Защитни ефекти на кверцетин върху индуцирано от оксидативен стрес тубуларно епително увреждане в експерименталния модел на хипероксалурия на плъх

За повече информация. контактtina.xiang@wecistanche.com

Резюме: Предистория и цели: Най-често срещанитекамъни в бъбрецитеса калциеви камъни, а камъните от калциев оксалат (CaOx) са най-често срещаният тип калциеви камъни. Хипероксалурията е основен рисков фактор за образуването на тези камъни.кверцетине полифенол с антиоксидантни, противовъзпалителни и много други физиологични ефекти. Целта на това проучване е да се изследва защитният ефект на кверцетин при индуцирана от хипероксалурия нефролитиаза. Материали и методи: Мъжки плъхове Wistar-Albino с тегло 250-300 g (n=24) бяха рандомизирани в три групи: контрола (n=8), етилен гликол (EG)(n{{6 }}) и EG плюс кверцетин (n=8). Един процент EG-воден разтвор беше даден на всички плъхове с изключение на контролната група като вода за пиене в продължение на пет седмици. Разтвор на кверцетин-вода беше даден на групата EG плюс кверцетин чрез орална сонда в доза от 10 mg/kg/ден. Нивата на малондиалдехид (MDA), каталаза (CAT), урея, калций и оксалат бяха анализирани в проби от кръв и урина. Хистопатологични оценки и имунохистохимични анализи заоксидативен стресивъзпалениеиндикатори p38 митоген-активирана протеин киназа (p38-MAPK) и ядрен фактор kappa B (NF-kB) бяха проведени върху бъбречни тъкани. Резултати: Нивата на MDA са значително по-ниски в групата, лекувана с кверцетин, отколкото в групата, лекувана с EG (p=0.001). Въпреки че нивата на CAT са били по-високи в групата, лекувана с кверцетин, отколкото групата, прилагана с EG, те не са били значително различни между тези групи. Експресията на p38 MAPK е значително по-малка в групата, лекувана с кверцетин, отколкото в групата на EG (p<0.004). there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" quercetin="" and="" eg="" groups="" in="" terms="" of="" nf-kb="" expression.="" conclusions:="" we="" conclude="" that="" hyperoxaluria="" activated="" the="" signaling="" pathways,="" which="" facilitate="" the="" oxidative="" processes="" leading="" to="" oxalate="" stone="" formation="" in="" the="" kidneys.="" our="" findings="" indicated="" that="" quercetin="" reduced="" damage="" due="" to="" hyperoxaluria.="" these="" results="" imply="" that="" quercetin="" can="" be="" considered="" a="" therapeutic="" agent="" for="" decreasing="" oxalate="" stone="" formation,="" especially="" in="" patients="" with="" recurrent="" stones="" due="" to="">

Ключови думи: калциев оксалат; хипероксалурия; оксидативен стрес; кверцетин

Щракнете тук, за да научите повече продукти

1. Въведение

Образуването на камъни в урината включва няколко фактора, включително концентрацията на йони, причиняващи образуването на камъни, рН на урината, скорости на уринарния поток и анатомия на пикочните пътища [l]. Приблизително 75 процента от бъбречните камъни са калциеви камъни, а камъните от калциев оксалат (CaOx) са най-често срещаните калциеви камъни [2,3]. Известно е, че хипероксалурията е основен рисков фактор за образуването на тези камъни. Полученото увеличение на концентрацията на оксалат в урината предизвиква образуване на камъни чрез калциеви и оксалатни йони за образуване на кристали CaOx при физиологично pH. Беше демонстрирано, че излишната концентрация на оксалат уврежда клетките на бъбречните тубули чрез свободни кислородни радикали и повишена липидна пероксидация и този процес улеснява както образуването на CaOx кристали, така и тяхното прикрепване към епитела на бъбречните тубули [4,5].

Въпреки подобренията в лечението на камъни в бъбреците, честотата на рецидив от 10 процента за една година, 35 процента за пет години и 50 процента за десет години се съобщава за калциево-оксалатни камъни [6,7]. Тези високи нива на рецидиви накараха изследователите да проучат потенциални превантивни методи за повторна поява на CaOx камъни [6-8].

кверцетине флаванол, открит в различни храни, включително ядки, вино, семена и някои плодове и зеленчуци [8]. В допълнение към мощните си антиоксидантни, улавящи радикали и противовъзпалителни действия, той има и антибактериални, антивирусни, гастропротективни и имуномодулиращи действия [8-10].

Увеличаване на оксидативния стрес е показано при пациенти с камъни в бъбреците [11]. Като такъв, по-нисък риск от нефролитиаза се съобщава при пациенти с високи нива на антиоксиданти, отколкото при тези с ниски нива на антиоксиданти [12]. Беше показано, че плаките на Randall, за които се смята, че се образуват поради оксидативен стрес, имат съществена роля при повторната поява на CaOx камъни [13]. Следователно, инхибирането на образуването на плака Randall и оксидативния стрес може да бъде от полза за предотвратяване на повторна поява на камъни.

Това проучване изследва възможния защитен ефект на кверцетин при нефролитиаза и нефрокалциноза чрез определяне на въздействието му върху оксидативния стрес и възпалението в модел на хипероксалурия при плъх.

2. Материали и методи

2.1.Животни

Мъжки плъхове Wistar-Albino с тегло 250-300 g (n =24) бяха използвани в това експериментално изследване, проведено в лабораторията за експериментални животни на университета Süleyman Demirel. Плъховете бяха настанени в стая, поддържана при 25±1 градуса с 55 процента относителна влажност. Давани са им храна и вода ad libitum. Проучването е проведено след получаване на одобрение от Комитета за етичен преглед на експериментите с животни на университета Süleyman Demirel (номер на одобрение: 33/01). Всички експерименти са извършени въз основа на етичните принципи, докладвани в Директива 2010/63/ЕС на Европейския съюз за експерименти с животни.

2.2. Химикали

Етилен гликолът (EG) е закупен от Merck Chemicals (Дармщат, Германия), докато кверцетинът е закупен от Sigma Chemicals (Сейнт Луис, Мисури, САЩ).

2.3. Модел на индуцирана от хипероксалурия нефролитиаза и приложение на кверцетин

Плъховете бяха разделени на случаен принцип в три групи; контролни (n{{{{10}}}), EG(n =8) и EG плюс кверцетин (n =8) групи. Всички плъхове, с изключение на контролната група, получават 1% разтвор на EG-вода като вода за пиене в продължение на пет седмици [14]. Доза от 10 mg/kg/ден от разтвора кверцетин-вода се прилага на плъхове в групата на EG плюс кверцетин чрез орална сонда. Двадесет и четири часови проби от урина бяха събрани от животните в деня 0 преди прилагането на EG или кверцетин и на дни 15 и 30. Плъховете бяха анестезирани в края на петседмичния експериментален период и бяха събрани кръвни проби от долната куха вена. След това плъховете бяха умъртвени и двата бъбрека бяха бързо изрязани. Десните бъбреци бяха вградени в 10 процента неутрален буфериран формалдехид. Левите бъбреци се промиват със студен 0,9% разтвор на натриев хлорид и се съхраняват при -80 градуса до хомогенизиране.

2.4.Биохимични анализи

Анализът на плазмените нива на оксалат се извършва чрез техниката, описана по-рано от Ladwig et al. [15]. Нивото на оксалат в урината се определя от ензимния комплект Trinity Biotech Oxalate (Trinity Biotech pic, St. Louis, MO, USA). Каталазата (CAT) е антиоксидантен ензим [10,16]. Каталазната активност се измерва по метода Aebi [16]. Нивата на супернатантен протеин се анализират чрез говежди серумен албумин, използвайки метода на Lowry, както е описано в стандартния протокол [17]. Нивата на малондиалдехид (MDA) също бяха анализирани, тъй като MDA се счита за биомаркер на оксидативен стрес [9]. Нивата на малондиалдехид се измерват спектрофотометрично съгласно метода, предложен от Ohkawa et al. [18] Откриването на протеин се извършва с помощта на метода, описан от Lowry et al. [17]. Нивата на креатинин в плазмата и урината се измерват чрез колориметрия по метода на Jaffe; плазмените концентрации на урея се анализират чрез кинетично-колориметрични методи и уреазни и глутамат дехидрогеназни реакции. Обратно, нивата на калций в урината се измерват с автоанализатор чрез Schwarzenbach и метода на о-крезолфталеиновия комплекс. Бяха събрани проби от урина и кръв за изчисляване на креатининовия клирънс. Обемът на урината (V) се изразява в mL, докато нивата на креатинин в серума и урината се изразяват в mg/dl. Креатининовият клирънс се изчислява по формулата:

Креатининов клирънс (mL/min)=U(mg/dL) × V(mL/min)/S (mg/dL) [V: Обем на урината (mL/min), U: Креатинин в урината (mg/ dL), S: Серумен креатинин (mg/dL)]

2.5. Хистопатологични анализи

Десните бъбреци бяха вградени в 10 процента неутрален буфериран формалдехид (Merck-KGaA, Дармщат, Германия). Обработката на тъканите е започнала след 24-48 h период на фиксиране.Бъбректъканите се оцветяват с хематоксилин и еозин (H&E) и се изследват под светлинен микроскоп. Хистопатологичните изследвания бяха извършени с 10 ×, 20 × и 40 × увеличения, особено за оценка на съдовата конгестия както в медулата, така и в кортикалните гломерули, интензивността на мононуклеарната клетъчна инфилтрация и размерите и формите на тубуларния лумин.

2.6. Имунохистохимични анализи

Ядрен транскрипционен фактор-kB(NF-kB) и p38 митоген-активирана протеин киназа (p38-MAPK) са двата основни сигнални пътя на ниво протеин в биосинтеза на провъзпалителни цитокини [19]. В допълнение, оксалатът селективно активира p38-MAPK сигналния път [20]. Слайдовете бяха взети в инкубационния контейнер след блокиране. NF-kB/p65 антитялото (Santa Cruz, sc-109) се добавя към първата секция, MAPK/p38 антитялото (Santa Cruz, sc-7149) към втората секция и вторично антитяло ( Кози анти-поливалентен, Thermo) беше добавен към следващите секции за контролни цели и държан при плюс 4 градуса през нощта. ABCStaining Kit (Santa Cruz, sc-2018) беше използван за останалата част от протокола за оцветяване. Тъканта, покрита с ламела с помощта на Entella, се съхранява и изсушава за изследване със светлинен микроскоп. Секциите бяха степенувани, както следва, в зависимост от интензитета на оцветяване при светлинна микроскопия, както в изследването на Liu HS et al. [19]:（一）резултат （отрицателен резултат）∶ без оцветяване;

( плюс ) резултат (1 положителен резултат): лек;

(плюс плюс) резултат (2 положителни резултата): умерен;

(плюс плюс плюс) резултат (3 положителни резултата): налице е пълно оцветяване.

2.7.Статистика

Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуера Statistical Package for Social Sciences 11.0 (SPSS 11.0). Стойностите са дадени като средни стойности ± стандартни отклонения. Нормалното разпределение на променливите беше тествано чрез единичен тест на Колмогоров-Смирнов. Беше проведена еднопосочна ANOVA и, ако се докаже, че е значима, беше използван post hoc тестът на Duncan за оценка и определяне на разликите между групите. P-стойността се считаше за значима, когато беше под<>

3. Резултати

3.1. Биохимични резултати

Данните за проучвателната група са показани в таблица 1. Средното ниво на MDA на групата EG е по-високо от контролната група, докато средното ниво на MDA на групата на кверцетин е значително по-ниско от групата EG (p= 0.001) . Нямаше статистически значима разлика между групите по отношение на CAT активността. В нашето проучване нивата на MDA са намалени от кверцетин, докато CAT активността не се повлиява от кверцетин. Нивата на оксалат в урината са значително по-високи в групата на ЕГ, отколкото в другите групи (стр<0.001). however,="" the="" urinary="" oxalate="" levels="" of="" the="" quercetin="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" the="" eg="" group=""><0.001). these="" results="" indicated="" that="" quercetin="" reduced="" the="" urinary="" oxalate="" levels,="" which="" were="" increased="" by="" eg="" administration.="" while="" the="" plasma="" urea="" concentration="" increased="" significantly="" in="" the="" eg="" group="" compared="" to="" in="" the="" control="" group,="" a="" statistically="" significant="" decrease="" was="" observed="" in="" the="" quercetin="" group="" compared="" to="" the="" eg="" group=""><0.05). there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" groups="" in="" terms="" of="" creatinine="" clearance="" and="" plasma="" oxalate="" levels="" (p="">0.05). Въпреки че кверцетинът намалява нивото на плазмения оксалат, това не е статистически значимо. Концентрацията на калций в урината е значително по-ниска в другите групи, отколкото в контролната група (стр<0.05). however,="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" eg="" and="" quercetin="" groups="" in="" terms="" of="" mean="" urinary="" calcium="" concentrations.="" altogether="" these="" findings="" indicate="" that="" eg="" increased="" urinary="" oxalate="" excretion="" and="" plasma="" urea="" concentration="" and="" decreased="" urinary="" calcium="">

3.2. Хистопатологични резултати

Хистопатологичните изследвания на бъбреците на плъхове от контролната група под светлинна микроскопия показват нормални находки (Фигура 1-Контрол). Находки, включително конгестия в гломерулните съдове, мононуклеарна клетъчна инфилтрация и стесняване на тубулните лумени, особено в проксималните тубули, бяха открити в EG групата (Фигура 1-EG). Подобни хистопатологични находки са наблюдавани в групата на кверцетин, но всички те са били по-леки (Фигура 1-EG плюс кверцетин). Въпреки това не е използвана точкова система, за да се оцени дали тази разлика е статистически значима.

3.3. Имунохистохимични резултати

Въздействието на кверцетин върху р38 митоген-активирана протеин киназа (p38-MAPK) и ядрен фактор kappa B(NF-kB) е изследвано чрез имунохистохимично оцветяване на бъбречните тъкани (Фигура 2). Сравнението на групите по отношение на p38-MAPK изясни, че бъбречните тъкани на плъховете от групата EG са оцветени значително по-интензивно от тези на плъховете от контролната група (p<0.001). on="" the="" other="" hand,="" p38-mapkstaining="" was="" significantly="" less="" intense="" in="" the="" quercetin="" group="" than="" in="" the="" eg="" group.="" the="" statistical="" analysis="" revealed="" that="" quercetin="" reduced="" p38-mapk="" activity="" significantly="" compared="" to="" the="" eg="" group=""><>

Сравнение на групите по отношение на имунооцветяването с NF-kB разкри, че бъбречните тъкани на плъховете в групата EG са оцветени значително по-интензивно от тези на плъховете в контролната група (p<0.001). there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" other="" groups="" in="" terms="" of="" the="" intensity="" of="" nf-kb="" staining.="" altogether,="" these="" findings="" pointed="" out="" that="" eginduced="" the="" p38-mapk="" and="" nf-kb="" activities="" in="" renal="" tissues.="" additionally,="" quercetin="" significantly="" reduced="" p38-mapk="" activity="" while="" it="" had="" no="" significant="" effect="" on="" nf-kb="" activity.="" the="" relevant="" data="" are="" displayed="" in="" table="">

4. Обсъждане

Въпреки напредъка в минимално инвазивните методи за лечение на нефролитиаза, високите нива на остатъчни камъни и рецидиви все още представляват сериозни проблеми за пациентите и уролозите [21]. Следователно са необходими ефективни стратегии за медицинско лечение.

Точните механизми на образуване на камъни не са идентифицирани; въпреки това е известно, че приблизително 80 процента от камъните в бъбреците съдържат CaOx и една от най-честите причини за CaOx камъни е хипероксалурията [1,22]. Оксалатът е страничен продукт от нормалния метаболизъм, елиминиран от тялото при нормални условия [20]. При хипероксалурия. излишъкът от оксалат в урината се свързва с калций при физиологично pH и образува CaOx кристали, натрупващи се в бъбреците. Показано е, че кристалите CaOx увреждат епителните клетки на бъбречните тубули и водят до бъбречно-каменна болест [14,20]. Следователно моделите на плъхове с хипероксалурия са били широко използвани за имитиране на образуването на камъни в бъбреците при хора. В тези проучвания EG се използва като агент, предизвикващ хипероксалурия, какъвто беше случаят в нашето проучване [14,20].

Съобщава се, че концентрацията на оксалат в урината се повишава в рамките на два дни, хипероксалурия се развива в рамките на три дни, CaOx кристалурия се развива в рамките на две седмици и CaOx нефролитиаза се наблюдава в рамките на {{0}} седмици, когато 0.{{2} } процента EG се прилага за предизвикване на хипероксалурия [14,22]. В края на този процес другите фактори на урината и креатининовият клирънс остават в нормални граници, докато рН на урината и екскрецията на цитрат са значително намалени [14,22]. В нашето проучване ние индуцирахме хипероксалурия чрез прилагане на 1% EG, което впоследствие доведе до клетъчно увреждане в тубулните клетки.

При хипероксалурия, натрупването на кристали CaOx в лумена на колекторния канал на бъбречната папила и произтичащите от това подобни на камък отлагания водят до обструкция, което проправя пътя за влошаване на бъбречната функция. В резултат на този процес кръвните нива на азотни отпадъчни продукти, като пикочна киселина, уреен азот в кръвта и креатинин, могат да се повишат [22,23]. В нашето проучване, бъбречната дисфункция беше демонстрирана чрез значително повишаване на серумните нива на урея при животните, третирани с EG. Въпреки това, лечението с кверцетин значително намалява серумните нива на урея.

Кверцетинът е молекула с мощни антиоксидантни и противовъзпалителни ефекти [24]. Намира се в зеленчуци, плодове, чай и много видове храни. В допълнение към това, че е силен чистач на реактивни кислородни видове (ROS), кверцетинът повишава общия плазмен антиоксидантен капацитет [25,26]. В някои проучвания се съобщава, че флавоноидите намаляват оксидативния стрес в бъбречните тубулни клетки, предотвратяват натрупването на CaOx кристали и намаляват липидната пероксидация, предизвикана от оксалат в клетъчни култури [27,28].

Широко прието е, че оксидативният стрес играе значителна роля при образуването на камъни в бъбреците [12,22]. Кристалите CaOx се натрупват в бъбречната тъкан, което води до синтеза на няколко макромолекули, които инициират възпалителни и фиброгенни процеси. Реактивните кислородни видове най-вероятно участват в различни сигнални събития през този период [14]. При проучвания върху епителни клетъчни култури върху животни и бъбреци е показано образуването на свободни радикали в отговор на хипероксалурия и образуване на кристали CaOx [20,22]. Тъй като липидите са най-чувствителните биомолекули в клетъчната мембрана срещу свободните радикали, липидната пероксидация възниква в клетъчните мембрани [27,28]. Липидната пероксидация е основното събитие на клетъчно увреждане, тъй като разрушава структурата на мембраната и впоследствие причинява увреждане на клетките. MDA е индикатор за липидна пероксидация; това също показва, че ROS са свръхпроизведени [22,29]. Поради това се използва при оценката на липидната пероксидация. Известно е, че увреждането, причинено от отлагането на CaOxcrystal и образуването на ROS, може да бъде предотвратено или намалено от ендогенни антиоксиданти като супероксид дисмутаза (SOD), CAT и глутатион пероксидаза (GSH-Px) [20,22,29]. В настоящото проучване беше установено, че нивата на MDA се повишават в експериментален животински модел на хипероксалурична нефролитиаза, която беше успешно създадена чрез приложение на етилен гликол. Нашето проучване също така показа, че кверцетинът намалява ефекта на хипероксалурията, повишаващ оксидативния стрес, както се вижда от биохимични и хистопатологични параметри.

Известно е, че ROS активират сигнални молекули като протеин киназа С (PKC), c-Jun N-терминална киназа (JNK) и p38-MAPK [21]. Активирането на тези сигнални молекули води до индукция на транскрипционни фактори на NF-kB и активен протеин-1(AP-1). В резултат на тези събития, експресията на протеини като моноцитен хемоатрактантен протеин -1 (MCP-1), остеопонтин (OPN), фибронектин и трансформиращ растежен фактор-бета 1 (TGF{{11} })увеличаване [20]. Тези протеини улесняват адхезията на CaOx кристали и съответните възпалителни процеси [20]. Peerapen и др. съобщават, че p38-MAPK сигналните пътища медиират прекъсване на тесните връзки между епителните клетки [30]. Те също така показаха, че експресията на протеините, участващи в сигналния път на p38-MAPK, се увеличава по време на образуването на калциево-оксалатни камъни. Доказано е също, че оксалатът селективно активира p38-MAPK сигналния път, който има съществена роля в нефротоксичността на оксалата в епителните клетки на човешкия бъбрек [31]. Shiyong Qi и др. доказа, че кристалите CaOx индуцират усилване на адхезионните молекули в проксималните тубулни епителни клетки и този процес се медиира от p38-MAPK сигналния път [31]. Нашето проучване показа, че оксалатът индуцира p38-MAPK и NF-kB активиране. Освен това показахме, че кверцетинът значително намалява активността на p38-MAPK. Въз основа на тази информация може да се предположи, че кверцетинът може да предотврати повторната поява на CaOx камъни.

Проучването има някои ограничения. Първият е, че няма контролна група, на която е прилаган само кверцетин, следователно ефектът от перорално прилагания кверцетин върху производството и чревната абсорбция на оксалат не е ясно оценен. Второ, ефектът на кверцетин върху абсорбцията на етилен гликол също не е оценен. Следователно са необходими допълнителни изследвания за изясняване на механизма на действие на кверцетин върху хипероксалурията.

5. Изводи

Ние заключаваме, че кверцетинът инхибира възпалителните и окислителните процеси, предизвикани от хипероксалурия в бъбречните тъкани. Тъй като тези процеси водят до образуване на CaOx камъни, кверцетинът може да се счита за превантивно медицинско лечение на рецидивиращи CaOx камъни. Въпреки това са необходими допълнителни експериментални и клинични изследвания, за да се потвърдят нашите открития.

Препратки

1. Гамбаро, Г.; Vezzoli, G.; Casari, G.; Rampoldi, L.; D'Angelo, A.; Borghi, L. Генетика на хиперкалциурия и калциева нефролитиаза: От редките моногенни до обикновените полигенни форми. Am. J. Kidney Dis. 2004, 44, 963–986. [CrossRef]

2. Коу, Флорида; Паркс, JH; Асплин, Дж. Х. Патогенезата и лечението на камъни в бъбреците. Н. англ. J. Med. 1992, 327, 1141–1152. [CrossRef] [PubMed]

3. Хан, SR; Пърл, MS; Робъртсън, WG; Gambaro, G.; Canales, BK; Дойзи, С.; Traxer, O.; Tiselius, HG Бъбречни камъни. Нац. Rev. Dis. Primers 2016, 2, 16008. [CrossRef]

4. Слънце, XY; Xu, M.; Ouyang, JM Ефект на кристалната форма и агрегацията на калциев оксалат монохидрат върху клетъчната токсичност в бъбречните епителни клетки. ACS Omega 2017, 2, 6039–6052. [CrossRef] [PubMed]

5. Йонасен, JA; Kohjimoto, Y.; Scheid, CR; Schmidt, M. Оксалатна токсичност в бъбречните клетки. Урол. Рез. 2005, 33, 329–339. [CrossRef] [PubMed]

6. Хес, Б.; Ryall, RL; Кавана, JP; Хан, SR; Кок, DJ; Роджърс, Алабама; Tiselius, HG Методи за измерване на кристализация при изследване на уролитиаза: Защо, как и кога? Евро. Урол. 2001, 40, 220–230. [CrossRef]

7. Менон, М.; Koul, H. Клиничен преглед 32: Калциево-оксалатна нефролитиаза. J. Clin. Ендокринол. Metab. 1992, 74, 703–707. [CrossRef]

8. Ананд Дейвид, AV; Arulmoli, R.; Parasuraman, S. Прегледи на биологичното значение на кверцетина: биоактивен флавоноид. Pharmacogn. Rev. 2016, 10, 84–89. [PubMed]

9. Абделхалим, МАК; Муса, SAA; Qaid, HAY Защитната роля на кверцетин и аргинин върху златни наночастици предизвиква хепатотоксичност при плъхове. Вътр. J. Nanomed. 2018, 13, 2821–2825. [CrossRef] [PubMed]

10. Ярахмади, А.; Zal, F.; Bolouki, A. Защитни ефекти на кверцетин върху индуцирания от никотин оксидативен стрес в „HepG2 клетки“. Токсикол. мех. Методи 2017, 27, 609–614. [CrossRef]