Защитни ефекти на Cistanche Tubulosa срещу H2O2/UVB-индуцирано разграждане на колаген от дермални фибробласти чрез Hsa-microRNA-4535-медиирано TGF/Smad сигнализиране

РЕЗЮМЕ

Това проучване имаше за цел да проучи механизма, който е в основата на защитните ефекти на цистанхата срещу H2O2/UVB-индуцирано увреждане, използвайки in vitro и in vivo модели на фотоувреждане. Освен това, ние идентифицирахме участието на miRNA регулация в този процес. Третираните с H2O2/UVB HS68 човешки дермални фибробласти и UVB-индуцирани голи мишки C57BL/6J бяха използвани като in vitro и in vivo модели на фотоувреждане. Резултатите показаха товалечение на цистанчеоблекчава индуцираното от H2O2/UVB намаляване на клетъчната жизнеспособност, TGF/Smad сигнализиращо увреждане и стареене на кожата. Въз основа на резултатите от анализи на микроРНК масиви и търсения в бази данни, has-miR-4535 беше идентифициран като потенциален кандидат miRNA, който е насочен към Smad4. Инвитро,лечение на цистанчеактивиран комплекс Smad2/3/4 и инхибира експресията на hsa-miR-4535 в клетки, изложени на H2O2/UVB. In vivo, локалното приложение на ниски (12 mg/kg) и високи дози (24 mg/kg) цистанхе върху дорзалната кожа на C57BL/6J голи мишки значително облекчава UVB-индуцираното фотоувреждане на кожата чрез насърчаване на TGF /Smad сигнализиране за синтез на колаген, намаляванеепидермална хиперплазия, образуване на бръчки истареене на кожата, както иинхибиране на експресията на hsa-miR-4535. Взети заедно, нашите открития показват връзка между hsa-miR-4535 и TGF /Smad сигнализиране за синтез на колагени предлагат тези фактори да бъдат включени вфотозащитен механизъм нацистанчев дермалните фибробластисрещу Х2O2/UVB-индуцирано стареене. Доказателствата сочеха, чецистанчессвойства против стареенеможе да бъдесчита се за добавка в продуктите за грижа за кожата.

Щракнете тук, за да получите Cistanche продукти против стареене

ВЪВЕДЕНИЕ

Клиничните признаци на стареене на човешката кожа включват увеличено набръчкване, отпуснатост и неправилна пигментация [1]. Процесът на стареене на кожата е сложен и може да бъде разделен на два вида: вътрешно стареене и външно стареене. Вътрешното стареене се дължи на времето и генетични фактори, докато външното стареене, наричано още фотостареене, е резултат главно от излагане на ултравиолетова радиация [2, 3]. Предишни проучвания показват, че изобилие от реактивни кислородни видове (ROS) се генерира както по време на вътрешното, така и на външното стареене. Натрупването на ROS може да индуцира митоген-активирана протеин киназа (MAPK) сигнализиране и да активира неговия транскрипционен фактор надолу по веригата, активаторен протеин -1 (AP-1). Активираният AP-1 може да се премести в ядрото и да се свърже с промоторните области на матричните металопротеинази (MMP) [4]. MMPs са голяма цинк-зависима ендопептидазна група, допринасяща за разграждането на екстрацелуларния матрикс на дермата на кожата (ECM). По-специално, MMP-1, колагеназа, участва в разцепването на колаген тип I и III [5]. Колаген тип I и III, основните компоненти на ECM, са способни да осигурят подкрепа и сила на дермата на кожата и тяхното разстройство води до характерното набръчкване и отпуснатост на остарялата кожа [6]. Трансформиращият растежен фактор-бета (TGF) е повсеместен и мощен цитокин с три различни изоформи, TGF 1, TGF 2 и TGF 3, които могат положително да регулират синтеза на колаген в дермата на човешката кожа [2]. TGF инициират техния сигнал чрез взаимодействие със специфични серин/треонин киназни рецепторни комплекси на клетъчната повърхност, включително TGF рецептор тип I (T RI) и II (T RII). T RI фосфорилирането задейства фосфорилирането на R-Smads (Smad2 и Smad3). Активираните R-Smads взаимодействат със Smad4, за да регулират неговата транслокация на ядрото и транскрипционно активират колаген тип I и III чрез свързване към промотори на Smad-свързващи елементи (SBE) [7, 8]. Натрупващи се доказателства показват, че повишеното генериране на ROS, предизвикано от присъщо или фотостареене, допринася за увреждане на сигналния път на TGF /Smad, което от своя страна води до намален синтез на колаген в дермалните фибробласти на човешката кожа [9, 10].

cistanche (3,5,7-трихидроксифлавон), естествен член на семейството на флавоноидите, е изобилен в Alpinia officinarum и прополиса. cistanche е потенциален кандидат за лечение на исхемичен инсулт, диабет и различни видове рак [11–13]. В допълнение, цистанхата притежава радикално очистващо и противовъзпалително действие [14, 15]. По-рано показахме, че цистанхата намалява H2O2-индуцираното възпаление и насърчава образуването на колаген чрез инсулиноподобен рецептор на растежен фактор 1 (IGFI-R)/ERK1/2 сигнални пътища в HS68 клетки [16, 17]. Освен това, проучване показва, че цистанхата е идентифицирана като съединение на Alpinia officinarum и притежава колагеназни инхибиторни ефекти в дермалните фибробластни клетки [18]. Въпреки това, не е известен по-подробен молекулярен механизъм, свързан с това как цистанхата регулира стареенето на кожата.

МикроРНК (miPHK) са група от малки, едноверижни, некодиращи РНК молекули със средна дължина от 22 нуклеотида. Зрелите miRNAs се транскрибират от ДНК последователности. В повечето случаи зрелите миРНК се свързват с 3'-нетранслираните региони (UTRs) на целевите иРНК, за да заглушат транслацията на иРНК [19]. В човешката кожа miPHK играят решаваща роля в регулирането на клетъчния метаболизъм, рака, стареенето и образуването на колаген [20–23]. Например, miR-377 може да индуцира стареене на дермални фибробласти чрез инхибиране на експресията на ДНК метилтрансфераза 1 (DNMT1), което впоследствие води до по-малко метилиране в промотора на p53 и стареене на дермални фибробласти [22]. Профилът на miPHK при UVB-индуцирано увреждане при човешка кожа

папилни клетки (nHDPs) е изследван преди [24]. Въпреки това, как UVB-индуцираното стареене на дермални фибробласти чрез регулиране на miRNA, особено при участието на естествено съединение, е до голяма степен неизвестно. Това проучване имаше за цел да изследва защитните ефекти на цистанхата срещу H2O2/UVB-индуцирано дермално увреждане, както и ролята на микроРНК-медиираната деградация на колаген в този процес. Освен това имахме за цел да идентифицираме микроРНК, участващи в регулирането на синтеза на колаген.

РЕЗУЛТАТИ

cistanche инхибира UVB/H2O2-индуцирана цитотоксичност в HS68 човешки дермални фибробласти

За да се изследва цитотоксичността на цистанхе (Фигура 1А) in vitro, клетките HS68 бяха третирани с различни дози цистанхи (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) за 24 ч. Резултатите от МТТ анализа показват, че цистанхата не е цитотоксична за HS68 клетки (Фигура 1В). След това изложихме HS68 клетки на различни дози H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) и UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) за 24 часа. Лечението с H2O2 и UVB намалява жизнеспособността на клетките по дозозависим начин (Фигура 1C, 1D). За да оценим цитопротективните свойства на цистанхата след излагане на H2O2 и UVB, ние третирахме HS68 клетка с различна концентрация на цистанхе (10, 20, 30 μM) след H2O2- (200 μM) и UVB-индуцирана (40 mJ/cm² ) щета. Само H2O2 или UVB третиране

ефекти в HS68 клетки.

За да определим дали намаляването на клетъчната жизнеспособност се дължи на клетъчна смърт или инхибиране на растежа, ние проверихме експресията на няколко апоптоза и маркери за оцеляване чрез Western blotting в HS68 клетки, изложени на различни дози H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 μM) за 24 ч. Открихме значително намалена експресия на маркери за оцеляване, като p-Akt, и повишена експресия на

Фигура 1. Cistanche инхибира UVB/H2O2-индуцирана цитотоксичност в HS68 човешки дермални фибробласти. (A) Химическата структура на цистанхата. (B) Клетъчна жизнеспособност на клетки HS68, третирани с различни концентрации на цистан (10, 20, 30, 40, 50 µM ) за 24 часа. (C и D) Клетъчна жизнеспособност на HS68 клетки, изложени на различни дози H2O2 (100, 150, 200, 250, 300 µM) или облъчени с UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) за 24 часа. (E и F) Клетъчна жизнеспособност на HS68 клетки, изложени на H2O2 (200 µM) или облъчени с UVB (40 J/cm2) за 1 час и след това третирани с цистанх (10, 20, 30 µM) за 23 часа. Цитопротективните ефекти на цистанхата се определят чрез МТТ анализ. На контролните клетки се определя 100 процента жизнеспособност. Стойностите са показани като средни ± SE. Показано е количествено определяне на резултатите (n=3) *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 спрямо нетретирани контролни клетки; ##P < 0,01, ###P < 0,001 спрямо H2O2 или UVB-третирани клетки.

Фигура 5. Hsa-miR-4535 е насочен към Smad4. (A) Експресията на микроРНК в HS68 клетки, третирани с цистанче, се оценява с помощта на микрочипове. (B) Диаграма на Venn, изобразяваща потенциални кандидати за иРНК, които могат да бъдат регулирани от hsa-miR-4535 въз основа на бази данни miRDB и TargetScanHuman. Анализ на последователността на предполагаеми miRNA-свързващи места в Smad4-3′-UTR иРНК за hsa-miR-4535. Съвпаденията са обозначени с прави линии. (C) HS68 клетки бяха котрансфектирани със Smad4-3′-UTR-WT (див тип; 0.5 µg/mL) плюс hsa-miR-4535 мимик (2{ {25}} nM) или Smad4-3′-UTR MT (мутант; 0.5 µg/mL) плюс hsa-miR-4535 мимик (20 nM) за 24 часа. Луциферазната активност се определя и нормализира до тази на Renilla. Показано е количествено определяне на резултатите (n=3); ***P <0,001, спрямо мимическата група Smad4-3′-UTR-MT плюс hsa-miR-4535. G1=контрола, G2=цистанш (10 μM), G3=цистанш (30 μM)