Потенциални биомаркери на сълзите за диагностика на болестта на Паркинсон—пилотно проучване Ⅰ
Mar 02, 2023
Резюме: Болестта на Паркинсон (PD) е второто най-разпространено невродегенеративно заболяване след болестта на Алцхаймер. В това проучване профилът на слъзния протеом на пациенти с идиопатична PD (iPD, n=24), носители на мутацията E46K-SNCA (n=3) и здрава контрола (CT, n {{4 }}) субектите бяха анализирани за идентифициране на кандидат биомаркери за диагностициране на PD. Беше проведено обсервационно, проспективно и пилотно проучване за случай-контрола, като се изследваха проби от сълзи на участниците чрез нанотечна хроматография–масспектрометрия (nLC–MS/MS) и се оценяваше тяхното неврологично увреждане. Получените протеомни данни са достъпни в ProteomeXchange с идентификатор 10.6019/PXD028811.
Щракнете за цистанче Amway за болестта на Паркинсон
Тези анализи доведоха до идентифицирането на 560 слъзни протеини, някои от които бяха дерегулирани при пациенти с PD и които бяха замесени в имунни отговори, възпаление, апоптоза, разграждане на колаген, протеинов синтез, защита, липиден транспорт и променена лизозомна функция. От тези протеини шест бяха свързани с невродегенеративни процеси и показаха отличен капацитет за класифициране на пациенти и контроли. Тези открития разкриват, че определени протеини са регулирани нагоре в сълзите на пациенти с PD, главно протеини, участващи в лизозомната функция. По този начин, в това проучване, слъзните протеини бяха идентифицирани като замесени в невродегенерация, която може да бъде свързана с фенотип на агресивно заболяване при пациенти с PD.
Ключови думи: биомаркери; Болестта на Паркинсон; сълзен филм; лизозома
1. Въведение
Болестта на Паркинсон (PD) е второто най-разпространено невродегенеративно заболяване след болестта на Алцхаймер (AD) и се характеризира със забавяне на движението (брадикинезия), повишен мускулен тонус (ригидност), треперене (тремор) и нарушен постурален контрол. При патологично потвърдена PD има променливо количество и отлагане на неправилно нагънат алфа-синуклеин (-syn) под формата на телца на Леви (LB) и неврити на Леви в централната нервна система (ЦНС). Тази променливост в натрупването на тези структури вероятно отразява клиничната хетерогенност при това заболяване [1–3]. Наистина, няколко клинични разстройства се намират в спектъра на болестите с телцата на Леви (LBDs), включително пациенти с идиопатична (IPD) и генетична PD и пациенти, страдащи от деменция с LBs. Едно от основните предизвикателства при справянето с невродегенеративните заболявания е да се намерят клинични маркери, които позволяват ранното класифициране на пациентите и помагат да се наблюдава прогресията на заболяването.
Фактори като оксидативен стрес, протеолиза и променени концентрации на мастни киселини или фосфолипиди са свързани със структурни промени в -syn, а пост-транслационните модификации също могат да променят размера, структурата или протеиновото натоварване на -syn [4]. Дерегулиращите мутации и мултипликации в гена -syn (SNCA) причиняват автозомно-доминантни фамилни форми на PD [5]. Може би най-патогенната мутация, за която е известно, че индуцира PD, е мутацията E46K в -syn (E46K-SNCA), която е в основата на група от агресивни, генетични LBDs с клинични и патологични характеристики, напомнящи деменция с LBs [6,7]. Въпреки че мутациите в -syn са редки, те предоставят уникална възможност за идентифициране на пациенти с PD и за по-добро разбиране на прогресията на тези патологии.
Известно е, че пациентите с ПД развиват халюцинации, промени в движението на очите и клепачите и променен състав на сълзите в намалени количества [8,9]. В допълнение към увреждането на очната повърхност, тези пациенти могат да изпитат промени в акомодацията, намалена зрителна острота, образуване на скотоми (области, където тяхното зрително поле е частично намалено или напълно дегенерирано) и изтъняване на слоевете на ретината, особено поради намаляване на в броя на нервните влакна [10,11]. Дефицитите в невротрансмисията и метаболизма на моноамините също влияят върху патологичните промени в зрителната система на пациенти с PD [12].
Тези промени са доста типични, тъй като моноамините участват в предаването на визуална информация в ретината [13]. Освен това пациентите с ПД могат да изпитат промени в инервацията на предната част на окото, което в крайна сметка може да промени състава на сълзите. Много невротрансмитери и трофични вещества се секретират в сълзите, произхождащи от водната течност или нервите, преминаващи през роговицата [14].
Въпреки това, клетъчните и молекулярните механизми, които са в основата на тези асоциации, все още не са напълно изяснени. Тъй като PD засяга няколко немоторни системи и периферни нерви, слъзната секреция може да бъде променена при тези пациенти и съставът на сълзния протеин може да покаже характерен профил при тези пациенти, който може да служи като диагностичен биомаркер. В този смисъл, анализирането на слъзните протеини на пациенти с E46K-SNCA и iPD може да помогне за идентифицирането на полезни кандидат биомаркери за диагностициране и прогресия на PD.
Следователно, настоящото проучване имаше за цел да анализира профила на протеома на сълзата при пациенти с iPD и носители на мутацията E46K-SNCA, за да намери биомаркер, който би могъл да помогне при бъдещата диагностика на PD, като се използват неинвазивни проби.
2. Материали и методи
2.1. Проучване Кохорта
Ние проектирахме обсервационно, проспективно пилотно проучване случай-контрола, в което бяха включени 24 пациенти с iPD, 3 носители на мутацията E46K-SNCA и 27 здрави субекти (CTs). Това изследване е проведено от медицински квалифициран персонал след получаване на одобрение от Комитета по етика на OSI Ezkerralde-Enkaterri-Cruces CEIC E18/47. Проучването е проведено в строго съответствие с принципите на Хелзинкската декларация за биомедицински изследвания, включващи хора. Преди вземането на пробата е получено подписано информирано съгласие от всички субекти след обяснение на естеството и възможните последствия от изследването. Пациентите бяха наети в звената за неврология и офталмология на университетската болница Cruces (Barakaldo, Bizkaia, Испания) по време на амбулаторни консултации, въз основа на съгласуваните критерии за включване и изключване. Пациентите с IPD отговарят на критериите на Parkinson's UK Brain Bank за диагностициране на PD и не носят известни мутации.
Критериите за включване за КТ трябваше да са на възраст над 40 години, от двата пола и без клинична анамнеза за каквото и да е неврологично заболяване. Индивиди с (или с анамнеза за) някакво системно или очно заболяване/състояние бяха включени в проучването. Критериите за изключване се състоят от очна хирургия през предходните три месеца, хронично лечение на очите (напр. за глаукома), анамнеза за алергии, използване на всякакви лекарства за локално приложение (различни от изкуствени сълзи) или перорални лекарства, съдържащи кортикостероиди, атопия и пациенти с болест на Sjögren синдром.
Потребителите на контактни лещи също бяха изключени, за да се избегне евентуална намеса в тълкуването на резултатите. Предварителните очни тестове и вземането на проби бяха извършени в същия ден, докато пациентите с PD също бяха прегледани в отделен ден от членове на изследователския екип, които са експерти по двигателни нарушения, за да се оцени скалата на Паркинсон.
2.2. Офталмологичен преглед
Клиничният офталмологичен преглед включва тест на Schirmer I (SCH), който определя дали окото произвежда достатъчно сълзи, за да го поддържа влажно. Тестът позволява на водата в сълзите да се движи по дължината на хартиената тест лента и нормалните стойности са По-големи или равни на 10 mm намокряне на хартията след 5 минути. Нестабилността на слъзния филм беше оценена чрез използване на времето за разкъсване на сълзата (TBUT) с флуоресцеин. TBUT е времето, необходимо за появата на първото сухо петно върху роговицата след пълно мигане. Стойност под 10 s обикновено отразява известна нестабилност на слъзния филм. Всяко системно заболяване или всяко друго състояние/употреба на медикаменти, които биха могли да попречат на тълкуването на резултатите, се считат за критерий за изключване.
2.3. Неврологичен преглед
Експерт невролог в областта на двигателните разстройства записва възрастта на пациентите с PD при събиране на сълзи, продължителността на заболяването им и техния резултат по Унифицираната скала за оценка на болестта на Паркинсон (UPDRS) и скалата на Hoehn Yahr. Тези тестове служат като критерии за стратификация за проследяване на прогресията на заболяването. Поверителността на данните за пациентите е осигурена чрез използването на баската биобанка.
2.4. Вземане на проби от сълзи
Всички проби от сълзи бяха събрани с помощта на калибрирани 10 µL стъклени микрокапилярни тръби (BLAUBRAND intraMark, Wertheim, Германия). Бяха взети проби от сълзи от долния темпорален менискус на сълзите, свеждайки до минимум дразненето на очната повърхност или ръба на клепача и без поставяне на анестезия. Пробите от сълзи бяха събрани от двете очи на всеки участник и незабавно поставени в предварително охладени епруветки Eppendorf. След събиране на сълзи, пробите се съхраняват при -80 ◦C до техния анализ.
2.5. Протеомични анализи
Протеомичните анализи бяха извършени в CIC bioGUNE Proteomics Service (Derio, Bizkaia, Испания), като се използва протоколът за подготовка на проби с помощта на филтър (FASP) [15] за обработка на проби и смилане. Трипсин (Sigma Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) се добавя при съотношение трипсин: протеин 1:50 и сместа се инкубира една нощ при 37 ◦C, изсушава се в RVC{{4} } Концентратор Speedvac (Крист, Виена, Австрия). Получените пептиди бяха обезсолени и ресуспендирани в 0,1 процента мравчена киселина (FA) (Sigma Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) с помощта на накрайници за степен C18 (Millipore, Сейнт Луис, Мисури, САЩ).
Пробите бяха анализирани в нов хибриден спектрометричен квадруполен масспектрометър с уловена йонна подвижност (timsTOF Pro с PASEF, Bruker Daltonics, Бремен, Германия), свързан онлайн към течен хроматограф nanoElute (Bruker, Ковънтри, Обединеното кралство). Този масспектрометър се възползва от нов режим на сканиране, наречен серийна фрагментация с паралелно натрупване (PASEF), който умножава скоростта на секвениране без загуба на чувствителност и е доказано, че осигурява изключителна аналитична скорост и чувствителност за протеомични анализи [16].
Проби (200 ng) се зареждат директно в 15 cm Bruker nano elute FIFTEEN C18 аналитична колона (Bruker, Coventry, UK) и се разделят при 400 nL/min. Колоната се нагрява до 50 ◦C в пещ. Идентификацията и количественото определяне на протеини бяха извършени с помощта на софтуера PEAKS (Bioinformatics Solutions Inc., Ватерло, Калифорния, САЩ). Бяха извършени търсения в база данни с канонични човешки Uniprot/Swissprot записи (без разглеждане на изоформи), с толеранси на прекурсор и фрагмент от 20 ppm и 0.05 Da.
Беше извършено базирано на площ количествено определяне на протеин без етикет с помощта на модула PEAKS Q, наличен в софтуера PEAKS. Само протеини, идентифицирани с най-малко два пептида при степен на фалшиво откриване (FDR) < 1 процент и присъстващи в най-малко 70 процента от пробите от една от експерименталните групи, които се анализират, бяха взети предвид за по-нататъшен анализ. Данните бяха заредени в платформата Perseus [17] и допълнително обработени (log2 трансформация, импутация) преди прилагането на t-тест на Student за диференциален анализ на протеинова експресия. Данните за протеомиката са обобщени във файл с допълнителни материали S1, а данните за протеомиката на масовата спектрометрия бяха депозирани в консорциума ProteomeXchange чрез партньорското хранилище PRIDE [18] с идентификатори на набор от данни PXD028811 и 10.6019/PXD028811.
2.6. Статистически анализи
Статистическите анализи бяха извършени с помощта на пакета IBM SPSS Statistics за Windows, 23.0v (IBM-SPSS, Armonk, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ). Нормалността на непрекъснатите данни беше оценена с тест на Shapiro-Wilk. Изчислените p-стойности определят вероятността връзката между протеините в набора от данни и даден каноничен път, функционална мрежа или регулатор нагоре по веригата да се обясни само случайно, въз основа на точен тест на Fisher, с p-стойност < {{5 }}.05 се счита за значимо.
Бяха използвани едномерни логистични регресии, за да се идентифицират статистически значимите характеристики, свързани с дискриминацията на PD-пациент. След селекция на променливи бяха използвани многовариантни логистични регресии за конструиране на модел на дискриминация на PD и за идентифициране на клиничните и протеомни променливи, свързани с идентифицирането на PD. Логистичните модели позволяват да се оцени връзката между дискретна зависима променлива и набор от непрекъснати или дискретни независими променливи. Моделите позволяват класифициране на пациенти със или без PD, като се изчислява вероятността за принадлежност към всяка група. P-стойността на всяка ковариата описва статистическата значимост на връзката между отговора и всеки член, включен в модела.
за повече информация: Ali.ma@wecistanche.com
