Количествено протеомно изследване разкрива пътя на фибриногена при поликистозно чернодробно заболяване
Nov 21, 2023
Резюме:(1) Предистория: Поликистозното чернодробно заболяване (PLD) е хетерогенна група от вродени заболявания, характеризиращи се с дилатация на жлъчните пътища и развитие на кисти, произлизащи от холангиоцити. Независимо от това, механизмът на цистогенезата понастоящем е неизвестен и лечението с PLD е ограничено до чернодробна трансплантация. Необходими са нови и ефективни терапевтични подходи. В този контекст, настоящата работа има основна цел да намери нови молекулярни пътища, както и нови терапевтични цели, включени в процеса на чернодробна цистогенеза. (2) Методи: Извършена е количествена протеомика, базирана на SWATH–MS технология, сравняваща чернодробните протеоми наДив типи мутантни/полицистозни черни дробове в aполикистоза на бъбреците(PKD) миши модел (Pkd1cond/конд; Там-Кре−/+). (3) Резултати: Идентифицирахме няколко протеини, променени в изобилие, с двукратна гранична регулация нагоре или надолу и коригиранаp-стойност, значително свързана с чернодробната цистогенеза. След това извършихме обогатяване и протеин-протеинов анализ, идентифицирайки клъстер, фокусиран върху чернодробни фибриногени. И накрая, ние потвърдихме селекция от цели чрез RT-qPCR,Western blotting,и имунохистохимия, намиране на висока корелация с количествени протеомични данни и валидиране на фибриногенния комплекс. (4) Заключения: Тази работа идентифицира нов молекулярен път при кистозна чернодробна болест, подчертавайки фибриногенния комплекс като възможна нова терапевтична цел за PLD.
Ключови думи:PLD; SWATH; количествена протеомика; терапевтични цели
1. Въведение
Поликистоза на черния дроб(PLD) е хетерогенна група от вродени заболявания, характеризиращи се с дилатация на жлъчните пътища и развитие на кисти, произлизащи от холангиоцити (епителни клетки от жлъчните пътища). Многобройните кисти се разпространяват и прогресират в чернодробния паренхим, компрометирайки неговата функция [1]. PLD се унаследяват в доминантна или рецесивна форма и могат да се появят изолирано (изолирана поликистоза на черния дробилиПЛД) или по-често като anекстраренална проявана автозомнодоминираща поликистоза на бъбреците при възрастни(PKD) [2]. вавтозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване(ADPKD), ~85% от пациентите развиват чернодробни кисти в целия чернодробен паренхим и тяхната тежест може да варира от няколко кисти до тежка чернодробна цистогенеза [3,4]. Междувременно, вавтозомно рецесивно поликистозно бъбречно заболяване(ARPKD), могат да се развият чернодробни кисти, но основното чернодробно усложнение е дефектно ремоделиране на дукталната пластина с вродена чернодробна фиброза [5,6]. И за двете, PLD е основната екстраренална проява и изисква клинично управление и лечение [2,5]. Основният клиничен подход при пациенти с PLD е да се намалят техните клинични симптоми. Лечението на усложненията на жлъчните пътища е основната клинична характеристика, която трябва да се контролира, а крайната стратегия за лечение обикновено е чернодробна трансплантация [7], тъй като няма ефективно фармакологично лечение на PLD [2,5]. Множество молекулярни пътища са свързани със заболяването [8], като повишена секреция на течности [9,10], пролиферация [11], фиброза [12,13], цилиарни дефекти [14] и други [7,8]; но основният механизъм, подложен на цистогенеза, остава да бъде изяснен. Спешно е необходимо идентифицирането на нови потенциални терапевтични цели. Всички тези проучвания се основават на молекулярни изследвания, използващи различни класически молекулярни инструменти: 3D клетъчна култура [7,8], имунохистохимия [7–9,11,12], ELISA [9,11], трансмисионна електронна микроскопия (TEM) [12] , имуноцитохимия [11], RT-qPCR (количествена PCR в реално време) [7,8,10,11] и Western blot [7,8,10–12]. Подходът към изучаването на болестта от нови гледни точки, добре установени предклинични животински модели и възползването от новите технологии може да бъде от полза при откриването на нови молекулярни механизми на болестта за превръщане на молекулярните открития в нови терапии.
Течната хроматография, съчетана с тандемна масспектрометрия (LC–MS/MS), е най-често използваната технология за характеризиране на протеомите на заболяването, както и за идентифициране на възможни биомаркери на заболяване или скрининг на лекарства [15,16]. Нововъзникваща стратегия, наречена SWATH–MS (последователно придобиване на прозорец на всички теоретични спектри на фрагментни йони–масова спектрометрия), позволява възпроизводимо, надеждно, високопроизводително количествено определяне с до хиляди протеини, анализирани на биологична проба, и с възможност за едновременно извършване на голям брой анализи [16,17]. За тази технология пробите се усвояват с трипсин и се анализират чрез течна хроматография, свързана с тандемна масова хроматография, работеща в така наречения режим на независимо събиране на данни (DIA) [16] (вижте Материали и методи). Протеомика от следващо поколение SWATH–MS технология позволява количествено определяне на протеома и идентифициране на разликите в изобилието на протеини в различни проби и условия.
В настоящото изследване извършихме диференциален протеомен количествен анализ, базиран на технологията SWATH–MS при поликистозно чернодробно заболяване от мутантни животински модели. Докладваме списък на протеини със статистическа значимост на диференциалното изобилие на протеини, които се характеризират с различни анализи на обогатяване и обработка на данни. И накрая, ние потвърдихме данните от SWATH, като идентифицирахме и подчертахме фибриногенния комплекс като нов механизъм на заболяването и възможна нова терапевтична цел за PLD.
2. Материали и методи
2.1. Миши модел
В това изследване използвахме миши Pkd1 условно нокаут животински модел, C57/BL6 k Pkd1cond/cond; Tam-Cre [18,19]. Моделът Cre-mouse беше използван като див тип (WT), а Cre+ като мутант (KO). Генотипите бяха потвърдени чрез стандартна PCR, следвайки описаните условия и праймери [18]. Делецията на Pkd1 винаги е била на постнатални дни 10 и 11 (p10 и p11) с еднократно интраперитонеално инжектиране на тамоксифен (10 mg/40 g) (Sigma®, St. Louis, MO, USA No. T5648), разреден в царевично масло (Sigma–Aldrich®, St. Louis, MO, USA No. C8267), и двата дни при майката на котилата, които трябва да бъдат индуцирани. Животните бяха евтаназирани на постнаталния ден 30 (p30). Групите бяха създадени от различни индивиди и организирани на случаен принцип (рандомизация), като се поддържаше съотношение 1:1 между мъже и жени във всички групи. За определяне на пола на животните са използвани анатомични характеристики. Мишките бяха настанени в съоръжение без патогени (SPF) от установените условия на университета в Сантяго.
2.2. Извличане и храносмилане на протеини
В точката на жертване p30 разрязаният черен дроб се съхранява при -80 ◦C. Целият черен дроб се смила в течен азот, като се използва охладен с течен азот хаван (DD Biolab®, Барселона, Испания № 088763), като половината от тъканта се определя за екстракция на протеин, а другата половина за екстракция на РНК. Протеиновите екстракти се приготвят с RIPA лизиращ буфер (10 Mm TRIS, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% TRITON X-100 и 1% натриев деоксихолат). Добавени са също 1% инхибитори на протеаза и фосфатаза (Sigma® No. P8340 y No. P0044). Този тъканен лизат претърпя процес на центрофугиране (за 30 минути при 4 ◦C и 14,000 rpm). След това супернатантата се събира отново и се определя количествено чрез анализ на Bradford протеин (Bio-Rad® No. 5000001). Протеинови аликвоти (100 µg) се концентрират в една лента в електрофореза с 10% натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел (SDSPAGE), нарязват се и се подлагат на ръчно смилане, както е описано по-горе [20]. Накрая, екстрахираните пептиди се разтварят в 0.1% мравчена киселина за допълнителен анализ.
2.3. Протеомика
2.3.1. DDA-данни
Зависим анализ 4 µL от всяка проба (над 4 µg протеин) се анализират чрез подхода на зависимо от пушка придобиване на данни (DDA) чрез микро-LC-MS/MS. Пробите бяха разделени от Ekspert nLC425 micro-LC система (Eksigen®, Дъблин, Калифорния, САЩ), използвайки уловителна колона YMC-TRIART C18 с размер на частиците 3 mm и размер на порите 120 Å (YMC Technologies, Teknokroma, Барселона, Испания) и колона Chrom XP C{{10}} mm × 0.30 mm, размер на частиците 3 mm и размер на порите 120 Å (Eksigen® ) при скорост на потока 10 µL/min. Използваните разтворители са разтворител А (вода, 0.1% мравчена киселина) и разтворител В (ACN, 0.1% мравчена киселина). Градиентът беше от 5% до 95% В за 30 минути, 5 минути при 90% В и накрая още 5 минути при 5% В за еквилибриране на колоната, за общо време от 40 минути. Свързаният масспектрометър беше хибриден квадруполен-TOF масспектрометър, 6600 (SCIEX®, Framingham, MA, USA), работещ със система за събиране на данни в режим на положителни йони. С помощта на масспектрометъра беше извършено сканиране от 250 ms при 400 до 1250 m/z, последвано от MS/MS експерименти при 100 до 1500 m/z (25 ms време на придобиване) за общо време на цикъл от 2,8 s. Фрагментираните прекурсори бяха добавени към динамичния списък за изключване за 15 s, всеки йон със заряд +1 беше изключен от MS/MS анализа. MS необработени файлове и търсения в бази данни бяха комбинирани и извършени с помощта на софтуер ProteinPilot v.5.0.1. (SCIEX®, Framingham, Масачузетс, САЩ), използвайки специфична за мишка база данни UniProt Swiss-Prot. Необходимо е да се уточни йодоацетамид цистеин алкилиране като фиксирана модификация и трипсин смилане. Степента на фалшиво откриване (FDR) беше зададена на 1 за пептиди и протеини с резултат на доверие над 99% [21].
2.3.2. Генериране на референции
Спектрална библиотека Спектралната библиотека беше извършена по DDA метод, както е описано по-горе, но вместо всяка независима проба, беше направен пул от всяка група с 4 µL от всяка проба (над 4 µg протеин), за да се получи по-представителен протеин идентификация в спектралната библиотека. Всички необработени файлове бяха стартирани заедно в базата данни Uniprot, за да се получи спектралната библиотека, използвайки пилотните условия на протеин, споменати в предишния раздел.
2.3.3. Количествено определяне чрез SWATH и анализ на данни
Придобиването на SWATH-MS беше извършено с помощта на метод DIA. Използвахме 4 групи с 4 биологични реплики на група и 3 технически реплики на проба (вижте таблица S1 за повече подробности). Тъканите бяха анализирани и във всички случаи сравнени в условия на див тип (от Pkd1cond/cond; Tam-Cre− мишка) и мутант (от Pkd1cond/cond; Tam-Cre+ мишка). 4 µg протеин на проба и технически реплики бяха проведени с помощта на SWATH метод. За всеки набор от проби, ширината на 100-те променливи прозореца беше оптимизирана според йонната плътност, открита в DDA изпълненията на библиотеката, използвайки електронна таблица с променливи прозорци на Sciex SWATH. Следователно методът SWATH се основава на цикъл от повторения, който се състои от придобиване на 100TOF MS/MS сканирания (400 до 1500 m/z, режим на висока чувствителност, 50 ms време на придобиване) на изолационни прозорци на последователни припокриващи се прекурсорни променливи с ширини (1 m/z припокриване), покриващ обхвата на масата от 400 до 1250 m/z с предишно TOF MS сканиране (400 до 1500 m/z, 50 ms време за придобиване) за всеки цикъл. Общото време на цикъла е 6,3 s.
2.3.4. Анализ на данни
Всички протеини в йонната библиотека, които бяха идентифицирани от ProteinPilot с FDR под 1%, бяха количествено определени чрез метода SWATH. След като бяха получени отделни проби, спектралното подравняване и целевото извличане на данни бяха извършени от PeakView v.2.2. (SCIEX®, Framingham, MA, USA), съответстващи на референтната спектрална библиотека, както е описано по-долу [22–26]. Времената на задържане на пептидите, които бяха избрани за всеки протеин, бяха пренастроени във всеки цикъл според iRT пептидите, присъстващи във всяка проба, и бяха елуирани по оста на цялото време. Екстрахираните йонни хроматограми след това се генерират за всеки йон от избрания фрагмент; пиковите площи за пептидите бяха получени чрез добавяне на пиковите площи на йоните на съответните фрагменти. PeakView изчислява FDR и резултат за всеки определен пептид според хроматографските и спектралните компоненти; само пептиди с FDR под 5% са използвани за количествено определяне на протеини. По подобен начин, за да се получат областите за количествено определяне на протеина като функция на интензитета на сигнала, бяха избрани до 10 пептида на протеин и седем фрагмента на пептид. Всички споделени и модифицирани пептиди бяха изключени от обработката. Петминутни прозорци и 30 ppm ширини бяха използвани за извличане на йонните хроматограми.
2.3.5. Анализ на сигналния път
Извършен е различен функционален анализ, използвайки диференциално експресирани протеини, за да се оценят най-подходящите мрежи за взаимодействие, свързани пътища или клетъчни компоненти и други свързани протеини или пътища. Използвани са номера за достъп на протеин UniProt (https://www.uniprot.org/, 28 август 2021 г.). Протеините с разлики в изобилието на протеини бяха подложени на: String® (https://string-db.org/, 25 октомври 2021 г.), използвайки термините на генната онтология (GO) и FunRich® (http://funrich.org/index.html , 21 октомври 2021 г.) за изследване на протеинови мрежи и биологична връзка между протеини; и към Reactome® (https://reactome.org/, 25 октомври 2021 г.) за изследване на пътищата, включени във връзка или взаимодействие със значително експресирани протеини.
2.4. Хистология и измерване на кистозния индекс
Най-големият дял на черния дроб на животните винаги се фиксира в параформалдехид (4% буфериран разтвор на параформалдехид, pH=7, Labbox No. FORM-D0P-10K) за една нощ при 4 ◦C. След това черният дроб се дехидратира с ксилен и етанол и накрая се поставя в парафин. Събрани са напречни срезове от 4,5 цт. За хематоксилин-еозин (HE) и трихромно оцветяване на Masson бяха използвани стандартни протоколи.
За количествено определяне слайдове от надлъжни разрези на най-големия дял на черния дроб винаги се вземат като представителни изображения и най-малко шест различни разреза на животно, визуализирани под микроскоп Olympus BX51, свързан към Olympus Camera DP70, се използват за количествено определяне на кистозен индекс и редица кисти. Количественото определяне на двата параметъра беше изчислено със софтуерен инструмент за автоматично разпознаване на кисти, наречен CystAnalyser (https://citius.usc.es/transferencia/software/cystanalyser, 1 юли 2020 г.), както беше описано по-рано [35].
2.5. Клинична химия
Кръвта беше събрана преди евтаназията и серумът беше получен с помощта на епруветки BD Vacutainer SST II Advance. Серумната аланин трансаминаза (ALT) и алкалната фосфатаза (ALP) бяха измерени с помощта на ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Healthineers, Erlangen, Германия).
2.6. Екстракция на РНК
РНК се изолира, както е описано по-горе [36] чрез използване на TRIzol протокол (TRI Reagent, Sigma®, St. Louis, MO, USA, No. T9424), в който хлороформ (Sigma® No. C2432) служи като денатуриращ агент за клетките и изопропанолът (Sigma® No. 650447) е утаяващият агент за РНК. Утайката се разрежда в DEPC вода (Ambion®, Austin, TX, USA, No. AM9920), която също съдържа 1% SUPERaseIn RNase инхибитор (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, No. AM2694).
2.7. Количествен PCR в реално време
Един микрограм от общата чернодробна РНК се третира с ДНКаза I (Invitrogen®, Карлсбад, Калифорния, САЩ, № 18068015). След това беше извършена обратна транскрипция с комплект SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen®, № 18080051) и анализ на генната експресия чрез количествена PCR в реално време с помощта на FastStart Universal SYBR GREEN Master (ROX) (Roche® № 04913914001 ) в система Mx3005P (Agilent Technologies®, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Праймерите, използвани за това проучване, са проектирани с Primer 3 Plus (http://tiny.cc/pf928y, 11 март 2020 г.) и се основават на cDNA референтни последователности, публикувани в браузъра за геном Ensembl (http://www.ensembl.org /index.html, 11 март 2020 г.). Пълните последователности на всички праймери, използвани в изследването, се намират в Таблица S2. Следната програма беше използвана за всички пълни PCR реакции: стъпка на денатурация с 30 s при 95 °C; 45 цикъла от 30 s при 95 ◦C, 1 min при 60 ◦C и 30 s при 72 ◦C; последвано от етап на охлаждане. Както направихме по-рано [36], всяка проба (n=6 за всяка група) беше пусната в три екземпляра във всеки експеримент. Резултатите са анализирани чрез метода на абсолютното количествено определяне. Следователно, стандартна крива с известни концентрации беше използвана в анализа и, в допълнение, всяка проба беше нормализирана към постоянен експресионен ген. В това изследване генът Gapdh (глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа) е използван като домакински ген.
2.8. Western blotting
Уестърн блотинг анализи се извършват върху цели чернодробни лизати. Общото съдържание на протеин се определя с помощта на протеинов анализ на Bradford (Bio-Rad®, Hercules, CA, USA, No. 5000001) и същото количество от всеки протеин (20-30 µg) се определя кипят при 95 ◦C в продължение на 5 минути и се разделят в 10% SDS-PAGE при редуциращи условия. PageRuler™ Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, No. 26616) се използва като стандарт за протеиново молекулно тегло. Впоследствие протеините се прехвърлят в нитроцелулозни мембрани (Bio-Rad® No. 1620115). За да се избегне неспецифичното свързване, мембраните се блокират за 1 час при стайна температура, като се използва 2,5% разтвор на BSA (NZYTech®, Lisboa, Португалия, № MB046) за фосфорилирани протеини или SuperBlock блокиращ буфер (Thermo Fisher®, Waltham, MA, САЩ, № 37515). Впоследствие мембраните се инкубират една нощ при 4°C с първични антитела и след това се промиват в 0,3% Tween-20 в PBS. Накрая нитроцелулозните мембрани се инкубират в продължение на 1 час при стайна температура с HRP-свързаните вторични антитела. Сигналите са разработени с комплекта SuperSignal™ West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, No. 34580) или PierceTM ECL Western Blotting Substrate kit (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA No. 32109) преди това за визуализация в системата за изображения ChemiDoc™ (Bio-Rad®, Херкулес, Калифорния, САЩ). Протеиновите ленти бяха количествено определени с помощта на софтуер ImageJ® Lab (v 4.0.1, https://imagej. nih.gov/ij/, 26 март 2021 г.). Нивата на протеиновата денситометрия бяха нормализирани към домакинските протеини GAPDH или -ACTIN. За всяка група. Във всички експерименти беше използван N=6.
Следните първични антитела бяха използвани за Western blotting: анти-ANXA2 (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Далас, Тексас, САЩ #sc-28385), анти -SAMP (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Далас, Тексас, САЩ, No. sc-393948), анти-FIBB (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Далас, Тексас, САЩ, № sc-271035), анти-FIBA (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Далас, Тексас, САЩ, № sc-398806), анти-FIBG (1:500 , Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Далас, Тексас, САЩ, № sc-133157), анти-HAO2 (1:1000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, САЩ, № 113442), анти-GAPDH (1:1000, Cusabio®, Хюстън, Тексас, САЩ, № CSB-RA009232A0HU) и анти- -АКТИН (1:1000, Cell Signaling Technology®, Данвърс, Масачузетс, САЩ, № 8457), като както и вторичното антитяло кози анти-заешки IgG HRP (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, САЩ, № 31460) или кози анти-миши IgG HRP (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, САЩ, № 31430).
2.9. Имунохистохимия и количествено определяне
За имунохистохимия беше използван натриев цитратен буфер pH=6 (Agilent Dako®, Glostrup, Дания No. S2369) за извличане на антиген и тъканта беше блокирана с разредител на антитела (Agilent Dako® No. K8006). Антитялото, използвано за имунохистохимичен анализ, беше фибриноген (Agilent Dako® No. A0080) и HPR-конюгирана система за откриване за имунооткриване. И накрая, количественото определяне на имунохистохимията беше извършено с помощта на функцията „Разделени канали“ (зелен канал) от софтуера Fiji-ImageJ® (https: //imagej.net/software/fiji/, 13 октомври 2021 г.). За всяка проба е използвано n По-голямо или равно на 6 изображения.
2.10. Статистически анализ
Data are presented as means ± SEM for all cases (bar or point plots). First, normal distribution was confirmed using the Kolmogorov–Smirnov test. A two-tailed t-test was used to determine the significance of differences between two groups. p < 0.05 was considered statistically significant. Furthermore, ** corresponds to p-values < 0.01 and *** to p-values < 0.001. All datasets were analyzed using GraphPad Prism software (version 9, https://www.graphpad.com/, 13 October 2021). For proteomic studies, a Student's t-test (using MarkerView software, 22 December 2017) was performed to compare the groups in pairs to identify proteins, which were significantly differentially represented using adjusted p-value < 0.05 (multiple correction FDR method) and fold change >2 като прекъсване. Беше извършен неконтролиран многовариантен статистически анализ с помощта на анализ на главните компоненти (PCA), за да се сравнят данните в пробите.
Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:
Имейл:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/телефон:+86 15292862950
Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
