Маркери за качество на Cistanches Herba въз основа на връзката между спектъра на антиоксидантите и ефекта

Резюме: Цел: Да се ​​създаде метод за изследване на маркерите за качество (Q-маркери) наCistanches Herba(CH) въз основа наВръзка антиоксидантен спектър-ефект, осигурявайки основа за изследване на неговите фармакологични вещества и контрол на качеството. Методи: Течна хроматография със свръхвисока ефективност (UPLC) беше използвана за установяване на профили на пръстови отпечатъци за 10 партиди CH. Беше установен модел на клетъчно окислително увреждане с помощта на H2O2 и антиоксидантният капацитет на CH беше определен въз основа на полумаксималната инхибиторна концентрация на реактивни кислородни видове, както и нивата насупероксиддисмутазаикаталазакатофармакологични показатели. Връзката спектър-ефект е конструирана чрез анализ на главните компоненти, корелационен анализ на Pearson и частичен регресионен анализ на най-малките квадрати. Theактивни компонентибяха подложени нафармакологично валидиране. 

Резултати:Профилите на пръстови отпечатъци за CH бяха установени с помощта на UPLC, идентифицирайки 17 често срещани пика. Въз основа на корелационния анализ на спектър-ефект бяха избрани девет компонента. Резултатите от фармакологичното валидиране показват, че генипозидова киселина, 8-епилоганова киселина,ехинакозид,актеозид, изоактеозид, итубулозид Апроявява антиоксидантна активност по начин, зависим от концентрацията.

Заключение: Това проучване изследва Q-маркери за CH въз основа на връзката спектър-ефект, като предоставя референтна информация за основата на фармакологичното вещество и подобряване на стандарта за качество.

Ключови думи:Cistanches Herba; Q-маркер;връзка спектър-ефект; антиоксидант

Cistanche deserticola е изсушено месесто стъбло с люспести листа на Cistanche deserticola YCMa или Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, растение, принадлежащо към семейство Cistanche deserticola orbaceae. Той е топъл по природа, сладък и солен на вкус; връща се към меридианите на бъбреците и дебелото черво; има ефект на подхранване на ян на бъбреците, попълване на есенция и кръв, овлажняване на червата и слабително и е важно лекарство за тонизиране на бъбреците и попълване на есенция [2-3]. Бъбреците съхраняват есенцията, а есенцията и кръвта идват от един и същи източник. Ако есенцията и кръвта са дефицитни, това ще повлияе на цялостната жизнена дейност на човешкото тяло; костният мозък, произвеждащ есенция, се съхранява в костите, а мозъкът е костното море. Ако бъбречната есенция е недостатъчна, костите ще загубят храната си и мозъкът ще бъде дефицитен, което ще доведе до костни дегенеративни промени като разхлабена текстура, загуба на зъби, загуба на памет, деменция и намалена имунна функция [4-6]. Cistanche deserticola съдържа фенилетаноидни гликозиди, иридоиди, лигнани и други структурни компоненти, включително ехинакозид, вербаскозид, вербаскозид, генипинова киселина и 8-епистрианова киселина. , тубулин А и др. [7]. Настоящият контрол на качеството на Cistanche deserticola в изданието от 2020 г. на „Фармакопеята на Китайската народна република“ определя само съдържанието на ехинакозид и вербаскозид, което не може напълно да отрази характеристиките на многокомпонентното и многоцелевото действие на традиционната китайска медицина. , което не е благоприятно за неговия качествен контрол и оценка.

За да се подобри нивото на контрол на качеството на традиционната китайска медицина и да се оптимизира оценката на качеството на традиционната китайска медицина, академик Liu Changxiao предложи новата концепция за маркер за качество (Q-маркер) на традиционната китайска медицина [8]. Сред тях „ефективността“ е основният елемент в „Петте принципа“ на Q-маркера [9] и също е ядрото на оценката на качеството на традиционните китайски лекарства.

С оглед на текущото състояние на изследванията на лоша корелация между стандартите за качество и ефикасността на лекарствата, изследването на Q-маркерите на традиционните китайски лекарства и установяването на по-научни и разумни стандарти за качество е от голямо значение за подобряване на качеството на традиционните китайски лекарства. Връзката спектър-ефект свързва хроматографските пикове на пръстовия отпечатък на традиционната китайска медицина със специфични фармакодинамични данни за намиране на ефективните вещества на традиционната китайска медицина, като по този начин отразява присъщото качество на традиционната китайска медицина [10]. Създаването на математически модел за спектрална ефективност може да изясни QMarker на традиционната китайска медицина от гледна точка на „холистичен изглед“, предоставяйки повече справка за по-късен контрол на качеството на традиционната китайска медицина, формулиране на стандарти за качество и скрининг на активни съставки. Това изследване използва пръстови отпечатъци, съчетани със степента на полуинхибиране на реактивни кислородни видове (ROS IC50), съдържанието на супероксид дисмутаза (SOD) и каталаза (CAT), за да изследва връзката спектър-ефект на традиционната китайска медицина и използва анализ на основните компоненти (PCA) ), корелационен анализ на Pearson (PCC) и частичен регресионен анализ на най-малките квадрати (PLS) за цялостен анализ на Q-маркера на Cistanche deserticola, за да се осигури основа за неговия качествен контрол.

1 материал

1.1 Пример

Cistanche deserticola е събрана от окръг Ютиен, Синцзян и базата за засаждане на добри земеделски практики (GAP) на Cistanche deserticola във Вътрешна Монголия. Идентифициран е от изследователя Zhang Tiejun от Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. като Cistanche tubulosa (Schenk) Wight и Cistanche deserticola.

YC Ma, подробна информация е показана в таблица 1.

1.2 Тестово лекарство

Ехинацеазид (номер на партида: 111670-201907, чистота: 91,8%) и вербаскозид (номер на партида: 111530-201914, чистота: 95,2%) са закупени от Китайския институт за контрол на храните и лекарствата; изорезкозид (партиден номер: 61303-13 -7), салидрозид (партиден номер: 10338-51-9), 8-епистрихноева киселина (партиден номер: 82509-41-9), генипинова киселина (партиден номер: Z24A10X95926) , тубероза B (партиден номер: 112516-04-08), 2-ацетил евгенол гликозид (партиден номер: 94492-24-7) са закупени от Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., чистота по-голяма или равна на 98%; Cistanche гликозид А (партиден номер: ТРЯБВА -20062806, чистота: 98.51%), флоридин А (партиден номер: MUST19110102, чистота: 98.57%) са закупени от Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; хроматографски чист ацетонитрил и мравчена киселина са закупени от Tianjin Concord Technology Co., Ltd. Company; Пречистена вода (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Витамин Е (VE, V8010, Beijing Solarbio Company); диметилсулфоксид (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company от Съединените щати); CellTiter 96® AQueous комплект за откриване на клетъчна пролиферация с единичен разтвор (G3580, Promega Company от Съединените щати); CAT откриване Комплектът (S0051), комплектът за откриване на SOD активност (S0101M) и комплектът за откриване на ROS (S0033S) са закупени от Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Инструменти

Waters H-class-PDA течен хроматограф със свръхвисока ефективност (Waters Company, САЩ); електронен баланс Sartorius BT25S (компания Sartorius, Германия); H1650 високоскоростна настолна центрофуга (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Четец на микроплаки (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); Биологичен микроскоп WYS-41XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 клетки

Човешки ембрионални бъбречни клетки В този експеримент са използвани клетки HEK 293 и са закупени от клетъчната банка на Китайската академия на науките.

2 метода

2.1 Създаване на карта с пръстови отпечатъци

2.1.1 Приготвяне на тестовия разтвор: Претеглете 2 g лекарствен материал от Cistanche deserticola, добавете 10 пъти количеството вода, загрейте и кипете под обратен хладник 3 пъти, 1 час всеки път, центрофугирайте при 1.0 ×105r·min-1 за 15 минути (центробежният радиус е 300 mm), Комбинирайте супернатантите и концентрирайте, за да направите основен разтвор с масова концентрация от 100 mg·mL-1, разредете го 10 пъти, и го филтрирайте през 0,22 µm микропореста филтърна мембрана, за да го получите.

2.1.2 Приготвяне на смесен референтен разтвор

Вземете 8-епистрихнова киселина, салидрозид, ехинацеазид, цистанхе гликозид А, генипинова киселина, вербаскозид, антоцианозид А, изобаскозид и 2'-ацетил евгенол. Референтните вещества гликозид и ангиозид В бяха измерени в подходящи количества и претеглени точно. Добавете 50% разтвор на метанол за разтваряне и пригответе разтвор на смесено еталонно вещество с масова концентрация 20 µg·mL–1.

2.1.3 Хроматографски условия

Колона ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); подвижната фаза е ацетонитрил (A) ~ 0.1% разтвор на мравчена киселина (B), градиентна програма за елуиране (0 ~ 6 минути, 5% ~ 8% A; 6 ~ 10 минути, 8% ~ 15% A 10~13 минути, 15%~19%A, 13~20 минути, 19%~25%A); дължина на вълната на детекция е 237 nm; скоростта на потока е 0,4 mL·min –1; температурата на колоната е 40 градуса; инжекционният обем е 3 µL.

2.1.4 Избор на референтен пик

В хроматограмата с ултра-ефективна течна хроматография (UPLC) на Cistanche deserticola, пикът с най-голямо съотношение на площта на пика, умерено време на задържане и добро разделяне беше избран като референтен пик на спектъра на пръстовия отпечатък. 2.1.5 Методологично изследване Тест за прецизност: Вземете проба Т1 и пригответе тестовия разтвор съгласно метода в 2.1.1. Инжектирайте пробата 6 пъти непрекъснато и запишете пръстовия отпечатък. Резултатите показват, че относителната пикова площ RSD на всеки пик е 0.10%~4.61%. , RSD на относителното време на задържане е 0,08%~1,32%, което показва, че инструментът има добра точност.

Тест за повторяемост: Вземете проба Т1 и пригответе 6 проби от тестовия разтвор паралелно съгласно метода в 2.1.1 и инжектирайте пробата непрекъснато. Резултатите показват, че относителната пикова площ RSD на всеки хроматографски пик е 1,35%~4,80%, а относителното време на задържане RSD е 0,10%~1,80%, което отговаря на изискванията на пръстовия отпечатък и показва, че повторяемостта на инструмента е добър.

Тест за стабилност: Вземете проба Т1 и пригответе тестовия разтвор съгласно метода в 2.1.1, инжектирайте проби за тестване на 0, 2, 4, 8 и 12 часа и запишете пръстовия отпечатък. Изчислената RSD на относителната площ на пика на всеки хроматографски пик е 0.53%~4.82%, а RSD на относителното време на задържане е 0.09%~2.17%, което отговаря на изискванията на пръстовия отпечатък и показва, че тестовият продукт е стабилен в рамките на 12 часа.

2.2 Изследване на антиоксидантния ефект на Cistanche deserticola

2.2.1 Приготвяне на матерния разтвор от Cistanche deserticola:Взема се матерната луга по т. 2.1.1, филтрира се и се стерилизира, като преди употреба се разрежда с хранителна среда до необходимата концентрация.

2.2.2 Ефекти на Cistanche deserticola и положителната контрола VE върху жизнеспособността на HEK 293 клетки

Създайте нормална група (клетъчна суспензия), група за приложение на Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), VE група (20, 40, 60, 80, 100 µmol·L–1), всяко Поставете 6 дублирани ямки при всяка концентрация и култура за 24 часа. Добавете 20 µL реагент CellTiter 96® AQueous за единичен разтвор към всяка ямка, за да откриете жизнеспособността на клетките. Продължете култивирането в продължение на 2 часа. Използвайте четец на микроплаки, за да откриете стойността на абсорбцията (OD) на всяка ямка при 490 nm. Изчислете степента на преживяемост на клетките съгласно формула (1). Процент на преживяемост (%)=(ОП експериментална група/ОП празна група) × 100% (1)

2.2.3 Ефект на Cistanche deserticola върху ROS, индуциран от H2O2 в HEK 293 клетки

Клетките бяха разделени на нормална група (клетъчна суспензия) и група за приложение на Cistanche deserticola (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola и 60 µm·L–1 H2O2) и култивирани в продължение на 24 часа. Следвайте стъпките на комплекта за откриване на ROS за последващи операции, наблюдавайте директно оцветяването на клетките през микроскоп и използвайте четец на микроплаки, за да откриете интензитета на флуоресценция на всяка група. Настройките на параметрите са използвали дължина на вълната на възбуждане от 488 nm и дължина на вълната на излъчване от 525 nm. Експериментът се повтаря три пъти.

2.2.4 Ефект на Cistanche deserticola върху индуцираната от H2O2- SOD на HEK 293 клетки

Разделете клетките на нормална група (клетъчна суспензия) и моделна група

(60 µm·L–1 H2O2), група VE (60 µm·L–1 VE и 60 µm·L–1 H2O2), група на приложение на Cistanche deserticola (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola и 60 µm·L–1 H2O2), съберете клетките след 24 часа култивиране, добавете разтвор за подготовка на SOD за проба за лизиране на клетките, центрофугирайте при 4 градуса, 12000 r·min-1 за 5 минути (радиусът на центрофуга е 300 mm), вземете супернатантата като проба за тестване, следвайте комплекта за откриване на SOD Следвайте стъпките по-долу. Експериментът се повтаря три пъти.

2.2.5 Ефект на Cistanche deserticola върху H2O2-индуцирана CAT в HEK 293 клетки

Следвайте метода в 2.2.4 и групово приложение, добавете лизиращ разтвор, центрофугирайте при 4 градуса, 12000 r·min-1 за 10 минути (радиусът на центрофугата е 300 mm), вземете супернатантата и следвайте стъпките на Комплект за откриване на CAT. Последващи операции. Експериментът се повтаря три пъти.

2.2.6 Статистически анализ

За статистически анализ беше използван софтуер SPSS 26.0. Всяка група от данни беше представена с (±±(). Беше извършен еднопосочен анализ на дисперсията върху данните, които съответстваха на нормалното разпределение. Ако дисперсиите бяха равни, беше използван методът на най-малката значима разлика. Ако дисперсиите бяха неравномерни, беше използван методът T3 на Dunnett за графично изобразяване и P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Корелационен анализ на спектър-ефект на антиоксидант Cistanche deserticola

2.3.1 PCA Пиковите площи на общите пикове на 10 партиди от Cistanche deserticola, които са установили пръстови отпечатъци, бяха стандартизирани по Z стойност и направени в матрица с данни от порядък 10 × 17, която беше импортирана в софтуера SPSS 26.0 за PCA.

2.3.2 PCC Използвайте SPSS 26.0 за провеждане на двумерен анализ за изследване на връзката на спектралната ефективност между пръстовите отпечатъци на Cistanche deserticola и антиоксидантите.

Тестването на значимостта използва двустранен тест (T) с P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS Импортирайте експерименталните резултати от стандартизираната пикова площ и антиоксиданта на Cistanche deserticola в софтуера SIMCA-P 14.1, задайте пиковата площ като X променлива и задайте фармакодинамичния индекс като Y променлива, за да извършите PLS.

2.4 Проверка на антиоксидантната активност на Q-маркера Cistanche deserticola

2.4.1 Приготвяне на матерната луга с активна съставка

Претеглете точно подходящи количества генипинова киселина, 8-епистрихнова киселина, ехинацеазид, вербаскозид, изоребаскозид и антоцианозид А и добавете DMSO, за да ги разтворите в 10 mmol·L–1 за контрол. продуктово решение.

2.4.2 Ефект на активните съставки върху цитотоксичността на HEK 293

След като клетките НЕК 293 бяха инкубирани в продължение на 24 часа, 100 µL разтвори на активната съставка съгласно точка 2.4.1 (0.781, 1.563, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µmol·L–1) от различни концентрации се добавят към всяка ямка и стимулирането продължава. CellTiter 96® AQueous единичен разтвор на реагент беше добавен към клетките 24 часа по-късно, за да се открие клетъчната жизнеспособност.

2.4.3 Антиоксидантният ефект на активните съставки върху H2O2-индуцирани HEK 293 клетки

Клетките бяха групирани както следва: нормална група, моделна група, VE група бяха групирани както в 2.2.4, експериментална група (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 активна съставка и 60 µm·L–1 H2O2), култивирани за 24 часа. Определете вътреклетъчните нива на ROS, съдържанието на ензими SOD и CAT съгласно методите съответно в 2.2.3, 2.2.4 и 2.2.5.

Поддържаща услуга на Wecistanche

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/телефон:+86 15292862950

Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop