Прогнозирайте ролята на LncRNA в стареенето на бъбреците въз основа на РНК секвениране Ⅱ

Корелация на lncRNA Gm43360 и неговите потенциални целеви иРНК

LncRNA Gm43360 беше избран за изследване, тъй като свързваше две мрежи за коекспресия на lncRNA-mRNA. Нивото на експресия на Adra1a е положително корелирано (rho=0.8650, p=0.026) с това на Gm43360, Csnk1a1 (казеин киназа 1A1) е отрицателно корелирано (rho{{12 }}.8084, p=0.0084) (фиг. 5а). За по-нататъшна проверка на корелацията на lncRNA Gm43360 и неговите потенциални целеви иРНК Adra1a и Csnk1a1, в това изследване е проектиран свръхекспресионен плазмид на lncRNA Gm43360. Експресията на Csnk1a1 намалява, както се очаква, и експресията на Adra1a също намалява, но не значително. След това повалихме lncRNA Gm43360 от siRNA, за да открием дали експресията на нейните целеви иРНК е засегната. Както се очакваше, Csnk1a1 беше увеличен в lncRNA Gm43360 нокдаун клетки по отношение на siRNA отрицателна контролна група (фиг. 5b). Десето, открихме ролята на lncRNA Gm43360 в клетъчния цикъл. Резултатите от комплекта за броене на клетки -8 (CCK-8) показват, че lncRNA Gm43360 насърчава жизнеспособността на клетките (фиг. 5в). Резултатите показват, че lncRNA Gm43360 повишава процента на S фазовите клетки и намалява процента на G1 фазовите клетки в сравнение с отрицателната контрола (фиг. 5d). Te p53 и p21 протеините участват в регулирането на клетъчния цикъл и по този начин са белезите на клетъчното стареене. Нивата на експресия на р53 и р21 бяха значително намалени в групата със свръхекспресия спрямо контролната група. Нивата на експресия на р53 и р21 бяха значително повишени в групата на siRNA по отношение на контролната група на siRNA (фиг. 5е). Свръхекспресията на lncRNA Gm43360 намалява броя на SA- -gal-позитивните клетки, а -gal-позитивните клетки се увеличават в групата на трансфект Gm43360 (фиг. 5f). Взети заедно, тези резултати показват, че lncRNA Gm43360 инхибира стареенето на бъбречните тубулни епителни клетки чрезинхибиране на експресията на Csnk1a1.

НАТИСНЕТЕ ТУК, ЗА ДА ВЗЕМЕТЕ НАТУРАЛЕН ОРГАНИЧЕН ЕКСТРАКТ ОТ ЦИСТАНША С 25% ЕХИНАКОЗИД И 9% АКТЕОЗИД ЗА БЪБРЕЧНАТА ФУНКЦИЯ

Дискусия

В това проучване ние оценихме данните за експресията на иРНК от бъбреците на млади и стари мишки и проведохме биоинформационни анализи, които разкриха функциите на аберантно експресираните иРНК. Наблюдавахме 347 регулирани нагоре иРНК и 355 регулирани надолу иРНК, както и 130 регулирани нагоре lncRNA и 91 регулирани надолу lncRNA вбъбреците на стари мишки в сравнение с бъбреците на млади мишки. Освен това е доказано, че тези иРНК участват в пътища, свързани със стареенето, като напрокислително фосфорилиране, сигналния път AMPK, сигналния път Wnt, сигналния път Rap1 и свързано с възрастта заболяване, което демонстрира функциите на диференциално експресирани иРНК в патогенезата на бъбречното стареене.

Дългата некодираща РНК NEAT1 е защитен фактор при прогресирането на бъбречната фиброза в бъбречните тубулни епителни клетки [21]. По случайност, в резултатите от нашето секвениране, lncRNA NEAT1 се експресира на по-ниски нива в бъбреците на възрастни мишки, отколкото при млади мишки, което е в съответствие с предишни открития. LincRNA-Gm4419 ускорява възпалението и фиброзата чрез NF-kB/NLRP3 инфламазомно-медиирани механизми при диабетна нефропатия [22]. В нашите резултати от секвенирането ние също открихме, че експресията на Gm4419 е по-висока в бъбреците на възрастни мишки, отколкото при млади мишки, но няма значителна разлика. LncRNA Gm43360 се намира на хромозома 5 (Chr5:122494022–122,494,908, 2887 bp). Според UCSC Genome Browser, Gm43360 се намира в интрона на протеин-кодиращия ген Atp2a2. Досега обаче няма съобщения за участието на lncRNA Gm43360 в заболявания. В това проучване нокдаунът на lncRNA Gm43360 насърчава стареенето на епителните клетки на бъбречните тубули. В допълнение, ние идентифицирахме много диференциално експресирани lncRNAs в резултатите от секвенирането и ги изследвахме.

LncRNA бяха класифицирани в цис-регулация или транс-регулация въз основа на регулаторни механизми на lncRNA. Цис-действащите lncRNA могат да повлияят на експресията на съседни гени в зависимост от цис-действащи елементи, като промотори, енхансери и регулаторни последователности, които са разстояния между lncRNA и mRNA от по-малко от 100 kb. Транс-действащите lncRNA се отнасят до lncRNA, напускащи мястото на трансфекция и действащи на отдалечени места (т.е. разстоянието между lncRNA и mRNA е повече от 100 kb) [23]. lncRNA MAAT увеличава експресията на съседния ген Mbnl1 чрез цис-регулаторен модул [24]. lncRNA Pnky играе роля като транс-действащ регулатор в кортикалното развитие [25]. В това проучване имаше трансрегулаторна връзка между lncRNA Gm43360 и Csnk1a1. Csnk1a1 е туморен супресорен ген [26], който кодира протеин, който участва в клетъчния цикъл и процеса на клетъчно делене [27]. Понижаването на Csnk1a1 предизвиквасвързано със стареенето възпалениеотговор със спиране на растежа при колоректални тумори [26]. Csnk1a1 беше регулиран надолу, когато Gm43360 беше регулиран нагоре; следователно е вероятно lncRNA Gm43360 да участва встареене на бъбрецитеотрегулиране на експресията на Csnk1a1.

Изводи

Нашето изследване на мрежата за коекспресия на lncRNA-mRNA встареене на бъбрецитеразкри lncRNA, lncRNA Gm43360, може да играе защитна роля при стареенето на бъбреците и разшири нашето разбиране за механизмите, включени встареене на бъбреците

Материали и методи

Проби Млади (3--месечни) и стари (24--месечни) мъжки мишки C57BL/6J бяха закупени от Центъра за експериментални животни на университета Ксиамен и бяха отгледани в стандартна среда. Всички мишки имаха свободен достъп до храна и вода. Мишките бяха аклиматизирани към новото съоръжение за един месец, преди да бъдат умъртвени. Мишките се анестезират с уретан чрез интраперитонеално инжектиране в доза от 750 mg/kg преди вземане на проба. Млади и стари мишки бяха умъртвени в един и същи ден.Остатъчен бъбрек на мишкатъкан се използва за секвениране във всеки анализ. Бяха извършени RNA-seq и хистопатологияотделни бъбрециот същата мишка. Бъбречна тъкан се събира от мишки. Единият бъбрек беше незабавно потопен в 10% неутрален буфериран формалин за последващо вграждане на секции, а другият бъбрек беше разделен на няколко тъкани и незабавно поставен в течен азот и след това съхранен при -80 градуса. Проучването беше подкрепено от Комитета по етика на Първата свързана болница на университета Xi'an Jiaotong (Шаанси, Китай) (№ 2018-G-164). Всички методи бяха проведени съгласно насоките и разпоредбите за етика на животните. Това проучване е проведено в съответствие с указанията на ARRIVE.

Бъбречна хистопатология

Проби от бъбречна тъкан на млади и стари мишки се фиксират в 10% разтвор на параформалдехид за една нощ. Десет от срезовете бяха дехидратирани, вградени в парафин и нарязани с дебелина 4- µm. PAS и трихроматичното оцветяване на Masson се извършват с помощта на стандартни протоколи. Изображенията бяха заснети от камерата и беше измерена зоната с положително оцветяване. Площта за изображенията на хистопатологичната камера беше изчислена с Image-Pro Plus 6.0.

SA‑‑gal оцветяване

SA{{0}}gal активността се анализира с помощта на SA- -gal оцветяващ комплект (Cell Signaling Technology #9860) съгласно протокола на производителя. Беше измерена площта на положително оцветяване и SA- -gal-позитивните клетки бяха изчислени с помощта на Image-Pro Plus 6.0.

Конструиране и секвениране на библиотека за екстракция на РНК

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 бяха използвани за конструиране на библиотека за секвениране. След екстракция на обща РНК, тРНК се пречиства от обща РНК (5 ug) с помощта на Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, СА, САЩ) с два кръга на пречистване. След пречистване иРНК се разделя на къси фрагменти, като се използват двувалентни катиони при високи температури (магнезиев модул за фрагментиране на РНК (NEB, кат. e6150, САЩ) под 94 градуса 5-7 минути). След това разцепените РНК фрагменти се транскрибират обратно, за да се получи сДНК чрез SuperScript™ II обратна транскриптаза (Invitrogen, кат. 1,896,649, САЩ), които след това се използват за синтезиране на U-белязани второверижни ДНК с Е. coli ДНК полимераза I ( NEB, кат.m0209, САЩ), RNase H (NEB, кат.m0297, САЩ) и dUTP разтвор (Termo Fisher, кат.R0133, САЩ). След това към тъпите краища на всяка нишка беше добавена А-основа, подготвяйки ги за лигиране към индексираните адаптери. Всеки адаптер съдържа надвес на T-база за лигиране на адаптера към фрагментирана ДНК с A-опашка. Адаптери с двоен индекс бяха лигирани към фрагментите и изборът на размер беше извършен с AMPureXP перли. След термично лабилен UDG ензим (NEB, cat.m0280, USA) на U-белязаните второверижни ДНК, лигираните продукти бяха амплифицирани с PCR при следните условия: първоначална денатурация при 95 градуса за 3 минути; 8 цикъла на денатурация при 98 градуса за 15 секунди, отгряване при 60 градуса за 15 секунди и удължаване при 72 градуса за 30 секунди; и след това последно удължаване при 72 градуса за 5 минути. Средната дължина на вмъкване за крайните cDNA библиотеки беше 300±50 bp. Накрая, ние извършихме 2 × 150 bp сдвоено крайно секвениране (PE150) на Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, Китай) съгласно протокола на производителя [28].

Биоинформатичен анализ Последователност и филтриране на чисти четения

cDNA библиотека, конструирана по технология от събраната РНК отпроби от бъбрецитеот мишки беше секвениран и пуснат с Illumina NovaseqTM 6000 платформа за последователност. Използвайки RNA-seq подхода на Illumina за сдвоен край, ние секвенирахме транскриптома, генерирайки общо милиони 2 × 150 bp четения от сдвоен край. Четенията, получени от машините за секвениране, включват необработени четения, съдържащи адаптери или основи с ниско качество, които ще повлияят на последващото сглобяване и анализ. По този начин, за да се получат висококачествени чисти четения, четенията бяха допълнително филтрирани от Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, версия:cutadapt-1.9). Параметрите бяха както следва:

1) премахване на четения, съдържащи адаптери;

2) премахване на четения, съдържащи polyA и poly;

3) премахване на четения, съдържащи повече от 5% неизвестни нуклеотиди (N);

4) премахване на показания с ниско качество, съдържащи повече от 20% бази с ниско качество (Q-стойност по-малка или равна на 20).

Качеството на десет последователности беше проверено с помощта на FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/, 0.11.9). включително съдържанието на Q20, Q30 и GC на чистите данни. След това бяха произведени общо G bp почистени, сдвоени крайни четения. Суровите данни за последователността са изпратени към наборите от данни NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) с номер за достъп GSE154223.

Референтният геном/анотация беше Mus_musculus.GRCm38. Източникът и версията на генната анотация, използвана за анализите, беше Ensembl_v88.

Сглобяване на преписи

Първо, Cutadapt [29] беше използван за премахване на показанията, които съдържаха замърсяване на адаптера, основи с ниско качество и неопределени основи. Качеството на десетте последователности беше много подхранено с помощта на FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/). Използвахме Bowtie2 [31] и Hisat2 [32], за да картографираме показанията към генома на мишката. Картираните показания на всяка проба бяха събрани с помощта на StringTie [33]. Десет, всички преписи отпроби от бъбрецитебяха обединени, за да реконструират цялостен транскриптом, използвайки Perl скриптове. След генерирането на крайния транскриптом, StringTie [33] и edgeR [34] бяха използвани за оценка на нивата на експресия на всички транскрипти.

LncRNA идентификация

На първо място, транскрипти, които се припокриват с известни иРНК и транскрипти, по-къси от 200 bp, бяха изхвърлени. След това използвахме CPC [35] и CNCI [36], за да предвидим транскрипти с потенциал за кодиране. Всички преписи с CPC оценка<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

Анализ на диференциално експресирани гени за анализ (DGEs).

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 се считат за диференциално експресирани гени.

Предсказване на целеви гени и функционален анализ на lncRNAs

За да изследваме функцията на функцията на lncRNA, ние предвидихме цис-целевите гени на lncRNA. LncRNA могат да играят цис роля в действието върху съседни целеви гени. В това проучване кодиращите гени в 100,000 нагоре и надолу по веригата са избрани чрез Perl скрипт. След това показахме функционален анализ на целевите гени за lncRNAs чрез използване на скриптовете BLAST2GO [39]. Връзката с пълните команди към общественото достояние беше Jie-Li/README.md на main · dandan-li/Jie-Li (github.com).

Категории на генната онтология (GO) и анализ на Киото Енциклопедия на гените и геномите (KEGG)

Биоинформатичният анализ за секвениране на РНК беше извършен с помощта на инструменти на OmicStudio (http://www.omicsudio.cn/tool). Анализът на функционалното обогатяване на генната онтология (GO) и анализът на обогатяването на Киото Енциклопедия на гените и геномите (KEGG) [37–39] бяха използвани за анализиране на биологичните функции на прогнозираните целеви гени. GO анализът изяснява основните биологични процеси чрез три аспекта: клетъчен състав, молекулярни функции и биологични процеси (http://www.geneontology. org/). Анализът първо поставя всички диференциално експресирани гени и фонови гени в базата данни GO. Всеки елемент се картографира, броят на гените във всеки елемент се изчислява и хипергеометричното разпределение се използва за извършване на тестване на хипотези за получаване на P стойността на резултата от обогатяване. Колкото по-ниска е стойността на P, толкова по-значителен е резултатът от обогатяване. KEGG е ресурс от база данни, който анализира диференциално експресираните иРНК от генетичната биология, за да изследва важни пътища, свързани с целевите гени (https://www.genome.jp/kegg/). Резултатите се изразяват чрез p-стойности; колкото по-ниска е p-стойността, толкова по-значим е резултатът от обогатяване.

qRT–PCR

GAPDH се използва като ендогенна контрола. След това се изчисляват относителните нива на експресия на неизвестни гени. Всички праймери са проектирани и синтезирани специално за този експеримент. Праймерите за GAPDH са комерсиализирани. Специфичността на праймерите Adra1a и Csnk1a1 беше идентифицирана чрез единичния пик на кривата на топене.

Изградете мрежа за коекспресия на mRNA‑lncRNA

Трансрегулацията се основава на изследване и след това се изчислява транс енергията. Колкото по-малка беше транс енергията, толкова по-голяма беше възможността за свързване. След това също беше изчислен коефициентът на корелация на mRNA-lncRNA. МРНК-lncRNA мрежата е конструирана чрез избиране на корелационен коефициент на Spearman, надвишаващ 0.9. Коекспресионната мрежа на mRNA-lncRNA беше конструирана с помощта на софтуер Cytoscape (v3.7.1).

Клетъчна култура

Миши бъбречни проксимални тубулни епителни клетки (MRPT-EpiCs) се култивират в епителна клетъчна среда-животна (EpiCM-a, Cat. #4131), съдържаща 2% фетален говежди серум (FBS, Cat. #0010) и добавка за растеж на епителни клетки - животно (EpiCGS-a, Cat. #4182) без антибиотици в овлажнен инкубатор при 37 градуса и 5% CO2. Хранителната среда се сменя на всеки 2-3 дни. Клетките във фазата на логаритмичен растеж бяха субкултивирани, когато растежът достигна 90%. Клетъчната суспензия, усвоена от трипсин, се посява в 6-плаки с ямки с 2*104 -5*104 клетки във всяка ямка. Всички клетки, използвани за трансфекция, са между 2 и 5 поколения.

Плазмидна конструкция и клетъчна трансфекция

lncRNA Gm43360 свръхекспресионният плазмид е конструиран от GeneChem (Шанхай, Китай). Плазмидният скелет беше GV658, а CMV промоторът задвижи експресията на lncRNA. Клонираната нуклеотидна последователност е предоставена в допълнителния материал. За нокдаун на lncRNA Gm43360 три lncRNA ENS ТРЯБВА00000197656-да са насочени към siRNA (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'-CCCUGUCACUCA UGAAGUUTT-3'; и lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGGTT-3') са проектирани и синтезирани в GenePharma (Шанхай, Китай). Съгласно протокола на производителя, клетките бяха трансфектирани с 2500 ng плазмид или 100 pmol siPHK с 6 ul Lipofectamine™ 2000 реагент за трансфекция (Invitrogen, САЩ) на ямка. Нивата на експресия на РНК и протеин се откриват на 48-ия час след трансфекцията и всеки експеримент се повтаря поне три пъти. Количествена PCR в реално време беше използвана за валидиране на ефективността на свръхекспресията и нокдауна на lncRNA Gm43360.

Western blot анализ

Култивираните клетки се промиват с ледено студен PBS, добавят се 120 ul RIPA буфер (Heart, Китай) и се добавят протеазен инхибитор и PMSF (Heart, Китай) за 30 минути върху лед. След събиране на клетки в различни микроцентрофужни епруветки, концентрацията на протеин се определя количествено. Зареждащ буфер се добавя към всяка проба и след това се вари в продължение на 7 минути. Тридесет микрограма от пробата бяха разделени с 12% SDS-PAGE (Beyotime, Китай) и електротрансферирани към PVDF мембрани (Thermo Fisher, САЩ). След това мембраните бяха блокирани с 5% мляко. Мембраните се инкубират със специфични първични антитела: анти-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), анти-p53 (1:1000, Proteintech, 10442-1-AP) и анти-GAPDH (1:3000, Profintech , 60004-1-Ig) една нощ при 4 градуса. След промиване с TBST, мембраните се инкубират с вторично антитяло в продължение на 1 час при стайна температура. Протеиновите ленти се наблюдават с помощта на хемилуминесцентен комплект (Millipore, САЩ). Експресията на GAPDH се използва за нормализиране на протеиновите нива.

Анализ на клетъчна пролиферация

Капацитетът на клетъчна пролиферация се определя чрез анализ на комплекта за броене на клетки-8 (CCK-8). Четиридесет и осем часа след трансфекцията, към всяка ямка бяха добавени 90 µl нова среда и 10 µl разтвор на CCK-8 (Beyotime, C0042). Клетките се инкубират в продължение на 1–4 часа при 37 градуса в 5% CO2 и се измерват при 450 nm от универсален четец на микроплаки (Bio-Tek, САЩ).

Поточен цитометричен анализ

Клетките се поставят в 6-плаки с гнезда в деня преди трансфекцията. Четиридесет и осем часа след трансфекцията клетките се трипсинизират и центрофугират при 1000 rpm за 5 минути. След това клетките се фиксират в 70% етанол при 4 градуса за най-малко 4 часа. След центрофугиране към клетките се добавя оцветяващ разтвор на РНКаза А и пропидиев йодид (PI) и след това клетките се инкубират в продължение на 30 минути при стайна температура на тъмно. Те-оцветените клетки бяха анализирани с помощта на ACEA NovoCyte (Biosciences, САЩ).

Статистически анализ

Данните от измерването чрез нормалното разпределение са представени като средна стойност ± SD. Разликата между двете различни групи беше определена с помощта на двустранен несдвоен t-тест на Student и p-стойност < 0.05 беше счетена за статистически значима. Всички изчисления бяха извършени с помощта на GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., САЩ).

Препратки

1. Docherty MH, O'Sullivan ED, Bonventre JV, Ferenbach DA. Клетъчно стареене в бъбрека. J Am Soc Nephrol. 2019; 30 (5): 726–36.

2. Partridge L, Deelen J, Slagboom PE. Изправяне пред глобалните предизвикателства на застаряването. Природата. 2018; 561 (7721): 45–56.

3. Pan JX. LncRNA H19 насърчава атеросклерозата чрез регулиране на MAPK и NF-kB сигналните пътища. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017; 21 (2): 322–8.

4. Wasson CW, Abignano G, Hermes H, Malaab M, Ross RL, Jimenez SA, Chang HY, Feghali-Bostwick CA, Del Galdo F. Дългата некодираща РНК HOTAIR задвижва EZH2-зависимото миофибробластно активиране при системно склероза чрез miRNA 34a-зависимо активиране на NOTCH. Ann Rheumatic Dis. 2020; 79 (4): 507–17.

5. Luo J, Wang K, Yeh S, Sun Y, Liang L, Xiao Y, Xu W, Niu Y, Cheng L, Maity SN и др. LncRNA-p21 променя индуцираната от антиандрогенен ензалутамид невроендокринна диференциация на рак на простатата чрез модулиране на сигнализирането EZH2/STAT3. Nat Commun. 2019; 10 (1): 2571.

6. Wang Y, Yang L, Chen T, Liu X, Guo Y, Zhu Q, Tong X, Yang W, Xu Q, Huang D и др. Нова lncRNA MCM3AP-AS1 насърчава растежа на хепатоцелуларен карцином чрез насочване към miR-194-5p/FOXA1 оста. Мол рак. 2019; 18 (1): 28.

7. Wu YY, Kuo HC. Функционални роли и мрежи от некодиращи РНК в патогенезата на невродегенеративните заболявания. J Biomed Sci. 2020; 27 (1): 49.

8. Li Z, Wang Z. Стареещи бъбреци и свързани със стареенето заболявания. Adv Experiment Med Biol. 2018; 1086: 169–87.

9. Wang X, Vrtiska TJ, Avula RT, Walters LR, Chakkera HA, Kremers WK, Lerman LO, Rule AD. Възрастта, бъбречната функция и рисковите фактори са свързани по различен начин с кортикалните и медуларните обеми на бъбрека. Kidney Int. 2014; 85 (3): 677–85.

10. Lin Q, Hou S, Dai Y, Jiang N, Lin Y. LncRNA HOTAIR е насочена към miR-126-5p за насърчаване на прогресирането на болестта на Паркинсон чрез RAB3IP. Biol Chem. 2019; 400 (9): 1217–28.

Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/телефон:+86 15292862950

Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop