Количествен протеомичен анализ на пациенти с COVID-19: Фетуин-А и тетранектин като потенциални модулатори на вродени имунни отговори

АБСТРАКТ

Лечението на тежки случаи на коронавирусна болест 2019 (COVID-19) е изключително важно за минимизиране на смъртта и увреждането на крайните органи. Тук извършихме протеомен анализ на плазмени проби от леки, умерени и тежки пациенти с COVID-19. Анализът разкрива диференциално експресирани протеини и различни терапевтични потенциални цели, свързани с вродени имунни отговори, като фетуин-А, витронектин (TN) и параоксоназа-1 (PON1). Освен това промените на протеините в плазмата показват дисрегулация на комплемента и коагулационните каскади при пациенти с COVID-19 в сравнение със здрави контроли. В заключение, нашите протеомични данни предполагат фетуин-A и TN като потенциални цели, които могат да се използват за диагностика, както и сигнатури за по-добро разбиране на патогенезата на заболяването COVID-19.

Крайните органи се отнасят до тъканите или органите, които накрая изпълняват специфични функции в човешкото тяло, като черния дроб, бъбреците и белите дробове. Увреждането на тези органи може да доведе до различни сериозни заболявания, като хронично бъбречно заболяване, цироза на черния дроб и хронична обструктивна белодробна болест. Имунитетът се отнася до имунния отговор на организма към чужди патогенни микроорганизми и тъкани. Имунитетът на организма остава нормален, което може да предотврати появата и по-нататъшното влошаване на заболяванията. Следователно увреждането на крайните органи е тясно свързано с имунитета и те взаимодействат, за да повлияят на имунната функция на човешкото тяло.

Увреждането на крайните органи може да доведе до увреждане на броя и качеството на имунните клетки в тялото. Например, пациентите с чернодробно заболяване ще изпитат левкопения, нарушена чернодробна функция и намален синтез на антитела, което ще ги направи по-податливи на инфекции след боледуване; намалената бъбречна функция ще доведе до уремия. Синдром, анемия, остеопороза и други заболявания, тези фактори също ще повлияят на имунната функция на тялото. От друга страна, имунният отговор на тялото може да засегне и крайните органи, например прекомерният имунен отговор може да доведе до имунен хепатит или анафилактична пневмония. Взаимодействието на увреждането на крайните органи и имунната дисфункция прави тялото по-податливо на болести и съкращава живота му.

Следователно поддържането на нормална функция на крайните органи и стабилна имунна функция е от ключово значение за поддържане на добро здраве. Хората трябва да предотвратяват увреждането на крайните органи чрез добър начин на живот, като здравословна диета, подходящи упражнения и релаксация, и да поддържат нормална имунна функция чрез активна превенция и лечение на заболявания. Вижда се, че трябва да обърнем внимание на имунитета си. Цистанче може да подобри имунитета, като ефектът е добър. Полизахаридите в месото могат да регулират имунния отговор на човешката имунна система, да подобрят способността за стрес на имунните клетки и да подсилят имунните клетки. бактерициден ефект.

Кликнете върху ползите за здравето от цистанче

1. Въведение

Тежкият остър респираторен синдром, коронавирус 2 (SARS-CoV-2), причини коронавирусна болест 2019 (COVID-19) [1]. Болестта COVID-19 се характеризира с различни клинични фенотипове, вариращи от асимптоматични, леки и умерени до тежки или изключително тежки, характеризиращи се с тежка пневмония и висок риск от смърт при по-възрастното население, особено при пациенти над 70 години [ 2,3]. Ваксините бяха генерирани в края на 2020 г. и повечето хора по света бяха ваксинирани с поне 2 дози. Въпреки намаляването на броя на заразените лица, както и докладваните тежки случаи, проблемът все още не е разрешен и причината за прогресирането на заболяването до тежко състояние остава неизвестна. Освен това SARS-CoV-2, подобно на други вируси, се променя с времето и новите варианти може да имат модификация в първоначалните свойства, като разпространението и свързаната тежест на заболяването, и да станат по-малко (вариант на омикрон) [4] или повече (делта вариант) [5] тежък. Потенциалната поява на нови варианти все още е възможна и разбирането на механизма на пътищата зад болестта COVID-19 е много важно.

Добре известно е, че дисфункцията на имунния отговор е основният проблем срещу изчистването на вируса и възстановяването от болестта. Освен това, вродените имунни отговори се считат за ключови фактори за модулиране на прогреса на заболяването към асимптоматични, леки, умерени, тежки или изключително тежки клинични фенотипове [6,7]. Неутрофилите и моноцитите/макрофагите са ключовите защитни елементи на предната линия, управляващи вродените имунни отговори по време на инфекция [8,9]. Шиповият протеин на SARS-CoV-2 може да активира макрофагите директно чрез АСЕ2 рецептора, присъстващ в тези клетки [10].

По време на инфекцията имунните клетки освобождават няколко протеини, цитокини и медиатори, за да регулират възпалението и да поддържат физиологичната хомеостаза на тялото. Базираната на плазма протеомика е практически подход за анализиране на протеинови профили и сортиране на промени, свързани с патофизиологични състояния или прогресия на заболяването [11]. Бяха проведени различни протеомични изследвания за идентифициране и характеризиране на протеомни профили в различни кохорти на COVID-19, като се използват тъкани [12,13], клетки [14] или плазма [15,16]. Следователно ние приложихме базирана на плазма протеомика, за да идентифицираме потенциални протеини, свързани с вродената имунна система, свързани с болестта на COVID-19 и прогресирането на тежестта. Нашата цел е да проучим модела на експресия на плазмен протеин при здрави и заразени с COVID-19-пациенти и да оценим потенциалното взаимодействие с вродените имунни отговори.

2. Резултати

2.1. Плазмени протеомни профили

За да се оценят реакциите на гостоприемника на SARS-CoV-2, беше извършен плазмен протеомичен анализ на кохорта пациенти с COVID-19 и здрави контроли. В нашето проучване методът iTRAQ 4plex беше внимателно избран пред други методи, маркирани с протеомика, поради високата възпроизводимост и протеомно покритие [17]. Освен това, за по-добра дълбочина на общо протеомно покритие, ние комбинирахме силно фракциониране на катионобменен пептид с iTRAQ. Илюстрация на работния процес на изследването е представена на Фиг. 1. Общо 176 протеина бяха идентифицирани във всички COVID-19 и здрави контролни плазмени проби със степен на фалшиво откриване от<1% at the protein level. Nevertheless, our prime interest was to identify biomarkers and investigate the pathogenesis of COVID-19. Consequently, differentially expressed proteins analysis was performed for healthy control versus other COVID-19 groups (severe, moderate, and mild) by applying pairwise comparison. Supplementary Table S1 shows a list of differentially expressed proteins in all pairwise comparisons including 'severe v. Control', 'moderate v. Control', and 'mild v. Control'. The statistical criteria for the quantitative analysis were set with a cutoff for fold change with >1.20 за регулиране нагоре и<0.83 for down-regulation and a p-value of <0.05 (Supplementary Table S2). 

Резултатите показват, че броят на протеините, които се променят сред групите от сравнения, варира, както е показано на Фиг. 2а. Сравнителните резултати показват, че 27 процента от диференциално експресираните протеинови измервания се припокриват и в трите групи (фиг. 2b). Диаграмата на Venn също показа, че броят на уникалните протеини в двойното състрадание на леко спрямо контрола има по-висок брой в сравнение с други групи. Това не отразява непременно разликите на нивото на идентификация на протеина, а количественото ниво, като се има предвид, че статистическите критерии са избрани за кратната промяна и p-стойността. За да се оцени дали диференциално експресираните измервания на протеини за всички сравнения могат да бъдат разграничени между групите на COVID-19 или не, беше приложен PCA анализ. Интересното е, че резултатите показват, че има ясно разграничение между групите на COVID-19, както е показано на Фиг. 3. Освен това, диференциално експресираните протеини са представени чрез създаване на графика на вулкан за всички сравнения по двойки на здрава контрола спрямо COVID{{ 7}} групи (фиг. 4). Няколко от диференциално експресираните протеини в нашия набор от данни са докладвани преди като биомаркери за COVID-19 [16,18].

Анализът на генната онтология и пътя с помощта на онлайн инструмента „STRING“ беше извършен върху диференциално експресирани измервания на протеини за здрави контролни пациенти и пациенти с COVID{{0}}, независимо от групата, в която са. За анализа на обогатяване go, мнозинството на диференциално експресирани протеини е установено, че участват в биологичната регулация, извънклетъчната област и регулатора на молекулярната функция за биологичния процес, клетъчния комплемент и молекулярната функция съответно (допълнителен материал, фиг. S1). Освен това, ние проучихме диференциално експресираните протеини и тяхното участие в анализа на пътя, използвайки базата данни KEGG. Статистическите критерии на анализа на обогатяване бяха избрани да бъдат p <0.01 и класирането на термините на пътя се основава на обогатяване на пъти, както е показано в допълнителния материал (фиг. S2). По време на инфекцията увредените и мъртви клетки инициират големи имунни реакции и освобождават различни клетъчни компоненти и ендотоксини, които активират каскадата на кръвосъсирването [19]. Активирането на такива пътища води до ендотелна дисфункция и възпаление, както и до стимулиране на миграцията на левкоцитите и тъканната инфилтрация, като по този начин предизвиква активиране на вродени имунни локални отговори [20]. В нашето проучване беше установено, че системата на комплемента, която е централният модулатор на вродения имунитет и коагулационните каскадни пътища, е най-значимата сред другите термини на пътя. Няколко протеомични проучвания върху плазма от пациенти с COVID-19 показват, че каскадите на комплемента и коагулацията са едни от най-обогатените пътища [21,22]. Фокусът на нашата дискусия обаче е върху три протеина fetuin-A, TN и PON-1 като потенциални нови цели, участващи във вродените имунни отговори на SARS-COV-2 инфекция и тежестта на COVID{{ 14}} заболяване.

2.2. Плазмените нива на TNF са свързани със симптомите на заболяването COVID-19

Цитокинова буря, предизвикана от Sars-CoV2, е един от признаците на тежки случаи на заболяването COVID-19 [23]. Беше съобщено, че свръхосвобождаването на TNF е свързано с тежестта и лошата прогноза на пациенти с COVID-19 заболяване [24,25]. В нашето проучване измерването на плазмените нива на TNF показа очаквано увеличение в групите с COVID-19 в сравнение със здрави контроли, потвърдено с допълнително увеличение на тежките проби в сравнение с умерените или леките проби.\

3. Дискусия

Използвани са няколко ненасочени протеомични проучвания за изследване на промяната в пробите от серум/плазма на COVID-19. Броят на идентифицираните протеини от тези проучвания варира поради различните използвани методи. Подходът за количествено определяне без етикети, използващ независим от данните метод за придобиване, показва по-високо покритие на плазмения протеом [26]. За протеомния подход, базиран на етикетиране, базираният на Orbitrap LC-MS/MS метод за количествено определяне на ТМТ показа по-високо покритие на плазмен/серумен протеом с броя на идентифицираните протеини, достигащ 900 [27]. В нашето проучване общият брой идентифицирани протеини беше 176, което е много близо до две публикувани проучвания, които използваха един и същ масов анализатор (TripleTOF), където идентифицираха 179 и 189 протеини [28,29]. Циркулиращите протеини в плазмата на пациенти с COVID-19 представляват прозорец за откриване на прогресия и тежестта на заболяването, както и сигнатурата на възпалението и вродените и адаптивни имунни отговори.

Производството и свръхосвобождаването на провъзпалителни цитокини се считат за ключова точка в изместването на клиничния фенотип от умерен към тежък статус при пациенти с COVID-19. В хода на инфекцията вродените имунни отговори се модулират от молекулярни модели, свързани с увреждане (DAMPs) или молекулярни модели, свързани с патогени (PAMPs) [30]. Протеините на острата фаза (АРР) като фетуин-А се освобождават системно в плазмата, за да поддържат противовъзпалителния процес по време на възпаление. В нашето проучване наблюдаваме ясна низходяща регулация на плазмения фетуин-А в умерени и тежки случаи в сравнение със здрави контроли (фиг. 4). Беше демонстрирано, че фетуин-А може да инхибира ранните (TNF, IL-1, IL-6 и INF) и късните (HMGB1) медиатори, освободени от вродени имунни клетки като макрофаги [31]. Анализът на TNF в нашата кохорта от COVID-19 показва тенденция на повишаване на плазмената концентрация в сравнение със здрави донори, които са по-потенцирани в тежки случаи (допълнителен материал, Фиг. S3). По време на възпаление, активираните моноцити/макрофаги освобождават провъзпалителни цитокини, които се атенюират от повсеместен биогенен амин, наречен спермин [32]. Противовъзпалителните ефекти на спермина обаче зависят от фетуин-А. По този начин сперминът не може да инхибира функцията на клетки с дефицит на моноцит/макрофаг фетуин-А [33]. Освен това, понижаването на нивото на фетуин-А може да бъде свързано със съдови аномалии и тромбоза, открити в изключително тежки случаи поради увеличаване на съдовата калцификация и ендотелна дисфункция [34,35] и оксидативен стрес [36], свързан с нивата на фетуин-А .

След вирусна инфекция клетъчната апоптоза е един от защитните механизми на гостоприемника. Въпреки това, свръхнатрупването на апоптотични клетки поради дефекти в клирънса на апоптотичните клетки е свързано с хипервъзпаление и автоимунитет [37]. Намаляването на плазменото ниво на фетуин-А може да бъде поне отчасти включено в този процес, тъй като увеличава капацитета на фагоцитоза за почистване на апоптотичните клетки от макрофаги [38] и везикули от VSMC [39].

Наскоро беше съобщено, че фетуин-А играе решаваща роля не само като инхибитор на калцификацията, но и като мултизащитен компонент чрез намаляване на фиброзата и възпалението и модулиране на поляризацията на макрофагите [40].

Rudloff и др. демонстрира, че fetuin-A е HIF целеви ген, който има защитна роля при индуцирана от хипоксия бъбречна дисфункция [40]. Fetuin-A намалява калциевото претоварване на макрофагите поради хипоксия. Наскоро демонстрирахме, че SARS-CoV-2 коронавирусният шипов протеин активира -1-подобните макрофаги и повишава вътреклетъчните нива на калций [41]; по този начин fetuin-A може да играе ролята на чистач на калций за регулиране на клетъчната хомеостаза и модулиране на адекватна поляризация за разумни вродени имунни отговори, като по този начин се избягва свръхвъзпаление.

Синдромите на множествена органна дисфункция (MODS) или свързаните с инфекцията MODS се считат за една от основните причини за смърт при тежки случаи на COVID-19 [42]. Хипервъзпалението и имунната дисрегулация по време на инфекция водят до крайно увреждане на органа поради недостатъчност на вродения имунен отговор и хиперцитокинемия. При системна инфекция бактериалните ендотоксини и вирусните РНК се разпознават от вродената имунна система, която задейства експресията и освобождаването на ранни цитокини (TNF и INF). Освен това, вродените имунни отговори на първа линия стимулират производството на късни медиатори, като група 1 с висока мобилност (HMGB1) [43]. Вътре или извънклетъчният HMGB1, експресиран в повечето клетки, е аларма, освободен при стимулация или след смъртта на клетката [44]. Хипер-освобождаването на HMGB1 задейства производството на цитокини като IL-6 [45]. Повишената концентрация на IL-6 се свързва с тежки резултати при мултисистемен възпалителен синдром при деца (MIS-C), свързан с инфекция със SARS-CoV-2 [46]. IL-6 се секретира главно от моноцити/макрофаги, особено когато е поляризиран до M1-подобен фенотип. Беше демонстрирано също, че HMGB1 може да поляризира макрофагите чрез Toll-подобен рецептор (TLR) 4 [47].

Тетранектин (CLEC3B) е един от HMGB1-свързващите протеини и неговото взаимодействие може да модулира биологичната функция и възпалителния процес по време на инфекция. Високо пречистеният TN протеин инхибира дозозависимо LPS-индуцирано освобождаване на HMGB1 в макрофагите [48]. Нарушаването на регулацията на вродената имунна система, водещо до свръхактивиране на имунната система, е често срещано бъдеще на тежките случаи на COVID-19 и сепсиса. Наскоро беше демонстрирано, че концентрацията на витронектин в кръвта е драстично намалена при пациенти с изключително тежък сепсис [48]. Наскоро Yuming Li et al. [49] съобщават за понижена регулация на витронектин при тежки случаи на пациенти с COVID-19, използвайки метода на количествена протеомика без етикет. Ние потвърдихме значителното плазмено намаление на този протеин в нашето изследване (фиг. 4) с различни групи и въз основа на количествения метод на етикета. Следователно витронектин може да се счита за потенциален маркер за вродена имунна дисрегулация, свързана с тежестта на симптомите на COVID-19.

Тетранектин участва в системата за фибринолиза, водеща до контрол на анормалната коагулация; по този начин понижената регулация на TN е свързана със сърдечно-съдови заболявания като коронарна артериална болест (CAD) [50]. Трябва да се отбележи, че много тежки случаи на пациенти, заразени със SARS-COV-2, показват съдова дисфункция, вероятно поради дефицит на TN. Намаляването на серумното ниво на TN е придружено от намаляване на параоксоназа 1 (PON1) при различни сърдечно-съдови заболявания. В нашето проучване понижената регулация на PON1 (фиг. 4) може да бъде маркер за прогресиране на заболяването до тежки симптоми, тъй като се съобщава, че наличието на възпаление и оксидативен стрес е свързано с намаляване на серумния PON1 при сърдечно-съдови заболявания [51] . Освен това, ниското ниво на PON1 може да изостри вродената провъзпалителна реакция към вирусна инфекция, тъй като беше доказано, че PON1 потиска свръхреакцията на макрофагите и поддържа възпалението при атеросклероза [52]. Нарушаването на регулацията на TN оказва влияние върху ефекторите надолу по веригата на AMPK, като HIF1, който регулира фенотипа и функцията на вродените имунни клетки и модулира поляризацията на макрофагите към M1-подобен фенотип, както и съзряването на DC [53,54].

Взети заедно, понижената регулация на витронектин, фетуин-А и PON1, наблюдавана в умерени и тежки случаи, може да бъде свързана с нарушена регулация на вродените имунни отговори чрез дисфункция на моноцити/макрофаги, което води до свръхосвобождаване на цитокини и прогресия на COVID{{4} } заболяване до тежко състояние.

Освен това, нашият протеомичен анализ разкри повишена регулация на APOE (допълнителен материал, фиг. S4) в тежки случаи в сравнение със здрави контроли. Известно е, че плазмените нива на APOE модулират липопротеиновата функция и сърдечно-метаболитните заболявания. Освен това APOE участва във възпалителния процес чрез превключване на поляризацията на макрофагите и повлияване на про-/противовъзпалителните фенотипове [55]. В съгласие с това беше съобщено, че повишаването на нивата на APOE може да бъде свързано с тежестта на COVID-19 [56].

В хода на инфекцията взаимодействието макрофаг-комплементна система е важно за вродените имунни отговори, както и за модулирането на функциите на комплемента и прехода от вродени към адаптивни имунни състояния [57]. Интерактивността на компонентите на комплемента с различни рецептори на макрофагите задвижва възпалителния процес и производството на цитокини. В различни протеомични проучвания се съобщава, че дисрегулацията на каскадата на комплемента [58,59] при пациенти с COVID-19 и че активирането на системата на комплемента засилва Т-клетъчната цитотоксичност в тежки случаи [60]. Докладвахме значително увеличение на комплементи 1q, 5, 6, 7 (допълнителен материал, фиг. S5) при пациенти с умерена и тежка форма на COVID-19. По време на процеса на изчистване на апоптотични клетки, C1q контролира поляризацията на моноцитите/макрофагите и инхибира активността на възпалението [61]. Анализът на обогатяването показа значителна връзка между компонентите на комплемента C1q, C5, C6, C7 и коагулационните каскади, където откриваме и участието на каликреин-кининова система чрез кининоген -1, който модулира вродените имунни реакции чрез брадикининовия път.

Настоящото изследване има ограничение по отношение на размера на извадката. Нашите резултати обаче показаха добро съответствие с предишни протеомични проучвания на covid-19, където идентифицирахме биомаркери, които показват подобна експресия. Това показва, че протеомичният подход, следван в това изследване, е валиден, но може би не е оптимален.

4. Заключение

По време на инфекция със SARS-COV-2 нарушението в имунния отговор е основният проблем, водещ до ескалацията на заболяването COVID-19 до тежки случаи. Механичните пътища, водещи до вродена имунна дисфункция, са ключовите камъни в разрешаването на усложненията, свързани с неконтролирана SARS-CoV-2 инфекция. Доколкото ни е известно, това е първото проучване, използващо подхода iTRAQ върху проби от плазма/серум на COVID-19. Серумните нива на TN, fetuin-A и PON1 са потенциални маркери, замесени поне отчасти във вродената имунна система, по-специално в хиперактивирането на макрофагите, и следователно могат да се считат за потенциални цели за лечение на COVID-19.

5. Материали и методи

5.1. Дизайн на изследването и популация

Кохортите на нашето проучване включват 25 субекта: здрави контролни (n=5) и 20 пациенти, заразени със SARS-COV-2, групирани според тежестта на заболяването (фиг. 1) в леки (n=5) , Умерен (n=5), Тежък (n=5) ​​и Мъртъв (n=5). Групата на мъртвите беше изключена от началото на проучването поради съпътстващи заболявания на субекти, които биха могли да повлияят на специфичността на ефектите на COVID-19. Всички пациенти са били наети в Специализирана детска болница „Крал Абдалах“ (KASCH) и медицински център „Крал Абдулазиз“ (KAMC). Информираното съгласие беше подписано от всички участници, докато те попълваха въпросник относно клиничните симптоми и демографските данни.

Вземане на кръв: 3–5 ml венозна кръв се събират от всеки пациент. Епруветките с EDTA бяха използвани за събиране на кръвни проби; след това плазмата се отделя чрез центрофугиране преди съхранение при 80 ◦C за допълнителен анализ.

5.2. Подготовка на iTRAQ протеомична плазмена проба

Пет биологични проби от всяка група бяха обединени в една проба. След това всички плазмени проби бяха подложени на Agilent Human14 Multiple Affinity Removal Spin касети, за да се отстранят най-разпространените протеини от плазмата, следвайки производствения протокол (Agilent, САЩ). След това разградените протеини бяха маркирани с помощта на 4-plex iTRAQ реагенти (Sciex, Канада), следвайки производствения протокол с незначителни модификации. Накратко, 100 ug протеини се денатурират, редуцират и алкилират, като се използва съответно 8 М урея/100 mM триетиламониев бикарбонат (TEAB), 50 mM Tris (2-карбоксиетил) фосфин (TCEP) и метил метанетиосулфонат (MMTS). След това протеинови проби се усвояват в пептиди с помощта на трипсин в съотношение 1:40 (трипсин към протеин). Впоследствие пептидните проби бяха белязани със 114, 115, 116 и 117 съответно за здрав контрол, тежък, умерен и лек. След това всичките 4 белязани проби бяха смесени и обединени в една проба.

5.3. Фракциониране и обезсоляване на пептиди

Обединената iTRAQ проба беше фракционирана офлайн въз основа на катионен обмен, използвайки въртяща се колона на Pierce Strong Cation Exchange (SCX) (Thermo Scientific, САЩ), следвайки инструкциите на производителя. Накратко, въртящата се колона първо беше кондиционирана с помощта на {{0}}.1 процента мравчена киселина, последвано от зареждане на белязаните пептиди в колоната. Бяха извършени две стъпки на промиване с 0.1 процента мравчена киселина. След това пептидите се елуират в 22 фракции чрез промяна на съотношението на 10 процента ацетонитрил и концентрация на амониев формиат от 15 mM на 900 mM. Впоследствие етапът на обезсоляване и почистване беше извършен от полимерен сорбент с обърната фаза, като се използва Oasis HLB Cartridge (Waters, USA). Накратко, патронът беше кондициониран и уравновесен съответно с ацетонитрил и 0,1 процента мравчена киселина. След това се зареждат белязани пептиди и се прилагат два етапа на промиване с 0,1 процента мравчена киселина. Елуирането на пептидите се извършва при използване на 70 процента ацетонитрил.

5.4. NanoLC-MS/MS

Всяка фракция (общо 22) беше заредена на Ekspert nanoLC 425 (Eksigent, Дъблин, Калифорния, САЩ), свързана с TripleTOF 5600 (Sciex, Concord, Канада) в три екземпляра. Разделянето на пептиди върху NanoLC се извършва, както е описано по-рано [41]. MS1 и MS/MS за iTRAQ анализ бяха зададени както следва: TOF масов диапазон 250–1500 с време на натрупване 0,25 s. Критериите на IDA бяха за йони, по-големи от 400 m/z със състояние на заряд 2–5. Прагът на изобилие надвишава 200 cps. Коригираният CE при проверка на параметъра на iTRAQ реагента. Параметрите на йонния източник бяха зададени както следва: йонен източник газ 1 (GS1), 25; Газова завеса (CUR), 25; IonSpray Voltage Floating (ISVF), 2250; Температура на нагревателя на интерфейса (HIT), 60.

5.5. iTRAQ количествен протеомичен анализ

Суровите MS iTRAQ данни бяха обработени с помощта на софтуер ProteinPilot (v 4.5, Sciex) за идентифициране и количествено определяне. Параметрите бяха зададени, както следва: тип проба, iTRAQ 4plex, Cys, алкилиране, MMTS, храносмилане, трипсин, специални фактори, денатурация на урея, видове, Homo sapiens, база данни, база данни UniProt Proteome Humans (изтеглена на 29 октомври 2019 г.); глобалният FDR беше проверен.

Сгъваемата промяна и p-стойността бяха изчислени въз основа на средната стойност на интензитета на пептида и съответно t-теста на Student. Данните от iTRAQ MS бяха депозирани в ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) с идентификатор PXD037400.

5.6. Биоинформатичен анализ

PCA анализът беше извършен с помощта на функцията "принципал" в R статистически софтуер. VolcaNoseR [62] беше използван за генериране на графиките на вулкана. Онлайн инструментът STRING [63] беше използван за генно обогатяване и анализ на пътя със статистически критерии, определени на p < 0.05. Базата данни на Киото Енциклопедия на гените и геномите (KEGG) беше приложена за анализа на пътя.

5.7. Измерване с ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA).

Пробите бяха приготвени, както е описано по-горе [64], като се използва фактор на туморна некроза (TNF-) и комплект за анализ ELISA (SEKH-0047, Solarbio life sciences). Накратко, 100 ul проби или стандарти се добавят към всяка ямка и след това се инкубират при 37 ◦C за 1 час и 30 минути. След промиване четири пъти с промиващ буфер, биотин-конюгирано антитяло за откриване (100 ul) се добавя преди инкубиране за 1 час при 37 °C. Извършва се втора стъпка на промиване (четири пъти) и се добавя стрептавидин-HRP (100 ul) преди инкубиране за 30 минути. След промиване се добавя субстратен разтвор (TMB) (100 ul) и се инкубира в продължение на 15 минути на тъмно преди добавяне на стоп разтвор и измерването на абсорбцията се открива при 450 nm.

Финансиране

Тази статия е подкрепена от грант от Международен изследователски център на крал Абдула №. RC20/153/R и RC20/205/R и BioBank KAIMRC NGHA.

Етично одобрение и съгласие за участие

Това проучване е одобрено от Институционалния съвет за преглед (IRB) на Комитета по етика на Международния медицински изследователски център на крал Абдула (KAIMRC) с IRB RC20/153/R и RC20/205/R. Беше получено писмено информирано съгласие от всички участници в проучването.

Авторски принос

BA: Замислил и проектирал експериментите и анализирал и интерпретирал данните. FAM, H⋅S, KA и HA: Провеждане на експериментите. FA, HSA и MR: Анализирани и интерпретирани данни. FA, MJ, AH и MB: Допринесоха с реактиви, материали, инструменти за анализ или данни и написаха статията. TB: Замислил и проектирал експериментите и анализирал и интерпретирал данните.

Декларация за наличност на данни

Данните, свързани с това проучване, са депозирани в iTRAQ MS данните са депозирани в ProteomeXchange Consortium с идентификатор PXD037400.

Декларация за интереси

Авторите декларират, че нямат известни конкурентни финансови интереси или лични взаимоотношения, които биха могли да повлияят на работата, докладвана в този документ.

Благодарности

Авторите изразяват благодарността си към изследователите, подкрепящи проекта номер (RSP-2023/17) в университета King Saud, Рияд, Саудитска Арабия.

Препратки

[1] M. Almutlaq, et al., Класическа и контрарегулаторна ренин-ангиотензинова система: потенциални ключови роли в патофизиологията на COVID-19, CJC Open 3 (8) (2021) 1060–1074.

[2] M. Ciccarelli, et al., Ненасочената липидомика разкрива специфични липидни профили при пациенти с COVID-19 с различна тежест от регион Кампания (Италия), J. Pharm. Biomed. анален 217 (2022), 114827.

[3] Q. Zhang, et al., Човешки генетични и имунологични детерминанти на критичната COVID{1}} пневмония, Nature 603 (7902) (2022) 587–598.

[4] TF Aiello, et al., Инфекцията с варианта Omicron на SARS-CoV-2 е свързана с по-леко заболяване при хоспитализирани пациенти с COVID-19, J. Infect. 85 (5) (2022) e152–e154.

[5] CJH von Wintersdorff, et al., Инфекциите с варианта Delta на SARS-CoV-2 показват четирикратно повишено вирусно натоварване в горните дихателни пътища в сравнение с Alpha или не-вариантите, предизвикващи безпокойство, Sci. Rep. 12 (1) (2022), 13922.

[6] JL Schultze, AC Aschenbrenner, COVID-19 и човешката вродена имунна система, Cell 184 (7) (2021) 1671–1692.

[7] AD Lopez-Munoz, et al., Нуклеокапсидният протеин SARS-CoV-2 на клетъчната повърхност модулира вродения и адаптивен имунитет, Sci. адв. 8 (31) (2022) eabp9770.

[8] MS Cardoso, et al., Физическите взаимодействия с бактерии и протозойни паразити установяват чистачния рецептор SSC4D като широкоспектърен рецептор за разпознаване на образи, Front. Immunol. 12 (2021), 760770.

[9] X. Wei, et al., Дефицитът на EDIL3 подобрява неблагоприятното сърдечно ремоделиране чрез поляризация на макрофагите, медиирана от неутрофилни извънклетъчни капани (NET), Cardiovasc. Рез. 118 (9) (2022) 2179–2195.

[10] X. Cao, et al., Spike Protein на SARS-CoV -2 активира макрофагите и допринася за индукция на остри белодробни възпаления при мишки, 2020 bioRxiv.

[11] TE Angel, et al., Протеомика, базирана на масова спектрометрия: съществуващи възможности и бъдещи насоки, Chem. Soc. Rev. 41 (10) (2012) 3912–3928.

[12] T. Wang, et al., Протеомна и метаболомна характеристика на SARS-CoV-2-инфектиран cynomolgus макак на ранен етап, Front. Immunol. 13 (2022), 954121.

[13] X. Nie, et al., Многоорганен протеомен пейзаж на аутопсии на COVID-19, Cell 184 (3) (2021) 775–791 e14.

[14] DE Gordon, et al., Карта на протеиново взаимодействие SARS-CoV-2 разкрива цели за повторно използване на лекарства, Nature 583 (7816) (2020) 459–468.

[15] julian.knight@well.ox.ac.uk, Консорциум CO-M.-oBACEa и CO-M.-oBA, Кръвен атлас на COVID-19 определя отличителните белези на тежестта и специфичността на заболяването, клетка 185 (5) (2022 г.) 916–938 e58.

[16] Y. Mohammed, et al., Надлъжният плазмен протеомичен анализ разкрива нови кандидат биомаркери при остър COVID-19, J. Proteome Res. 21 (4) (2022) 975–992.

[17] Т. М. Casey, et al., Анализ на възпроизводимостта на покритието на протеома и количественото определяне с помощта на маркери за изобарна маса (iTRAQ и TMT), J. Proteome Res. 16 (2) (2017) 384–392.

[18] T. Shu, et al., Плазмената протеомика идентифицира биомаркери и патогенеза на COVID-19, Имунитет 53 (5) (2020) 1108–1122 e5.

[19] GY Chen, G. Nunez, Стерилно възпаление: усещане и реагиране на увреждане, Nat. Rev. Immunol. 10 (12) (2010) 826–837.

[20] CT Esmon, J. Xu, F. Lupu, Вроден имунитет и коагулация, J. Thromb. Хемостаза 9 (Допълнение 1) (2011) 182–188.

[21] J. Park, et al., Задълбоченият анализ на кръвния протеомен профил разкри различни функционални характеристики на плазмените протеини между тежки и леки пациенти с COVID-19, Sci. Представление 10 (1) (2020), 22418.

[22] CB Messner, et al., Свръхвисокопроизводителна клинична протеомика разкрива класификатори на инфекция с COVID-19, Cell Syst 11 (1) (2020) 11–24 e4.

[23] C. Huang, et al., Клинични характеристики на пациенти, заразени с нов коронавирус от 2019 г. в Ухан, Китай, Lancet 395 (10223) (2020) 497–506.

[24] DM Del Valle, et al., Сигнатура на възпалителен цитокин предсказва тежестта и преживяемостта на COVID-19, Nat. Med. 26 (10) (2020) 1636–1643.

[25] FX Danlos, et al., Високи нива на TNF-алфа при пациенти с COVID-19, рефрактерни на тоцилизумаб, Eur. J. Cancer 149 (2021) 102–104.

[26] H. Li, et al., Протеомна и метаболомна характеристика на плазмата на оцелели от COVID-19 6 месеца след изписването, Cell Death Dis. 13 (3) (2022) 235.

[27] B. Shen, et al., Протеомна и метаболомна характеристика на серуми на пациенти с COVID-19, Cell 182 (1) (2020) 59–72 e15.

[28] J. Sarif, et al., Плазмен градиент на разтворим рецептор на плазминогенен активатор от тип урокиназа е свързан с патогенен плазмен протеом и имунен транскриптом и стратифицира резултатите при тежък COVID-19, отпред. Immunol. 12 (2021), 738093.

[29] M. Villar, et al., Характеризиране чрез количествена серумна протеомика на имуносвързани прогностични биомаркери за симптоматика на COVID-19, Front. Immunol. 12 (2021), 730710.

[30] H. Wang, AE Sama, Противовъзпалителна роля на fetuin-A при нараняване и инфекция, Curr. Mol. Med. 12 (5) (2012) 625–633.

[31] W. Li, et al., Чернодробен протеин, фетуин-А, заема защитна роля при летално системно възпаление, PLoS One 6 (2) (2011), e16945.

[32] M. Zhang, H. Wang, KJ Tracey, Регулиране на активирането на макрофагите и възпалението от спермин: нова глава в стара история, Crit. Care Med. 28 (4 Suppl) (2000) N60–N66.

[33] H. Wang, et al., Fetuin защитава плода от TNF, Lancet 350 (9081) (1997) 861–862.

[34] M. Ketteler, et al., Асоциация на ниски концентрации на фетуин-А (AHSG) в серума със сърдечносъдова смъртност при пациенти на диализа: проучване на напречно сечение, Lancet 361 (9360) (2003) 827–833.

[35] K. Caglar, et al., Серумна концентрация на фетуин-а и ендотелна дисфункция при хронично бъбречно заболяване, Nephron Clin. Практ. 108 (3) (2008) c233–c240.

[36] NF El-Malkey, et al., Fetuin-A упражнява защитен ефект срещу експериментално индуцирана чревна исхемия/реперфузия чрез потискане на автофагичната клетъчна смърт, Exp. Biol. Med. (Maywood) 246 (11) (2021) 1307–1317.

[37] IK Poon, et al., Клирънс на апоптотични клетки: основна биология и терапевтичен потенциал, Nat. Rev. Immunol. 14 (3) (2014) 166–180.

[38] HP Jersmann, I. Dransfield, SP Hart, Fetuin/alpha2-HS гликопротеин усилва фагоцитозата на апоптотичните клетки и макропиноцитозата от човешки макрофаги, Clin. Sci. (Lond.) 105 (3) (2003) 273–278.

[39] JL Reynolds, et al., Мултифункционални роли на серумния протеин fetuin-a при инхибирането на калцификацията на човешки съдови гладкомускулни клетки, J. Am. Soc. Нефрол. 16 (10) (2005) 2920–2930.

[40] S. Rudloff, et al., Fetuin-A е HIF мишена, която защитава целостта на тъканите по време на хипоксичен стрес, Nat. Общ. 12 (1) (2021) 549.

[41] T. Barhoumi, et al., SARS-CoV-2 coronavirus spike protein-induced апоптоза, възпалителни и реакции на оксидативен стрес в THP-1-подобни макрофаги: потенциална роля на ангиотензин-конвертиращия ензим инхибитор (периндоприл), Front. Immunol. 12 (2021), 728896.

[42] C. de Roquetaillade, et al., Време и причини за смърт при тежки пациенти с COVID-19, Crit. Грижа 25 (1) (2021) 224.

[43] CS Zhu, et al., Ендогенна регулация и фармакологична модулация на индуцирано от сепсис освобождаване и действие на HMGB1: актуализиран преглед, Клетки 10 (9) (2021).

[44] H. Yang, H. Wang, U. Andersson, Насочване на възпаление, предизвикано от HMGB1, Front. Immunol. 11 (2020) 484.

[45] N. Kamiya, HK Kim, Повишаване на провъзпалителния цитокин HMGB1 в синовиалната течност на пациенти с болест на Legg-calve-perthes и корелация с IL-6, JBMR Plus 5 (2) (2021), e10429.

For more information:1950477648nn@gmail.com