Мицеларна формула на кверцетин предотвратява нефротоксичността на цисплатина

за повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Алфредо Г. Казанова, Марта Прието, Клара И. Колино и др.

Антиоксидантният флавоноидкверцетине доказано, че предотвратяванефротоксичноств животински модели и в клинично проучване и следователно е много обещаващ профилактичен кандидат в процес на разработка.кверцетинразтворимостта е много ниска, което пречи на клиничното приложение. Целта на тази работа беше да се проучи при плъхове бионаличността и нефропротективната ефикасност на мицеларна формула на Pluronic F127-капсулиранкверцетин(P-кверцетин), с подобрена хидроразтворимост. Интраперитонеално приложение на P-кверцетинводи до повишена плазмена концентрация и бионаличност накверцетинв сравнение с еквимоларното приложение на естественотокверцетин. Освен това, P-кверцетинзапазва цялостните нефропротективни свойства и дори леко подобрява някои параметри на бъбречната функция в сравнение с естественитекверцетин. По-конкретно, P-кверцетиннамалява нарастването на плазмения креатинин (от 3,4±{2}}.5 до 1,2±0.3 mg/dL) и урея (от 490.9±43,8 до 184,1± 50.1 mg/dL) и намаляването на креатининовия клирънс (от {{20}}.08±0.02 до 0.58±0.19 mL/min), предизвикано от нефротоксичното химиотерапевтично лекарство цисплатин, и подобрява хистологичните данни за тубулно увреждане. Тази нова формула с подобрени кинетични и биофармацевтични свойства ще позволи по-нататъшно изследване накверцетинкато кандидат нефропротектор при по-ниски дози и чрез начини на приложение, ориентирани към неговата клинична употреба.

Ключови думи:цисплатин;нефротоксичност; флавоноид;кверцетин; нефропротекция; бионаличност;бъбрек;мицели; разтворимост; формулировка

Профилактика нанефротоксичност

Щракнете върху Cistanche para que sirve за бъбречно заболяване

1. Въведение

Лекарствонефротоксичносте сериозен медицински и икономически проблем [1,2], като 25 процента от 100-те най-използвани лекарства в интензивните отделения са нефротоксични [3], инефротоксичностсъщо е важна причина за отпадане на кандидати по време на процеса на откриване на лекарства 4]. Цисплатинът е антитуморен агент на основата на платина, който често се използва при лечението на различни солидни злокачествени неоплазми [5,6]. Близо 30 процента от пациентите показват данни занефротоксичностпрез първите десет дни след приложението на цисплатин, което представлява важно ограничение за неговата дозировка и терапевтична ефективност [5-8]. Остър цисплатиннефротоксичностпричинява тубулопатия, произтичаща от 5-кратно натрупване в епителните клетки на проксималния тубул по отношение на неговата плазмена концентрация [9-1l] и в по-малка степен в дисталния тубул [12,13 ].

Цисплатиновата тубулопатия се характеризира с електролитни нарушения (главно хипомагнезиемия и хипокалиемия) иостърбъбрекнараняване(AKI). AKI е често срещан синдром, характеризиращ се с рязко намаляване на скоростта на гломерулна филтрация (GFR), тежка азотемия и често олигурия или анурия [7,14]. В допълнение, ендотелната дисфункция, която повишава бъбречната васкуларна резистентност и нарушава авторегулацията, също допринася за индуцирана от цисплатин AKI[9]. Обикновено AKI е обратимо състояние, което въпреки това има значимо въздействие върху резултатите за пациентите, включително повишена вътреболнична смъртност (над 50 процента от случаите сред критично болните), продължителна хоспитализация, допълнителни разходи за здравеопазване и, в средата- и дългосрочни сценарии, повишен риск от развитиехронично бъбречно заболяванеи на обща и сърдечно-съдова заболеваемост [7,14]. На субклетъчно и молекулярно ниво тубулната цитотоксичност на цисплатин се задвижва от митохондриално увреждане, което ограничава дишането, предизвиква оксидативен стрес и предизвиква апоптотична и некротична клетъчна смърт и вреден възпалителен отговор [13,15,16]. Оксидативният стрес е признат за централен механизъм на цитотоксичността на цисплатина инефротоксичност[12,13,15-17], възникващи от повишено производство на реактивни кислородни видове и отслабена ендогенна антиоксидантна ензимна бариера [5,7,18].

Ефективни профилактични мерки за цисплатиннефротоксичностпредставляват неудовлетворена клинична нужда от подобряване на неговия фармако-токсикологичен профил и максимизиране на неговата полезност. Съществуващите превантивни стратегии, включително интензивна хидратация, са показали само ограничена защита [6,19]. В процес на разработване са нови стратегии, базирани на съвместното приложение на нефропротектори. Кандидатите за нефропротектори включват магнезиеви формулировки |6,9 и, най-вече, разнообразие от антиоксиданти [6,20,21]. Флавоноидите са семейство от нефропротективни полифенолни продукти, получени от зеленчуци, плодове, ядки и вино, със силни антиоксидантни свойства [22].кверцетине представен флавоноид, който упражнява много полезни ефекти [23, 24], включително пречистване на реактивни кислородни видове, потискане на активирането на тромбоцитите, ендотелна защита, модулиране на възпалението, инхибиране на апоптозата, потискане на тумора и нефропротекция. Съвместно приложение накверцетинзаедно с терапията с цисплатин в модел на животински тумор осигурява нефропротекция, без да пречи на антитуморния ефект |25,26]. Всъщност актуализиран мета-анализ идентифициракверцетинкато много обещаващ кандидат като невропротектор за по-нататъшно клинично развитие [21]. Последователно скорошно клинично проучване съобщава за защитен ефект накверцетинвърху индуцирана от контраст нефропатия (CIN) [27].

Силно ограничение на потенциалното приложение накверцетин(споделена от флавоноидите като цяло) е неговата ниска хидроразтворимост, произтичаща от неговата химическа структура и части, които намаляват абсорбцията му в тънките черва и по този начин неговата бионаличност и ефикасност [23, 24, 28]. Интересното е, че липофобната глюкоза-кверцетинконюгатите (глюкозидите) са значително по-бионалични от липофилните агликони, тъй като последните са по-малко разтворими в чревния лумен [24]. Всъщност,кверцетинглюкозидите от лука показват най-висока степен на усвояване, а хранителните мазнини повишаваткверцетинабсорбция на агликон в тънките черва [29]. Много ниската хидроразтворимост накверцетинне само възпрепятства клиничната му употреба чрез практически начини на приложение (т.е. перорално, интраваскуларно), но също така ограничава предклиничните изследвания. Независимо от това, при животински модели, алтернативни пътища (т.е. интраперитонеално) с лекарствени суспензии могат да се използват за целите на доказване на концепцията [25,26].

кверцетинразработени са формули с нови носители, носещи подобрена хидроразтворимост, чиито биомедицински свойства трябва да бъдат тествани. Плуроновите полоксамери са клас носители, които приемат и подобряват абсорбцията на водонеразтворими съединения поради способността им да образуват мицели във водна среда [30]. Тук предположихме, че мицеларна формула накверцетинкапсулиран с Pluronic F127, описан по-рано [31, ще запази нефропротективните свойства на естественитекверцетинкато същевременно предлага подобрени биофармацевтични характеристики за обработка, формулиране и администриране.

Предотвратявамнефротоксичност:кверцетин

2. Резултати

Бяха проведени проучване за бионаличност и нефропротекция с новата мицелална формула накверцетинкапсулиран с Pluronic F127[31, и нашата традиционна формула на натураленкверцетин|25,26|(вижте по-долу Материали и методи). Докато последното беше суспензия, съдържаща тензоактив, първото беше физиологичен разтвор без допълнителни добавки. Нашата традиционна естествена формулакверцетине подходящо само за експериментални цели, утаява се, когато се остави неподвижно, и е по-трудно за боравене и инжектиране. За разлика от това, мицеларната формула се държи като разтвор и не показва неудобства при употреба.

2.1. Проучване за бионаличност

Като метод за сравнителна бионаличност, еволюцията накверцетин(Q) плазмената концентрация е изследвана след единичен интраперитонеален болус от естествен и P-кверцетин(PQ). Фигура 1 показва средната стойносткверцетинкриви на плазмените нива, получени след приложение на доза откверцетинили П-кверцетин. Максималните лекарствени концентрации (Cmax), наблюдавани в групите Q и PQ, са съответно 1,14±1,28 ug/mL и 8,90 ±4,62 ug/mL, т.е. 78-кратно увеличение за P-кверцетин, което показва, че мицеларната формула повишава абсорбцията на лекарството.

Фигура 1. Развитие на плазмената концентрация на кверцетин след интраперитонеално приложение на единичен болус от еквимоларен P-кверцетин и естествен кверцетин.

Стойностите са изразени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM) (n=5 за група). *стр<0.05;><0.01;><0.001 vs.qgroup.="">кверцетин(50 mg/kg, ip.); PQ: 100 mg/kgi.pP-кверцетин(съдържащ 50 mg/kgкверцетин).

Таблица 1. Фармакокинетични параметри след интраперитонеално приложение на P-кверцетин и естествен кверцетин (n=5 за група).

Въпрос: кверцетин(50 mg/kg, ip; PQ: P-кверцетин(100 mg/kg, ip). AUCo24: площ под частичната крива; AUCo: площ под общата крива; MRT: средно време на престой; t1/2: елиминационен полуживот; X: наклон на крайната фаза.

Таблица 1 показва независимите от модела фармакокинетични параметри накверцетинпри плъхове след прилагане на единична болус доза естественкверцетинили П-кверцетин. Времето до Cmax беше увеличено от 15 минути (за естественикверцетин) до 1 час (за P кверцетин). Това забавяне може да се дължи на продължителното освобождаване накверцетинот мицеларната формула. Общата експозиция на плъхове на флавоноида е значително по-висока за P-кверцетин, както се вижда от по-голямата площ под кривата (AUC), което се превръща в 302,5 процента по-висока бионаличност. Тези резултати предполагат, че по-високата разтворимост на мицеларната формула подобрява нейната абсорбция.

2.2. Изследване на ефикасността на Nephroprotectioe 2.2.1. Физиологично състояние

Както се вижда от развитието на телесното тегло (Фигура 2а), общото здраве се влошава след лечение с цисплатин в сравнение с контролните животни. Нито естественокверцетиннито П-кверцетинзначително променя ефекта на цисплатина. Обаче и дветекверцетинлеченията почти напълно предотвратиха увеличаването набъбрек/телесно тегло съотношение, предизвикано от цисплатин (Фигура 2b), параметър, за който е известно, че корелира със степента на отслабване нанефротоксичност[32].

Фигура 2. Развитие на общото здравословно състояние. (a) Процентно изменение на телесното тегло през експеримента; (b) Съотношение бъбрек/телесно тегло на ден 9.

Стойностите са изразени като средна стойност ± SEM (n=3-5 за група). *стр<><0.01;><0.001vs.controlgroup.><0.05;><0.01 vs.="" cp="" group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,="" i.p.)on="" day="">

CP плюс Q:кверцетин(50 mg/kg, ip) за 9 дни и цисплатин (6,5 mg/kg, ip) на ден 3; CP плюс PQ:P-кверцетин(100 mg/kg, ip) за 9 дни и цисплатин (6,5 mg/kg, ip) на ден 3.

2.2.2. Бъбречна функция и оценка на бъбречната тъкан

Съгласно международните критерии AKI се определя и диагностицира според повишаване на концентрацията на плазмения креатинин (Crp) [33-35], сурогатен маркер на скоростта на гломерулна филтрация (GFR). Други параметри, като плазмената концентрация на урея, също често се оценяват като показатели за азотемия [36-38]. Увеличаването на Crp и плазмената урея са признаци на намалена GFR и AKI. В нашето проучване бъбречната функция е силно увредена от цисплатин и този ефект е частично подобрен откверцетин. P-кверцетинпоказа малко по-смела активност от естественатакверцетин, както е показано от по-леко увреждане и подобрен профил на възстановяване (Фигура 3). Плъховете в групата на цисплатин (CP) са претърпели явно AKI, тъй като са имали прогресивно и значително повишаване на плазмените си нива на креатинин и урея в сравнение с тези на контролите (Фигура 3a, b). Тези параметри също се повишават в групите CP плюс Q и CP плюс PQ, но в значително по-малка степен. Разликите между групите CP плюс Q и CP плюс PQ не са статистически значими, но плъховете, третирани с P-кверцетинпоказаха малко по-ниски нива на креатинин и урея от тези, лекувани с естественикверцетин. Креатининовият клирънс (ClCr) е стандартен метод за измерване на GFR ]39,40]. В съгласие с данните за Cr, цисплатинът предизвиква дълбоко спадане, което е частично смекчено откверцетин(Фигура 3в). В този случай обаче се наблюдава забележима разлика между P-кверцетин и естествения кверцетин, като първият е значително по-ефективен за подобряване и ускоряване на възстановяването. Трябва да се отбележи, че Clcr и Crpl се държат обратно пропорционално, което е очевидно само в стационарно състояние. По време на AKI, обаче, бъбречната функция непрекъснато и бързо се променя, което води до леко разединяване на тази връзка.

Фигура 3. Развитие на бъбречните параметри.

(a) Плазмена концентрация на креатинин; (b) Плазмена концентрация на урея; (c) Креатининов клирънс; (d) Протеинурия; и (e)KIM-1 отделяне на урина.

Стойностите са изразени като средна стойност±SEM(n=3-5 за група). *стр<><><0.001 vs=""><0.05;><0.01vs.cp group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,i.p.)on="" day="">

CP плюс Q:кверцетин(50 mg/kg, ip) за 9 дни и цисплатин (6,5 mg/kg, ip) на ден 3; CP плюс PQ:P-кверцетин(100 mg/kg, ip.) за 9 дни и цисплатин (6,5 mg/kg, ip.) на ден 3. KIM-1:бъбрекнараняванемолекула1.

Протеинурията също често се измерва в контекста на бъбречна патология. В зависимост от основния модел на увреждане, протеинурията може да има гломерулен произход (т.е. повишена пропускливост на гломерулната филтрационна бариера) или, както в случая с цисплатиннефротоксичност[13], може да възникне от дефектна тубулна реабсорбция поради тубулно увреждане. Незначително увеличение на протеинурията беше открито в CP и CP-Q групите (макар и по-слабо изразено в последната) на 7-ия ден, което се върна към нормалното до 9-ия ден. По подобен начин, екскрецията с урината на биомаркер за тубулно увреждане (т.е.бъбрекнараняванемолекула 1; KIM-1)[41,42] беше значително повишен от цисплатин и това увеличение беше отслабено от двете форми накверцетин, въпреки че П-кверцетинотново беше малко по-ефективен.

Хистологичното изследване на бъбречната тъкан е в съответствие с биохимичните находки. Проби от плъхове, третирани с цисплатин, показват масивна тубулна некроза в горната ивица на външната медула, придружена от известно кортикално засягане икверцетиннамалено кортикално увреждане (Фигури 4 и 5). Плъхове, които са получили само нефротоксичния агент, развиват тубулна дилатация и обструкция (вижда се като натрупан хиалинов материал) и тубулна некроза с деепителизация и клетъчно отлепване. И дветекверцетинлеченията по подобен начин намаляват кортикалното увреждане, предизвикано от цисплатин, но нямат ефект върху медуларното увреждане (фигури 4 и 5).

Фигура 4. Представителни изображения на бъбречни проби, оцветени с хематоксилин и еозин.

Черни стрелки: тубулна некроза и отделяне на клетките; сини стрелки: тубулни разширения; зелени стрелки: интратубуларни отлагания на хиалинов материал. CP: цисплатин (6,5 mg/kg, ip) на ден 3;

CP плюс Q:кверцетин(50 mg/kg, ip) за 9 дни и цисплатин (6,5 mg/kg, ip) на ден 3; CP плюс PQ:P-кверцетин(100 mg/kg, ip) за 9 дни и цисплатин (6,5 mg/kg, ip) на ден 3.

Фигура 5. Количествено определяне на бъбречното увреждане.

Стойностите са изразени като средна стойност ± SEM (n =5 изображения × 3 плъха на група). * стр<><0.001 vs.=""><0.05 vs.cp="">

CP: цисплатин (6,5 mg/kg, ip.) на ден 3; CP плюс Q:кверцетин(50 mg/kg, ip за 9 дни и цисплатин (6,5 mg/kg, ip) на ден 3; CP плюс PQ:P-кверцетин(100 mg/kg, ip) за 9 дни и цисплатин (6,5 mg/kg, ip) на ден 3.AU: произволни единици.

3. Дискусия

Нашите резултати показват, че мицеларна формула накверцетинс Pluronic F127 (P-кверцетин), носещи подобрени биофармацевтични свойства, повиши бионаличността на този антиоксидантен флавоноид и запази (или дори леко подобри) неговите цялостни нефропротективни свойства в сравнение с естественитекверцетин.

кверцетине постулиран като обещаващ кандидат за защита срещу бъбречно увреждане, причинено от редица лекарства и токсини, включително цисплатин [25,26], метотрексат [43.44], ципрофлоксацин [45], NaF [46], HgCl [47l и кадмий [48]. Въпреки че тези проучвания показват предклинична ефикасност,кверцетинне е тестван в подобни клинични сценарии поради пречки във формулировката и ниска бионаличност, с изключение на клинично проучване, в коетокверцетинпредоставя известна защита от CIN [27]. И двете ограничения са следствие от много слабата разтворимост във вода (само 0.01 mg/mL, при 25 градуса [49]) накверцетини на неговата ниска стабилност (която се влияе от температура, рН, хидроксилиране, ензимна активност и метални йони)[28,29,50]. Приложен пероралнокверцетине изправен пред обширно разграждане по време на стомашния транзит поради много ниското рН на стомаха (т.е. 1,5)[50]. В тънките черва, химически защитени от по-високо рН (7,5), останалитекверцетинсе абсорбира само минимално. Следователно, за да се увеличи неговата бионаличност и биологична ефикасност, са разработени нови формулировки на кверцетин с цел подобряване на неговата хидроразтворимост, както и защита на активните му части от разграждане, включително липозоми, наночастици, наноемулсии и мицели [28].

Нашата мицеларна формула с Pluronic F127 увеличавакверцетиндесетократна разтворимост и при in vitro проучвания показва по-добро поведение при разтваряне в симулирани стомашни и чревни течности, тъй като постига значително намаляване на размера на частиците и по-хомогенна дисперсия накверцетинв полимерната матрицаI3l. Тази формула доставя значително увеличено количествокверцетинкъм кръвния поток, което води до 3-кратна бионаличност, която, странно, се превръща само в малко по-висок нефропротективен ефект. Съгласни сме, че не наблюдавахме допълнителен нефропротективен ефект, когато използвахме по-висока доза (т.е. 100 mg/kg) естественкверцетинв предишни експерименти (нашите непубликувани наблюдения)[25,26]. В тези проучвания нашата интерпретация беше, че вероятно по-високи дози ipкверцетин(i.e., >50 mg/kg) не се превърна в повишена бионаличност поради намалената разтворимост, което не доведе до значително повишена нетна абсорбция. Това съвпадна с жълти отлагания на неабсорбиранкверцетиноткрити в перитонеалната кухина при жертвоприношението. Освен това, нашите настоящи резултати показват, че дори по-високи плазмени концентрации на кверцетин (като тези, получени с P-кверцетин) се превръщат в само малко по-висок ефект. защотокверцетинразпределението е обяснено в опростена форма чрез модел от първи ред с две отделения [51], достъпът до целевите клетки от основното отделение (т.е. кръвния поток) изглежда не е ограничението. По този начин причината, поради която максималният нефропротективен ефект е почти постигнат с по-ниските плазмени концентрации, получени от естествения кверцетин, остава неуловима.

Това има практически последици за по-нататъшното развитие накверцетинкато профилактичен нефропротектор. Първо, тези резултати отварят възможността за изследване дали режимите с по-ниски дози ще бъдат еднакво ефективни, като голям излишък на бионаличност на P-кверцетинмогат да бъдат пожертвани, без да се губи какъвто и да е терапевтичен ефект, но ще се увеличи максимално профила на сигурност. Второ, вече е отворена възможността за перорално приложение, което въпреки това трябва да бъде тествано за новата формулировка. Абсорбцията от перитонеалната кухина избягва бариерите, срещани по оралния път. Хипотезата е, че по-високата разтворимост в чревния лумен може да доведе до повишаване и установяванекверцетинбионаличност в рамките на терапевтичния прозорец. Трето, интравенозният път сега може да бъде реалистична алтернатива с минимизирана токсичност, която би избегнала бариерите за абсорбция. Досега експериментални инжекционни форми накверцетинизползва диметилсулфоксид (DMSO) като разтворител [51].

Известно е, че цисплатинът се натрупва в и уврежда проксималните и дисталните тубули и индуцира апоптоза и некроза на епителните клетки на тубулите, в зависимост от концентрацията [16]. Проксималният сегмент S3 е най-засегнат, въпреки че S1 и S2 също се увреждат все повече от по-високи дози. В съгласие с известните му антиапоптотични свойства върху тубулните клетки [52,53],кверцетиннамалена кортикална тубулна деепителизация. Идентичният ефект, наблюдаван при двете формулировки, засилва идеята, чекверцетинкинетика на разпределение набъбрециса наситени в нашето изследване. Освен това в рамките набъбреци, кверцетинпоказва различно поведение по протежение на нефрона. Всъщност,кверцетинняма ефект върху външната медула, където се намира сегментът S3 на проксималните тубули.кверцетинизглежда се натрупва в S1, S2 или дисталните тубули, които са разположени близо до кората. Тъй като не е известно как (т.е. кои транспортери или дифузионни пътища) и откъде (т.е. луминалната или базолатералната страна)кверцетинима достъп до тубулни клетки, необходими са повече изследвания, за да се обяснят тези диференциални ефекти.

Умереното запазване на кортикалната тъкан може да обясни само частично ефекта откверцетинвърху бъбречната функция (т.е. GFR). Допълнителна защита може да възникне от съдовите ефекти накверцетин. Ендотелната функция участва в регулирането на бъбречния кръвен поток (RBF) и GFR чрез модулиране на аферентния и еферентния артериолен контрактилен тон [54-57]. Цисплатинът индуцира ендотелна дисфункция и се смята, че това значително допринася за спада на GFR, заедно с бъбречната аферентна вазоконстрикция, предизвикана от механизмите на тубулогломерулна обратна връзка (активирани от тубулно увреждане) и от възпалителни цитокини [13,58]. Наистина, обръщането на ендотелната дисфункция е широко признат ефект накверцетин(и на флавоноидите като цяло)[59-61l, което може да обясни защокверцетинподобрява RBF (и следователно GFR), както беше съобщено по-рано [25]. В допълнение, тези ендотелно-съдови ефекти могат също да помогнат да се обясни малко по-високата ефективност на P-кверцетинза подобряване на бъбречната функция и възстановяване на бъбречната функция. Вероятно не е неразумно да се спекулира, че по-високата бионаличност може да има по-силен ефект върху ендотелния умивалник в пряк контакт с кръвта.

Някои от ефектите, наблюдавани след прилагането накверцетинможе да се упражнява от неговите метаболити.кверцетинсе метаболизира в чревната лигавица и черния дроб чрез реакции на глюкурониране, сулфатиране и метилиране [62], като най-разпространените метаболити са глюкуронидни метаболити в кръвния поток [63]. по-конкретно,кверцетинДоказано е, че -3-bO-глюкуронидът (Q3GA), основен плазмен метаболит, упражнява противовъзпалителни и съдови ефекти, както директно, така и след метаболизиране обратно до агликонова форма [64]. Необходими са повече изследвания, за да се разберат специфичните метаболити, отговорни за неврозащитата и тяхното различно производство и трансформация от различни места на приложение до крайните им цели.

В заключение, това първоначално проучване показва терапевтичния потенциал на P-кверцетинкато подобрена формула с подобрени биофармацевтични и фармакокинетични свойства, полезна за по-нататъшно развитие и проспективна клинична употреба при профилактиката нанефротоксичност.

Ползи от кверцетин върху нефротоксичността

4. Материали и методи

Всички химикали и реагенти са закупени от Merck (Дармщат, Германия), освен където е посочено друго.

4.1. Приготвяне на мицеларната формула (P-кверцетин)и ЕстественотокверцетинФормулиране

кверцетинхидрат (минимална чистота от 95 процента) е получен от Acros Organics (Мадрид, Испания) и етилен оксид-пропилен оксид блок съполимер Pluronic F127 (средно молекулно тегло 12,6 kDa, хидрофилно-липофилен баланс 22) е предоставен от BASF (Ludwigshafen am Rhein, Германия). За производството на мицеларната формула е използвана суперкритичната техника на утаяване с антиразтворителкверцетин/Pluronic F127 частици (P-кверцетин), както е описано по-рано [31]. Полученият Pluronic-кверцетинформулировката има относителен състав от 50 процента /50 процента w/w Pluronic F127/кверцетин. За естественотокверцетинформулировка,кверцетинбеше суспендиран в 0.16 процента Tween 20 във физиологичен разтвор, както е описано по-рано [25,26].

4.2. Животни и биоетика

Всички процедури бяха одобрени от Комитета по биоетика на университета в Саламанка и регионалното правителство на Кастилия и Леон, Министерство на земеделието и животновъдството (код: 0000037, 27 юли 2015 г.). С животните се работи в съответствие с указанията на Директива 2010/63/UE на Съвета на Европейската общност и действащото испанско законодателство за използване и грижа за опитни животни (RD53/2013, 01 февруари 2013 г.). Мъжки плъхове Wis-tar (200-250 g) са държани при контролирани условия на околната среда в съоръжението за животни на Университета в Саламанка, със свободен достъп до вода и стандартна храна.

4.3. Проучване за биологична достъпност

Плъховете бяха разделени на две експериментални групи: O (n=5), в които животните получиха единична p.доза откверцетин(50 mg/kg); и PQ(n=5), при които животните са получили единична ip еквимоларна доза от P-кверцетин(100 mg/kg (т.е. съдържащи 50 mg/kgкверцетин). Впоследствие бяха взети кръвни проби в епруветки, покрити с етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA) от малък разрез на върха на опашката в следните моменти: 0.25,0.5,1,2,8, 12 и 24 ч. Плазмата се получава чрез центрофугиране и 10 μL от 10 mM аскорбинова киселина (за да се избегнекверцетинразграждане） се добавя към 100 μL плазма и се замразява при -80 степен до нейния анализ.кверцетинконцентрациите се определят чрез метод с обратнофазова високоефективна течна хроматография (HPLC) с UV откриване. Използва се колона Prosper 3 um с размер на частиците С18, с подвижна фаза, съставена от 28 процента ацетонитрил и 72 процента от 0.2 процента воден разтвор на ортофосфорна киселина, при скорост на потока 1 mL/min. Дължината на вълната на детекция е 371 nm. Преди инжектиране в хроматографското оборудване, пробите бяха подложени на процес на глюкурониране за количествено определяне на общиякверцетин. За тази цел 1000 единици -глюкуронидаза от Helix pomatia в 0,1 М ацетатен буфер (pH 5) се добавят към 100 μL плазма и тази смес се инкубира при 37 градуса за 1 час . След това се провежда процес на екстракция със 100 μL от 0,5M80∶20 смес от ацетонитрил/оцетна киселина（три пъти）. След като супернатантата беше изпарена в поток от азот, сухият остатък беше повторно разтворен в 40 μL подвижна фаза и 20 μL бяха инжектирани в HPLC системата.

4.4. Проучване за нефропротекция

Плъховете бяха разделени на следните експериментални групи (Фигура 6): Контролните (n=3) животни получиха носител (NaCl0.9 процента) интраперитонеално (ip) за 9 дни; CP(n=5) животните получават единична нефротоксична доза цисплатин (6,5 mg/kg, ip) на ден 3 от експеримента; CP плюс Q(n=5) животните получават дневна доза откверцетин(50 mg/kg, ip) за 9 дни и единична доза цисплатин (6,5 mg/kg, ip) на ден 3; и CP плюс PQ (n=5) животните получават дневна доза P-кверцетин(100 mg/kg, ip (т.е. съдържащи 50 mg/kgкверцетин)) за 9 дни и доза цисплатин (6,5 mg/kg, ip) на ден 3.

Фигура 6. Схема на модела на нефротоксичност.

CP: цисплатин (6,5 mg/kg, ip) на ден 3; CP плюс Q:кверцетин(50 mg/kg, ip) за 9 дни и цисплатин (6,5 mg/kg, ip) на ден 3; CP плюс PQ:P-кверцетин(100 mg/kg, ip.) за 9 дни и цисплатин (6,5 mg/kg, ip.) на ден 3.

Кръвни проби （150 μL） бяха събрани на дни 0, 3, 5, 7 и 9 в хепаринизирани капиляри от малък разрез на върха на опашката. Плазмата се отделя чрез центрофугиране (11.000 rpm за 3 минути) и се държи при -80C. На дни 7 и 9, 24-часовата урина се събира в метаболитни клетки, изчиства се чрез центрофугиране (2000 × g за 9 минути) и се съхранява при -80 степен. В края на експеримента (ден 9), плъховете бяха анестезирани и технитебъбрецибяха дисектирани, претеглени и фиксирани в 3,7% параформалдехид за хистологични изследвания.

Креатининът в плазмата и урината се измерва с помощта на търговски комплект, базиран на метода на Jaffe [65] (QuantiChrom Creatinine Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA). Плазмената урея се определя с помощта на търговски комплект, базиран на метода на Jung [66] (Quan-tiChrom Urea Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA). Креатининовият клирънс (Clcr) се изчислява по формулата: Clcr=Crur × UF/Crp); където Crur съответства на концентрацията на креатинин в урината, UF е поток на урина, а Crp е плазмената концентрация на креатинин. Протеинурията се измерва с теста на Брадфорд [67]. KIM-1 се определя количествено с помощта на ПлъхБъбрекнараняванемолекула 1 (KIM-1) ELISA комплект (Кусабио, Хюстън, Тексас, САЩ). следвайки инструкциите на производителя.

За хистологични изследвания, бъбречни проби се поставят в парафин и 5 um тъканни срезове се оцветяват с хематоксилин и еозин. Снимките са направени под микроскоп Olympus BX51, свързан с цветна цифрова камера Olympus DP70 (Olympus, Мадрид, Испания). Количественото определяне на щетите се извършва по сляп начин, както е описано по-горе [68]. Накратко, направени са пет произволни снимки на кортикалната област и пет снимки на външната медуларна област (т.е. зоните, увредени от цисплатина), като равномерно се картографират тези области. Всяко изображение беше разделено на 10 идентични секции (с помощта на софтуера Microsoft Office PowerPoint 2016), на всеки от които беше дадена оценка 0 (без щети), 1 (наличие на щети в по-малко от 1/3 от областта), 2 (наличие на щети между 1/3-2/3 от площта) или 3 (наличие на повреда в повече от 2/3 от площта). Увреждането беше оценено, като се взе предвид наличието на тубулна некроза и клетъчно отделяне, тубулна дилатация, вакуолизация, наличие на хиалинови отлагания и загуба на границата на четката.

4.5. Статистически анализ

Данните са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Отклоненията бяха идентифицирани с помощта на теста на Grubbs|69]. Нормалното разпределение на данните беше оценено с помощта на теста на Shapiro-Wilk. В изследването на бионаличността сравнението между двете групи е направено с помощта на t-теста на Student или U-теста на Mann-Whitney. Фармакокинетичното проучване е проведено чрез независим от модела анализ на средните плазмени нива накверцетин. Изчислените параметри за оценка на относителната бионаличност накверцетинбяха площта под частичната крива на плазмените нива (AUC)24, площта под общата крива на плазмените нива (AUC) 0~, наклонът на крайната фаза, полуживотът на елиминиране (ti/2) и средно време на престой (MRT). Оценката на фармакокинетичните параметри се извършва чрез комбиниране на трапецовиден метод за оценка на площта под частичната крива и нелинейната регресия на крайната фаза на кривата на плазменото ниво. За проучването за нефропротекция беше извършен анализ на дисперсията (ANOVA) с тестове на Scheffe или тест на Kruskal-Wallis за междугрупови сравнения. Статистическият анализ беше извършен със софтуера IBM SPSS Statistics 20.0 (International Business Machines, Armonk, NY, USA). Microsoft Office Excel и PowerPoint 2016 (Microsoft, Redmond, WA, USA) бяха използвани за създаване на произведения на изкуството и илюстрации.

Препратки

1. Аудишу, Л.; Mehta, RLThe6R's of Drug-InducedНефротоксичност. BMCNephrol.2017,18,124. [CrossRefl[PubMed]

2. Perazella, MADrug Употреба иНефротоксичноств Интензивно отделение.БъбрекInt.2012,81,1172-1178. [CrossRef] [PubMed]

3. Taber, SS; Mueller, BADrug-Associated Renal Dysfunction. Crit.Care Clin.2006,22,357-374, vi. [CrossRef] Huang, JX; Бласкович, MA; Cooper, MACell- и биомаркерни анализи за прогнозиранеНефротоксичност.

Забележка:горното не е пълен списък с референции