 43, 24–31.
19. Luo, YP; Jiang, L.; Канг, К.; Fei, DS; Мън, XL; Nan, CC; Пан, SH; Zhao, MR; Zhao, MY Хемин инхибира NLRP3 инфламазомна активация при предизвикано от сепсис остро белодробно увреждане, включващо хемоксигеназа-1. Вътр. Имунофармакол. 2014, 20, 24–32.

20. Луна, JS; Лий, С.; Парк, Масачузетс; Siempos, II; Хаслип, М.; Лий, PJ; Юн, М.; Ким, CK; Howrylak, J.; Ryter, SW; et al. UCP2-индуцираната синтаза на мастни киселини насърчава NLRP3 възпалителна активация по време на сепсис. J. Clin. разследване. 2015, 125, 665–680.

[PubMed]21. Gong, Z.; Zhou, J.; Li, H.; Гао, Й.; Xu, C.; Джао, С.; Чен, Й.; Cai, W.; Wu, J. Куркуминът потиска NLRP3 възпалителната активация и предпазва от LPS-индуциран септичен шок. Mol. Nutr. Food Res. 2015, 59, 2132–2142.
22. Уанг, П.; Huang, J.; Li, Y.; Чанг, Р.; Wu, H.; Лин, Дж.; Huang, Z. Екзогенният въглероден окис намалява индуцираното от сепсис остро бъбречно увреждане и инхибира активирането на NLRP3 инфламазома при плъхове. Вътр. J. Mol. Sci. 2015, 16, 20595–20608.
23. Калбиц, М.; Fattahi, F.; Трейлър, JJ; Jajou, L.; Malan, EA; Стоун, FS; Huber-Lang, M.; Ръсел, MW; Ward, PA Индуцирано от комплемент активиране на сърдечната NLRP3 инфламазома при сепсис. FASEB J. 2016, 30, 3997–4006.
24. Бернар, GR; Винсънт, JL; Laterre, PF; LaRosa, SP; Dhainaut, JF; Лопес-Родригес, А.; Steingrub, JS; Гарбър, GE; Helterbrand, JD; Ели, EW; et al. и рекомбинантен човешки протеин CWEiSSsg. Ефикасност и безопасност на рекомбинантен човешки активиран протеин С за тежък сепсис. Н. англ. J. Med. 2001, 344, 699–709.
25. Иба, Т.; Thachil, J. Настояще и бъдеще на антикоагулантна терапия, използваща антитромбин и тромбомодулин за дисеминирана интраваскуларна коагулация, свързана със сепсис: перспектива от Япония. Вътр. J. Hematol. 2016, 103, 253–261.
26. Корнелий, DC; Баик, CH; Травис, ОК; Бяло, DL; Йънг, CM; Остин Пиърс, У.; Шийлдс, Калифорния; Poudel, B.; Уилямс, JM NLRP3 възпалителна активация в тромбоцитите в отговор на сепсис. Physiol. Представител 2019, 7, e14073.
27. Корнелиус, DC; Травис, ОК; Трамел, RW; Борхес-Родригес, М.; Баик, CH; Гриър, М.; Джачели, Калифорния; Тардо, Джорджия; Williams, JM Инхибирането на инфламазома на NLRP3 отслабва индуцираното от сепсис тромбоцитно активиране и предотвратява увреждане на множество органи при пункция на цекално лигиране. PLoS ONE 2020, 15, e0234039.
28. Асадузаман, М.; Лавасани, С.; Рахман, М.; Джан, С.; Braun, OO; Jeppsson, B.; Thorlacius, H. Тромбоцитите поддържат белодробното набиране на неутрофили при абдоминален сепсис. Крит. Care Med. 2009, 37, 1389–1396.
29. Шриер, RW; Wang, W. Остра бъбречна недостатъчност и сепсис. Н. англ. J. Med. 2004, 351, 159–169.
30. Винсент, JL; Ягуши, А.; Pradier, O. Функция на тромбоцитите при сепсис. Крит. Care Med. 2002, 30, S313–S317.
31. Ливерани, Е.; Рико, MC; Циганков, AY; Килпатрик, LE; Kunapuli, SP P2Y12 рецептор модулира сепсис-индуцирано възпаление. Артер. Thromb. Vasc. Biol. 2016, 36, 961–971. [CrossRef]
32. Siner, JM; Бхандари, В.; Engle, KM; Елиас, JA; Siegel, MD Повишените нива на серумен ангиопоетин 2 са свързани с повишени
смъртност при сепсис. Shock 2009, 31, 348–353.
33. Scherpereel, A.; Depontieu, F.; Григориу, Б.; Кавестри, Б.; Цикопулос, А.; Джентиле, Т.; Журден, М.; Pugin, J.; Тонел, AB; Lassalle, P. Endocan, нов ендотелен маркер при човешки сепсис. Crit Care Med. 2006, 34, 532–537.
34. Валерио-Рохас, JC; Jaffer, IJ; Кор, DJ; Гаич, О.; Cartin-Ceba, R. Резултати от пациенти с тежък сепсис и септичен шок при хронично антитромбоцитно лечение: историческо кохортно проучване. Крит. Care Res. Практ. 2013, 2013, 782573.
35. Pill, J.; Исаева, О.; Wonderer, S.; Садик, М.; Kranzlin, B.; Fiedler, F.; Klotzer, HM; Kramer, U.; Gretz, N. Фармакологичен профил и токсичност на белязан с флуоресцеин синистрин, нов маркер за GFR измервания. Арката на Наунин-Шмидеберг. Pharmacol. 2006, 373, 204–211.
36. Хапче, J.; Kraenzlin, B.; Jander, J.; Сателкау, Т.; Садик, М.; Kloetzer, HM; Deus, C.; Кремер, У.; Gretz, N. Белязан с флуоресцеин синистрин като маркер за скорост на гломерулна филтрация. Евро. J. Med. Chem. 2005, 40, 1056–1061.