Количествено определяне на невритна дегенерация с повишена точност и ефикасност в in vitro модел на болестта на Паркинсон, част 2

Резултати

Създаване на модел на клетъчна култура на невритна дегенерация, свързана с PD

За да разработим метод за изследване на невритна дегенерация в модел на клетъчна култура на PD, използвахме култивирани LUHMES клетки, популация от условно обезсмъртени човешки мезенцефални клетки. При диференциация клетките LUHMES стават постмитотични, приемат профил на генна експресия, характерен за зрели допаминергични неврони, и развиват невронална морфология с неврити, които се простират до 500 mm на дължина (фиг. 1A; Lotharius et al., 2005; Scholz et al. , 2011; Kraemer et al., 2021).

Невродегенерацията, състояние, при което нервните клетки мутират или умират, е тясно свързано с паметта. В моделите на клетъчна култура можем да контролираме условията на културата, за да облекчим изразяването на невродегенерация и по този начин да подобрим работата на паметта.

Проучванията показват, че хомеостазата на нервните клетки играе важна роля за оцеляването на клетките и функционирането на системата. Можем да подобрим стабилността на клетките чрез контролиране на фактори като хранителни вещества и растежни фактори в хранителната среда. В същото време обърнете внимание на поддържането на чистотата и контрола на температурата на културалната среда, за да предотвратите смущения и повреди на клетките от околната среда.

В допълнение, в модела на клетъчна култура, можем също така да инжектираме определени съединения или лекарства в клетките, за да намалим експресията на невромодулация, като по този начин подобрим степента на оцеляване и ефективността на паметта на клетките. Тази техника също се използва широко в изследването на невродегенеративни заболявания.

Накратко, невродегенерацията има важно въздействие върху стабилността на клетките и функцията на системата, а технологията за клетъчна култура е добър модел на изследователски метод, който може да проведе задълбочено изследване и изследване на връзката между невродегенерацията и паметта. Можем да облекчим ефективността на невромодулацията чрез култивиране на контрол върху околната среда, инжектиране на лекарства в клетките и т.н., за да подобрим клетъчното оцеляване и работата на паметта и да предоставим по-изчерпателна основа за изследване на невродегенеративните заболявания. Вижда се, че трябва да подобрим паметта си. Cistanche може значително да подобри нашата памет, тъй като Cistanche може също така да регулира баланса на невротрансмитерите, като например повишаване на нивото на ацетилхолин и растежни фактори, които са много важни за паметта и ученето. Освен това месото може също да подобри притока на кръв и да насърчи доставката на кислород, което може да гарантира, че мозъкът получава достатъчно храна и енергия, като по този начин подобрява жизнеността и издръжливостта на мозъка.

Щракнете върху познайте добавките за подобряване на паметта

Поради превъзходните оптични качества на стъклото в сравнение с пластмасата, културите бяха установени върху стъклени слайдове, съдържащи осем камери за среда. Въз основа на предишни доклади (Lotharius et al., 2005; Scholz et al., 2011; Kurowska et al., 2014), ние първоначално се опитахме да установим култури върху предметни стъкла, покрити с PLO и фибронектин; обаче, такива култури показват дефицит на адхезия и ниска жизнеспособност. В резултат на това тествахме дали покритието с допълнителни субстрати ще подобри жизнеспособността на клетъчните култури LUHMES, установени върху стъклени повърхности.

LUHMES клетъчни култури бяха установени върху предметни стъкла, които бяха или непокрити, или покрити с PLO и фибронектин, PDL и ламинин, или комбинация от всичките четири субстрата. Анализът на жизнеспособни ядра чрез флуоресцентна микроскопия разкрива, че покритието на предметните стъкла значително е повлияло на жизнеспособността на културите [Friedman x2 (3)=18, p, 0.0001], като post hoc множество сравнителни анализи разкриват, че слайдовете покрити с комбинация от четирите гореспоменати субстрата, дават значително по-висок процент жизнеспособни клетки в сравнение със слайдове, покрити само с PLO и фибронектин (p= 0.0437; Фиг. 1B, C).

След идентифициране на оптималните субстрати за покритие за култивиране на LUHMES клетки върху стъклени предметни стъкла, ние оценихме ефектите на клетъчната плътност върху пригодността на културите за измервания на невритна дегенерация. Клетките LUHMES се култивират в среда за диференциация с плътност на посяване от 57 500 клетки на ямка, 115 000 клетки на ямка или 230 000 клетки на ямка и на петия ден от диференциацията клетките бяха фиксирани с 4% PFA и изобразени чрез фазово-контрастна микроскопия.

Плътност от 57 500 клетки на ямка доведе до култури със слабо свързани неврити и неправилна морфология на невритите, докато културите, установени с плътност на посяване от 230,000 клетки, макар и жизнеспособни, съдържаха плътности на неврити, твърде високи за точно измерване на невритите. Междинната клетъчна плътност от 115 000 клетки на ямка осигурява висока жизнеспособност и добре разделени аксонови трактове, благоприятни за точни измервания на невритна дегенерация (фиг. 1D).

За да моделираме свързана с PD невритна дегенерация in vitro, ние изложихме диференцирани LUHMES клетки на 6-OHDA, широко използван невротоксин, който насърчава оксидативен стрес и дегенерация на катехоламинергични неврони (Bové и Perier, 2012). Излагането на диференцирани LUHMES клетки на 6-OHDA насърчава дозозависимо увеличение на невритната дегенерация, като 5,0 mM 6-OHDA и 7,5 mM 6-OHDA индуцират съответно умерена и тежка невритна дегенерация (фиг. 2F). За количествено определяне на невритната дегенерация в култури от LUHMES клетки, изложени на 6-OHDA, използвахме широко цитиран метод, при който фазово-контрастните изображения на културите се бинаризират, клетъчните тела в изображенията се отстраняват цифрово и алгоритъмът на анализатора на частици на ImageJ се прилага за измерване на площта на невритни фрагменти. След това фрагментираните невритни области се сумират и разделят на общата невритна площ, за да се определи DI (фиг. 2A–E; Sasaki et al., 2009; Kraemer et al., 2014; Di Stefano et al., 2015; Hill et al. ., 2018; Geisler et al., 2019).

Както се очакваше, излагането на диференцирани LUHMES клетки на 6- OHDA предизвика зависимо от дозата увеличение на DI (F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{ {8}}.9374; Фиг. 2G). Въпреки това, по време на анализите на клетки, изложени на 6-OHDA, наблюдавахме няколко проблема, които изглежда оказват отрицателно въздействие върху точността и ефективността на DI измерванията. По този начин ние се опитахме да оптимизираме този общ метод за извършване на DI измервания, който оттук нататък наричаме традиционен DI метод, за да генерираме протокол, улесняващ по-ефективно измерване на фрагментацията на неврит.

Намаляване на изкуствената фрагментация, свързана с бинаризация на микрографи

Докато използвахме традиционния DI метод, често наблюдавахме проблем, при който непокътнати неврити във фазово-контрастни изображения изглеждаха фрагментирани в съответното им бинаризирано изображение (фиг. 3A). Тази изкуствена фрагментация засяга предимно неврити с ниска известност. По този начин проучихме дали проблемът може да бъде намален чрез процедури, които подобряват контраста на изображението. За да подобрим контраста на изображението, първо заснехме изображения на неврити, използвайки различни интензитети на светлината, за да определим нивото на яркост на изображението, което би довело до оптимален контраст.

Изображенията, заснети с оптимален интензитет на светлината, след това бяха подложени на допълнително подобряване на контраста чрез използване на ImageJ за прилагане на LUT с минимални и максимални стойности на интензитет съответно 90 и 205. Включването на тези подобрения на контраста осигури умерено по-точно представяне на невритите в бинаризирани изображения, генерирани от фазово-контрастни изображения (фиг. 3B). Независимо от това, количественият анализ на бинаризирани изображения на здрави неврити показва, че подобренията на контраста не намаляват значително изкуствената фрагментация (p=0.9999; Фиг. 3D). По този начин след това проучихме дали използването на имунофлуоресцентно изобразяване ще произведе изображения с превъзходен контраст и по този начин ще улесни производството на по-точни бинаризирани невритни изображения с намалена изкуствена фрагментация.

Слайдовете, описани на фигура 2, включващи фиксирани LUHMES клетки, изложени на различни концентрации на 6- OHDA, бяха имунооцветени за цитоскелетния протеин b III-тубулин, изобразени с помощта на флуоресцентна микроскопия и анализирани от заслепен изследовател за изкуствено фрагментиране (фиг. 3C). Количествен анализ на бинаризирани изображения, получени от флуоресцентни микроснимки и съответните фазово-контрастни микроснимки разкри, че типът микроскопия е повлиял на нивата на изкуствена фрагментация [Friedman x2 (3)=15.44, p, 0.0001] . По-конкретно, флуоресцентните микрографии произвеждат бинаризирани изображения със значително намалена изкуствена фрагментация в сравнение с тези от фазово-контрастни микрографии (p=0.0016; Фиг. 3D).

В резултат на това изображенията на здрави култури дават значително по-ниски DI резултати, когато се използват флуоресцентни микрографии, а не фазово-контрастни микрографии (F(1,8)= 131.4, p=0.{{12} }001, R2=0.1442; Фиг. 3E). Освен това, забележителна обща тенденция е, че кратната промяна между средните стойности на DI, свързани със здрави (третирани с носител) култури и култури, проявяващи невритна дегенерация (третирани с 5,0 или 7,5 mM 6-OHDA), е по-голяма, когато се измерва с помощта на флуоресцентни микрографии отколкото когато са получени от микроснимки с фазов контраст (фиг. 3E). Това се случи, въпреки че флуоресцентните микрографии на култури с умерена невритна дегенерация (предизвикана от излагане на 5 mM 6-OHDA) имат значително по-ниски DI резултати от съответните фазови изображения поради намаляването на изкуствената фрагментация (p=0.0001 , d=0.6312).

Оптимизиране на параметрите за откриване на фрагментирани неврити и тотални неврити
Традиционният метод за извършване на DI измервания включва използването на плъгина Analyze Particles за ImageJ с параметри на размера от 20 10,000 пиксела за откриване на невритни фрагменти. Въпреки това, ние забелязахме, че голяма част от невритни фрагменти не са открити от анализатора на частици, когато се използват тези широко цитирани параметри (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. , 2020 г.; Шин и Чо, 2020 г.) за измерване на невритна дегенерация във фазово-контрастни микрографии на LUHMES клетки, изложени на 6-OHDA, генерирани, както е описано на Фигура 2.

По този начин ние анализирахме повторно изображения от този набор от данни, използвайки различни ограничения на минималния размер за откриване на частици, за да определим оптималните параметри за идентифициране на невритни фрагменти. От качествена оценка на бинаризирани изображения, генерирани от фазово-контрастни микрографии, параметрите на размера от 5–10 000 пиксела подобряват откриването на невритни фрагменти, но също така са свързани с погрешното идентифициране на фонов шум, артефакти на изображението или други малки неневритен материал като невритни фрагменти. В сравнение с широко използваните параметри от 20–10, 000 пиксела обаче, параметрите от 10–10, 000 пиксела подобриха откриването на невритни фрагменти без забележимо голямо увеличение на фалшивите положителни резултати (фиг. 4A , наляво).

Подобни анализи също бяха извършени с бинаризирани изображения, получени от флуоресцентни микрографии на LUHMES клетки, имуномаркирани за b III-тубулин. Параметрите на размера на анализатора на частици от 5–10 000 пиксела улесниха най-чувствителното откриване на невритни фрагменти и тъй като флуоресцентните микрографии съдържаха по-малко малки отломки, такива параметри не увеличиха забележимо погрешното идентифициране на неневритен материал като невритни фрагменти (Фиг. 4A, вдясно).

Традиционният метод за извършване на DI измервания, чрез използване на параметри за размер на анализатора на частици от 20–10, 000 пиксела, изключва обекти, по-малки от 20 пиксела, от измерванията на невритни фрагменти.

Въпреки това, такива малки обекти обикновено се включват погрешно в измерванията на общата невритна площ, тъй като традиционният метод за измерване на DI включва изчисляване на общата невритна площ чрез сумиране на всички черни пиксели в бинаризираните изображения. За да преодолеем този проблем, използвахме приставката Particle Remover за ImageJ, написана от разработчика на ImageJ Wayne Rasband, за премахване на малки, неневритни обекти от бинаризирани изображения. Прилагането на този плъгин при извършване на DI измервания с използване на фазово-контрастни микроснимки на LUHMES клетки, изложени на 6-OHDA, генерирани, както е описано на Фигура 2, доведе до значително увеличение на DI измерванията при всички концентрации на експозиция на невротоксин (F(1 ,8)=83.43, p=0.0001, R2=0.0416).
Освен това значително взаимодействие показва, че увеличението на DI, причинено от използването на средство за отстраняване на частици, става по-силно при по-високи концентрации (F(1.881,15.05)=59.97, p=0.0001, R{ {8}}.0094; Фиг. 4B, C). Ние също изобразихме същите слайдове от клетки чрез флуоресцентна микроскопия и оценихме ефектите от отстраняването на малки частици върху DI измервания, получени от флуоресцентни микрографии. Въпреки че отстраняването на малки частици осигурява стойности на DI, които теоретично са по-точни, такива средни стойности не се различават значително от тези, получени без използването на приставката за отстраняване на частици, когато се измерват с помощта на флуоресцентни микрографии (F(1,8)=2. 613, p=0.1446, R2=0.0013; Фиг. 4D).

Автоматизиране на DI измервания от флуоресцентни микроснимки

Изпълнението на DI измервания с помощта на традиционния метод изисква досадна и отнемаща време обработка на изображения, използване на инструмента със свободна ръка за цифрово отстраняване на отделни клетъчни тела и измерване на фрагментирани невритни и общи невритни области от всяко изображение. По този начин се опитахме да подобрим ефективността на метода, като написахме макрос, който напълно автоматизира DI анализите. За автоматизиране на премахването на сома, макросът, озаглавен ANDI, изпълнява бинаризация на изображения на клетъчни ядра, маркирани чрез ядрено оцветяване DAPI, последвано от модификация на бинаризираното изображение, така че праговите ядрени региони да бъдат увеличени, за да обхванат цялата област на сома. Такива изображения с бинаризирани и уголемени ядра след това се изваждат от съответните флуоресцентни микрографии на неврони, имуномаркирани за b III-тубулин, генерирайки изображение, включващо изключително неврити (фиг. 5A, B).

За да се коригират за променливи ядрени размери, причинени от ядрено свиване или фрагментация, свързани с невродегенерация, бинаризираните изображения на ядрата се уголемяват чрез комбинация от дилатации и ерозии, които комбинират ядрени фрагменти и разширяват бинаризирани региони, за да заемат площ, по-голяма от сомата на диференцирани LUHMES клетки . Изображенията, съдържащи изключително неврити, след това се бинаризират и се подлагат на DI анализ чрез серия от автоматизирани функции (фиг. 5C, D). За да оценим точността на макро операциите, свързани с отстраняването на сома от изображенията, сравнихме DI резултатите, получени след ръчното отстраняване на клетъчни тела от флуоресцентни микрографии, използвайки инструмента със свободна ръка на ImageJ (както е показано по-рано на Фиг. 4D), с DI резултатите генерирани от анализи на идентични изображения след автоматизирано премахване на клетъчно тяло с помощта на операциите за отстраняване на сома, представени в ANDI Macro. Нашите анализи разкриха, че DI резултатите, изчислени с помощта на автоматизирано отстраняване на клетъчно тяло, корелират почти идентично с DI измерванията, получени от изображения, подложени на ръчно отстраняване на сома (r(34)=0.980, p, 0.0001; Фиг. 5E).

За да увеличим точността на анализите, ние включихме няколко от описаните по-горе корекции, които подобряват DI измерванията в ANDI. Макросът включва операции за подобряване на контраста, използване на приставката за отстраняване на частици за премахване на невритна материя от невритни изображения и неядрена материя от изображения на ядра и откриване на невритни фрагменти с помощта на параметри за размер от 5–10,000 за приставката Analyze Particles.

Ние предположихме, че колективно използването на флуоресцентна микроскопия, операции за подобряване на контраста, отстраняване на малки обекти с средство за отстраняване на частици и оптимизирани параметри за откриване на частици биха допринесли за по-точни измервания на невритната дегенерация. За да се тества тази хипотеза, фазово-контрастните изображения на LUHMES клетки, изложени на различни концентрации на 6-OHDA, генерирани, както е описано на фигура 2, бяха анализирани чрез сляпо и субективно оценяване, като се използва диапазон на стойност между 0. 0 и 1.0, със стойности, представляващи видимата част от фрагментирана невритна област. След това оценихме корелацията между субективните резултати и DI измерванията, получени чрез традиционния метод, както и корелацията между субективните резултати и DI измерванията, получени с помощта на ANDI Macro.

Докато DI измерванията, получени с помощта на традиционния метод, корелираха със субективни резултати (r {{0}}.7850, p, 0.0001; Фиг. 5F), ANDI Macro даде измервания, които корелират много по-силно със субективните оценки (r 2=0.978, p, 0.0001; Фиг. 5G). Директните статистически сравнения разкриват, че резултатите, получени чрез ANDI Macro, корелират значително по-силно със субективните оценки, отколкото резултатите, получени чрез традиционния метод (z=6.626, p, 0,0001; Фиг. 5F, G). Допълнителни анализи разкриха, че макросът улеснява извършването на DI измервания със стабилно и значително подобрение във времевата ефективност. DI анализите, извършени с помощта на ANDI Macro, изискват средно време от 12,75 s на анализирано изображение, в сравнение със средно време от 5,27 min на изображение, анализирано чрез традиционния метод [Friedman x2 (1)=9, p {{22} }.0027]. Като цяло, тези резултати показват, че ANDI дава бързо генериране на DI измервания, които в сравнение с резултатите, получени чрез традиционния метод, се доближават по-близо до дегенерацията, която изследователите възприемат от качествения анализ на невритни изображения.

След определяне на точността и ефективността на макроса ANDI за измерване на невритна дегенерация в диференцирани клетки LUHMES, изложени на 6-OHDA, ние оценихме пригодността на макроса за експерименти, включващи други модели на клетъчни култури. Първо беше проведено пилотно проучване за оценка на точността на ANDI при извършване на DI измервания с помощта на микрографии на първични симпатикови култури, имуномаркирани за b III-тубулин и DAPI. Интересно е обаче, че клетъчните тела на симпатиковите неврони са по-големи от тези на диференцирани LUHMES клетки и по този начин операциите в ANDI, свързани с автоматизирано отстраняване на сома, не премахват цялата сома (данните не са показани).

За да преодолеем този проблем, ние ревизирахме ANDI, за да включва диалогов прозорец, позволяващ на потребителите да избират размера на премахването на сома чрез контролиране на броя пъти, когато бинаризираните микроснимки на ядрата се разширяват. След това тази версия на ANDI, версия 1.1, беше използвана за извършване на DI измервания от микрографии, изобразяващи здрави, третирани с носител симпатикови неврони или дегенериращи симпатикови неврони, изложени на водороден пероксид. Изображения на неврони, изложени на водороден пероксид, дават значително по-високи DI резултати в сравнение с изображения на неврони, третирани с носител (F(1,3)=71.2, p=0.0035, R2=0 .9301; Фиг. 6A, C). Освен това, ние сравнихме тези DI резултати, които бяха получени с помощта на ANDI с DI измервания, получени от същия набор от изображения след ръчно отстраняване на клетъчни тела от флуоресцентни микрографии с помощта на инструмента със свободна ръка на ImageJ. Няма значителна разлика в резултатите от DI, изчислени след ръчно отстраняване на сома, в сравнение с резултатите, получени с помощта на ANDI (F(1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0. 0000; Фиг. 6A–C). Post hoc тестове също потвърдиха, че DI резултатите, получени с помощта на ANDI, не се различават значително както в случай на нетретирани неврони (p=0.0972), така и в случай на неврони, изложени на водороден прекис (p=0). 9986).

Освен това, DI резултатите, получени от ANDI, корелират почти идентично с DI резултатите, получени след ръчно отстраняване на клетъчни тела от съответните микрографии (r(34)=0.991, p, 0.0001). Тези данни показват, че ANDI е подходящ за измерване на невритна дегенерация в култури от първични неврони, с операции за отстраняване на сома, които потребителят може да персонализира, за да съответства на различни видове неврони. В допълнение, откриването на невритни фрагменти в култури, изложени на водороден прекис, демонстрира приложимостта на макроса за използване в експерименти, включващи невритна дегенерация, предизвикана от източници, различни от 6-OHDA. За по-нататъшна проверка на използването на ANDI при откриване на невритна дегенерация, свързана с различни причини, ние също използвахме макроса за измерване на невритна дегенерация в микрографии на здрави симпатични култури или култури, подложени на отнемане на NGF. Както се очаква, изображения на култури, подложени на отнемане на NGF, дават значително по-високи стойности на DI в сравнение с изображения на здрави култури (F(1,2)= 287, p= 0.0035, R2=0. 958; Фиг. 6D, E). Взети заедно, тези открития показват, че ANDI може да се използва за откриване на невритна дегенерация, свързана с различни биологични контексти.

Тъй като оцветяването за TH обикновено се използва за визуализиране на катехоламинергични неврони, ние също оценихме пригодността на микрографи, изобразяващи TH оцветяване за измерване на невритна дегенерация с помощта на ANDI. Култури от здрави симпатикови неврони, третирани с разтвор на носител или дегенериращи симпатикови неврони, изложени на водороден пероксид, бяха фиксирани и подложени на имунофлуоресцентно маркиране за TH и b III-тубулин, както и обратно оцветяване за DAPI. Невритни изображения, изобразяващи оцветяване за TH или b III-тубулин, и съответните изображения на ядра, включващи DAPI маркиране, след това бяха заснети при подобни зрителни полета. ANDI беше изпълнен и изображенията, включващи TH оцветяване или оцветяване с b III-тубулин, бяха избрани като невритни изображения. Нашите анализи разкриха, че DI резултатите, получени с помощта на изображения на TH оцветяване, корелират много силно с резултатите, получени от изображения на b III-тубулиново оцветяване (r(28)= 0.962, p, 0.0001; Фиг. 6F, G). Тези данни показват, че точни измервания на DI могат да бъдат получени чрез ANDI, като се използват алтернативни процедури за оцветяване, които маркират целостта на невритите, като имуномаркиране за TH.

За да демонстрираме полезността на подобрения метод за извършване на DI измервания в научен експеримент, ние използвахме новия метод за оценка на ролята на JNK в индуцирана от оксидативен стрес невритна дегенерация в човешки мезенцефални клетки. Диференцираните LUHMES клетки бяха предварително третирани в продължение на 1 час с JNK инхибитор SP600125 или разтвор на носител. След това клетките бяха третирани в продължение на 24 часа с 6- OHDA за индуциране на оксидативен стрес или с разтвор на носител. Фиксираните клетки бяха подложени на имуномаркиране за b III-тубулин и DAPI оцветяване и ANDI беше използван за получаване на DI измервания от флуоресцентни микрографии. Докато културите без предварителна обработка с JNK инхибитор показват невритна дегенерация след излагане на 6-OHDA, JNK инхибирането води до значително и значително намаляване на 6- OHDA-индуцирана невритна дегенерация (p= 0.0001 , d= 2.0209; Фиг. 7). Тези констатации подкрепят ключовата роля на JNK сигнализирането при невритна дегенерация, предизвикана от оксидативен стрес в човешки мезенцефални клетки, и което е важно, демонстрират полезността на нашия нов метод за генериране на научни открития чрез улесняване на бързото и точно измерване на невритна дегенерация.

Дискусия

Невритната дегенерация е свързана с различни невропатологични състояния, но молекулярните механизми, лежащи в основата на разграждането на невритите, остават ненапълно разбрани. Методите, улесняващи точния и ефективен анализ на невритната дегенерация, са от съществено значение за успешното идентифициране на нови фактори, регулиращи това важно клетъчно събитие. В настоящото изследване ние разкриваме множество източници на грешки, свързани с често използван метод за количествено определяне на невритната дегенерация. Докладваме експериментални данни, подкрепящи процедурни модификации, които могат да бъдат приложени, за да се намали грешката на DI анализа, и такива модификации са включени в нов макрос ImageJ, за да осигурят инструмент за бързи, точни и обективни DI анализи с помощта на отворен код и безплатен софтуер. Освен това, ние демонстрираме как подобреният метод може да бъде приложен за измерване на невритна дегенерация в модел на клетъчна култура на PD, разстройство, при което аксоналната фрагментация в допаминергичните неврони е събитие в ранен стадий, което предшества евентуална загуба на неврони (Tagliaferro and Burke, 2016) .

В настоящото проучване ние демонстрираме полезността на ANDI Macro при измерване на невритна дегенерация в модел на клетъчна култура на PD, състоящ се от диференцирани LUHMES клетки, изложени на 6-OHDA.

Докладваме експериментални открития, подкрепящи оптималните субстрати, върху които трябва да се установят културите, както и демонстрираме плътността на покритие, която е най-подходяща за анализи на невритна дегенерация. Използването на тази моделна система за изследване на невритна дегенерация има няколко предимства. Клетките развиват неврити, които са добре свързани и обикновено с дължина 0,500 mm, а културите са податливи на невродегенерация, индуцирана от класически, невротоксинови модели на PD като 6-OHDA, 1-метил{{4 }}фенилпиридиниев йон (MPP1) и ротенон (Lotharius et al., 2005; Zhang et al., 2014; Smirnova et al., 2016; Kraemer et al., 2021). Освен това човешкият произход на клетките LUHMES увеличава преводимостта на откритията, свързани с модела, а условното обезсмъртяване улеснява бързото генериране и размножаване на култури (Scholz et al., 2011). По този начин, съчетани с автоматизирани анализи, извършени с помощта на ANDI, клетките LUHMES могат да се използват за нови открития, свързани с невритна дегенерация, свързана с PD, като същевременно улесняват значително по-висока производителност в сравнение с неавтоматизираните анализи, извършени с първични невронни култури.

Многобройни изследователски групи са извършили DI анализи, използвайки фазово-контрастни изображения, за да получат представа за факторите, които регулират невритната дегенерация (Press and Milbrandt, 20{{10}}9; Kraemer et al., 2014 ; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Geisler et al., 2019). Тук съобщаваме за важен недостатък, свързан с този широко използван метод за измерване на невритна дегенерация: бинаризацията на фазово-контрастни изображения кара значителна част от интактните неврити да изглеждат фрагментирани. Въпреки че нивото на контраст, което може да се постигне при заснемане на микрографии, варира в зависимост от микроскопската система, достъпна за изследователите, този проблем е широко разпространен сред различни изследователски групи, тъй като DI от 0,2 обикновено се приема като праг, над който културите се считат за дегенериращи аксони и повечето научни доклади, включващи DI измервания от фазово-контрастни микрографии, съобщават за DI резултати за здрави неврони между 0,1 и 0,3 (Sasaki et al., 2009, 2016; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Лорето и др., 2020 г.). Нашите DI анализи, получени от флуоресцентни микрографии, както и субективни резултати от заслепени изследователи, показват, че 10–20% невритна фрагментация не е често срещана при здрави невронни култури. По-скоро такива култури показват само 2,5% невритна фрагментация средно. По този начин нашите открития подчертават необходимостта от методи, които подобряват точността на анализите на невритна дегенерация чрез намаляване на този често срещан и значителен източник на грешка в измерването.

Докато по-голямата част от проучванията, включващи DI измервания, са използвали фазово-контрастни изображения за извършване на анализи на невритна дегенерация, няколко изследователски групи наскоро извършиха DI измервания, използвайки изображения на неврони, имуномаркирани за цитоскелетни филаменти, като неврофиламентен среден полипептид или b -b-тубулин (Wakatsuki et al., 2011; Li et al., 2017; Pease-Raissi et al., 2017; Hernandez et al., 2018; Sundaramoorthy et al., 2020). Въпреки това коя форма на микроскопия е най-подходяща за измерване на невритна дегенерация остава неясна, тъй като са необходими изследвания, за да се разбере дали промените в локализацията на тези цитоскелетни протеини по време на невритна дегенерация по подходящ начин моделират общите промени в морфологията на невритите, както и да се оцени степента, до която DI измерванията, получени с флуоресцентни микрографии, корелират с подобни измервания, получени от фазово-контрастни микрографии. Тук ние демонстрираме, че флуоресцентните микрографии, изобразяващи оцветяване с b III-тубулин, не само точно представят невритната фрагментация, но също така улесняват по-точните DI измервания поради техния превъзходен контраст и намалена чувствителност към изкуствена фрагментация при бинаризация. По този начин нашите резултати подчертават ползата от използването на оцветяване с b III-тубулин за измерване на невритна дегенерация.

Сред публикуваните проучвания, включващи DI анализи за измерване на невритна дегенерация, отчетените параметри на размера и кръговрата, използвани за откриване на невритни фрагменти, варират значително. Например, скорошно проучване, включващо оценка на невритна дегенерация в култивирани неврони на хипокампа, използва параметри за размер от 4–900 пиксела (Li et al., 2017), докато проучване, включващо култивирани DRG неврони, използва параметри за откриване на 0–10 000 пиксела (Wakatsuki et al., 2011). Една потенциална причина за такава вариация е, че ефикасността на параметрите на размера на анализа на частиците при откриване на невритни фрагменти варира в зависимост от разделителната способност на изображението, тъй като параметрите на размера за откриване на частици са свързани с пикселни единици. За съжаление повечето публикувани проучвания, включващи DI анализи, не включват описание на разделителната способност на изображението, използвана за анализите. По този начин е необходимо установяването на стандартни параметри за анализ чрез протокол, който разкрива напълно важни подробности, като препоръчителната разделителна способност на изображението. Тук съобщаваме, че най-често цитираните параметри за откриване на невритни фрагменти са 20–10 000 пиксела (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. al., 2020; Shin и Cho, 2020), водят до това, че големи пропорции от невронни фрагменти остават неоткрити. Намаляването на критерия за минимален размер за откриване на невритни фрагменти повишава чувствителността на откриването на фрагменти, като същевременно увеличава броя на артефактите на изображението и неневритните остатъци, които са фалшиво открити като невритни фрагменти. В търсене на параметри, които биха балансирали най-добре чувствителността на откриване и нивата на фалшива положителност, ние идентифицирахме параметрите на анализа от 10–10, 000 като осигуряващи най-точното откриване на невритни фрагменти в бинаризирани изображения, получени от фазово-контрастни микрографии, докато параметри от 5–10, 000 улесняват най-точното откриване на невритни фрагменти в бинаризирани изображения, получени от флуоресцентни микрографии. Въпреки че тези определения са направени с помощта на разделителна способност на изображението от 1280 1024, такива параметри трябва също така да позволяват точно откриване на невритни фрагменти в изображения, заснети при други разделителни способности, включващи вертикален размер от 1024 пиксела, като общата разделителна способност на цял екран от {{ 27}}, тъй като невроните, изобразени в такива изображения, биха били с подобен размер на пиксела.

Многобройни изследователски групи са използвали критерий за минимален размер, когато конфигурират параметрите за анализ на частици, за да избегнат включването на малки, неневритни остатъци в измерванията на невритни фрагменти (Shin et al., 2012; Cosker et al., 2013; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Li et al., 2017; Loreto et al., 2020; Shin and Cho, 2020; Sundaramoorthy et al., 2020). Въпреки това, такива изследвания погрешно включват малка, нефрагментирана материя в измерванията на общата площ на невритите, тъй като такива измервания се получават чрез сумиране на площта на всички черни пиксели в изображението. Тук демонстрираме полезността на приставката за премахване на частици за премахване на малки, нефрагментирани остатъци от изображението преди DI анализ. Използването на приставката значително увеличи чувствителността на измерванията на невритна дегенерация, получени от изображения с фазов контраст. По този начин нашите резултати подчертават стойността на приставката за премахване на частици за изследователи, извършващи DI анализи, използвайки фазово-контрастни микрографии. Интересното е, че флуоресцентните микрографии показват по-малко малки, неневритни остатъци и по този начин може да се използва по-нисък критерий за размер от пет пиксела за откриване на фрагменти. Докато отстраняването на частици от неневритни остатъци с размер по-малък от пет пиксела не повлиява значително DI измерванията, получени от флуоресцентни микрографии, такива операции осигуряват стойности, които са теоретично по-точни и следователно са включени в ANDI.

Тъй като DI анализите трябва да се извършват с помощта на изображения, включващи изключително неврити, приложението на метода за анализ е предимно ограничено до използване с културни системи, податливи на отстраняване на клетъчни тела, като експлантни култури, в които клетъчните тела могат да бъдат физически изрязани (Catenaccio et al. , 2017; Shin и Cho, 2020) или култури в микрофлуидни устройства, улесняващи сегрегацията на сома и аксонни отделения (Cosker et al., 2013; Pease-Raissi et al., 2017; Tan et al., 2018). Алтернативно извършването на DI анализи с дисоциирани култури може да се постигне чрез досаден и отнемащ време труд, свързан с цифрово отстраняване на клетъчни тела от микрографии (Kraemer et al., 2014). В настоящото проучване ние разкриваме, че ANDI позволява извършването на DI измервания от микрографии, включващи LUHMES клетки, които са дисоциирани и мозаично разпределени в 2D културна система. Нашите констатации показват също, че ANDI улеснява 24-кратно намаляване на времето, необходимо за извършване на анализите, и операциите в ANDI, свързани с отстраняването на сома, дават резултати от DI анализ, които корелират 98% с подобни анализи, извършени след ръчно отстраняване на сома с помощта на инструмент със свободна ръка на ImageJ. По този начин макросът значително повишава ефективността на анализите чрез извършване на автоматизирано отстраняване на сома чрез процес, който не жертва точността, и такива операции разширяват пригодността на метода за анализиране на дисоциирани култури с мозаечно разпределени клетъчни тела.

В допълнение към улесняването на автоматизираното премахване на клетъчни тела от изображенията, ANDI предлага няколко ревизии на традиционния метод за извършване на DI анализ, включително използването на флуоресцентни микрографии, ревизирани параметри за анализ на частици и използване на средство за отстраняване на частици за отстраняване на малки, неневритни остатъци от изображения. Нашите констатации показват, че тези оптимизации колективно дават DI стойности, които по-точно се доближават до стойностите, получени чрез заслепено и подложено точкуване. По този начин, в допълнение към значителното намаляване на времето, необходимо за извършване на анализите, ANDI улеснява DI измерванията, които в сравнение с традиционния метод отразяват по-точно невритната дегенерация, която според съобщенията изследователите наблюдават от качествен анализ на изображения.

Един недостатък на традиционния метод за извършване на DI анализи е, че такива анализи изискват обучение за използване на ImageJ, така че потребителят да е запознат с досаден набор от ImageJ операции. Освен това, за да се извършват анализите ефективно, е необходимо допълнително обучение за потребителя да извършва групови анализи или да пише скриптове за полуавтоматизиране на изпълнението на определени стъпки. Чрез пълното автоматизиране на анализа ANDI улеснява DI измерванията само в няколко стъпки, свързани с изтеглянето и изпълнението на макроса. За да се увеличи удобството за потребителя, макросът включва код за предоставяне на интерфейс за избор на директории, съдържащи изображения за анализиране, както и за улесняване на извеждането на изображения с резултати и таблици с данни в директория по избор на потребителя. Освен това, скриптът съдържа множество функции, предназначени да предотвратят неточности в измерването или потребителски грешки, включително автоматично изчистване на предишни резултати от ImageJ; премахване на информация за мащаба на изображението, за да се гарантира, че измерванията се извършват точно с помощта на пикселни единици; подходяща конфигурация на цветовите настройки на ImageJ, настройките за измерване и параметрите на анализатора на частици; представяне на съобщение за грешка, ако потребителите погрешно изберат директории, съдържащи различен брой изображения, изобразяващи оцветяване с b III-тубулин и оцветяване с DAPI; описания на журналите, показващи напредъка на анализа; и кодиране за предотвратяване на грешки, свързани с автоматизираното генериране на .ini файлове от Windows 10. Като цяло тези функции правят DI анализите по-удобни за потребителя, което може да насърчи интереса към проучвания, свързани с невритна дегенерация.

За да демонстрираме неговата полезност в експеримент, ние използвахме ANDI, за да оценим приноса на JNK към невритна дегенерация в клетъчни култури LUHMES, изложени на 6-OHDA. JNK е активирана от стрес киназа, за която се съобщава, че е ключова за невритна дегенерация в периферни неврони от неприматичен произход (Shin et al., 2012), но са необходими допълнителни проучвания, за да се разбере ролята на киназата при невритна дегенерация в мезенцефални човешки клетки . Тук ние демонстрираме, че инхибирането на JNK значително защитава човешките мезенцефални клетки от невритна дегенерация, свързана с оксидативен стрес. Такива констатации не само разкриват важна роля за JNK в невритната дегенерация, свързана с модел на човешко заболяване, но също така илюстрират полезността на ANDI за извършване на автоматизиран и обективен анализ на изображения, за да се направят нови научни открития.

Въпреки че първоначално ANDI беше проектиран да улесни бързото и точно измерване на невритна дегенерация в култури от диференцирани LUHMES клетки, изложени на 6-OHDA, нашите открития показват също, че макросът може да се използва за откриване на невритна дегенерация, предизвикана от други причини, като напр. излагане на водороден прекис или спиране на невротрофина. Освен това, версия 1.1 на макроса включва диалогов прозорец, който позволява на изследователите да персонализират операциите за премахване на сома за неврони със специфични размери. Нашите данни също така подкрепят, че методи за оцветяване, различни от имуномаркиране за b III-тубулин, могат да се използват за точно измерване на невритна дегенерация. Въпреки че препоръчваме използването на пилотни проучвания за проверка на точността на измерванията на DI при използване на ANDI с клетъчни типове или методи на оцветяване, които не са били тествани преди, тези констатации подкрепят, че макрото е като цяло универсален инструмент за измерване на невритна дегенерация в култивирани неврони. Тъй като ANDI не е оптимизиран за измерване на невритна дегенерация в тъканите, в момента препоръчваме използването му само за анализиране на невритна дегенерация, свързана с култивирани клетки. Въпреки това, кодът за ANDI е публично достъпен и по този начин може да бъде полезен и за изследователи, които се интересуват от модифициране на скрипта, за да отговаря на in vivo проучвания или други приложения.

В заключение, тази статия представя данни, разкриващи общи източници на грешки, свързани с широко използван метод за количествено определяне на невритната дегенерация. Бяха използвани експериментални подходи за подобряване на метода и такива подобрения бяха включени в безплатен ImageJ макрос с отворен код, който може да се използва за извършване на бърз, точен и обективен анализ на флуоресцентни микрографии за невритна дегенерация. Нашите открития разкриват ефикасността на ANDI за количествено определяне на невритна дегенерация в микрографии, изобразяващи модел на клетъчна култура на PD, както и предоставят доказателство за принципа, че макрото може да открие невритна дегенерация, свързана с други биологични контексти. Удобният за потребителя макрос ще намали времето, необходимо на изследователите да се научат да определят количествено невритната фрагментация, като същевременно ще увеличи производителността и точността на изследванията, оценяващи факторите, лежащи в основата на невритната дегенерация. Макросът ANDI е достъпен на следния URL адрес: https:// github.com/kraemerb/kraemerlab.

Препратки

1. Aarsland D, Creese B, Politis M, Chaudhuri KR, Ffytche DH, Weintraub D, Ballard C (2017) Когнитивен спад при болестта на Паркинсон. Nat Rev Neurol 13: 217–231.

2. Adalbert R, Coleman MP (2013) Преглед: патология на аксона при свързани с възрастта невродегенеративни разстройства. Neuropathol Appl Neurobiol 39:90–108.

3. Bové J, Perier C (2012) Невротоксин-базирани модели на болестта на Паркинсон. Неврология 211: 51–76.

4. Catenaccio A, Llavero Hurtado M, Diaz P, Lamont DJ, Wishart TM, Court FA (2017) Молекулярен анализ на аксонално-присъщата и глиално-свързаната корегулация на дегенерация на аксон. Клетъчна смърт Dis 8: e3166.

5. Cosker KE, Pazyra-Murphy MF, Fenstermacher SJ, Segal RA (2013) Координирана транскрипция на целеви невротрофини.

6. Di Stefano M, Nascimento-Ferreira I, Orsomando G, Mori V, Gilley J, Brown R, Janeckova L, Vargas ME, Worrell LA, Loreto A, Tickle J, Patrick J, Webster JRM, Marangoni M, Carpi FM, Pucciarelli S, Rossi F, Meng W, Sagasti A, Ribchester RR, et al. (2015) Повишаването на прекурсора на NAD никотинамид мононуклеотид (NMN) след нараняване насърчава дегенерация на аксон. Клетъчната смърт се различава 22: 731–742.

7. Fukui K (2016) Реактивните кислородни видове индуцират невритна дегенерация преди индукция на клетъчна смърт. J Clin Biochem Nutr 59: 155–159.

8. Geden MJ, Deshmukh M (2016) Дегенерация на аксон: контекстът определя различни пътища. Curr Opin Neurobiol 39: 108–115.

9. Geisler S, Doan RA, Cheng GC, Cetinkaya-Fisgin A, Huang SX, Höke A, Milbrandt J, DiAntonio A (2019) Винкристин и бортезомиб използват различни механизми нагоре по веригата, за да активират обща дегенерация на аксон, зависима от SARM1- програма. JCI Insight 4:e129920.

10. Hernandez DE, Salvadores NA, Moya-Alvarado G, Catalan RJ, Bronfman FC, Court FA (2018) Аксонална дегенерация, предизвикана от глутаматна ексцитотоксичност, се медиира от некроптоза. J Cell Sci 131:jcs214684.

For more information:1950477648nn@gmail.com