Бързо индуциране на защитен имунитет срещу белодробна чума от Yersinia Pestis Polymeric F1 и LcrV антигени

Резюме:

В скорошно проучване ние демонстрирахме, че ваксинирането с полимерния F1 капсулен антиген на патогена на чумата Yersinia pestis води до бързото индуциране на защитен хуморален имунен отговор чрез основното активиране на вродени подобни на B1b клетки. Обратно, мономерната версия на F1 не успява незабавно да защити ваксинирани животни в този модел на бубонна чума. В това проучване изследвахме способността на F1 да придаде бързо начало на защитен имунитет в по-предизвикателния миши модел на белодробна чума. Ваксинирането с една доза F1, адсорбирана върху алуминиев хидроксид, предизвиква ефективна защита срещу последващо летално интраназално излагане на напълно вирулентен щам Y. pestis в рамките на една седмица. Интересно е, че добавянето на LcrV антиген съкращава времето, необходимо за постигане на такъв бърз защитен имунитет до 4-5 дни след ваксинацията. Както беше установено по-рано, полимерната структура на F1 беше от съществено значение за осигуряване на ускорен защитен отговор, наблюдаван при ваксиниране с LcrV. И накрая, в проучване за дълголетие, единична ваксинация с полимерен F1 индуцира по-висок и по-равномерен хуморален отговор, отколкото подобна ваксинация с мономерен F1. Въпреки това, в тази среда, доминиращият принос на LcrV за дълготраен имунитет срещу смъртоносно белодробно предизвикателство беше повторен.

Съществува тясна връзка между защитните хуморални имунни отговори и имунитета. Защитният хуморален имунен отговор е защитна реакция на организма срещу чужди патогени, в която участват главно антитела. Имунитетът се отнася до способността на тялото да устои на инвазията на чужди патогени. Защитният хуморален имунен отговор може да насърчи убиващия ефект на имунните клетки, да повиши устойчивостта на организма и по този начин да подобри имунитета. В допълнение, защитният хуморален имунен отговор може също да регулира баланса на имунната система, да контролира активността на имунната система и да избягва свръхреакция и появата на автоимунни заболявания. Следователно, защитният хуморален имунен отговор е от съществено значение за поддържане на здравето на тялото и повишаване на имунитета. Освен това много важен е и човешкият имунитет, който може да ни предпази от атака на вируси. Cistanche може да повиши имунитета. Cistanche е богат на различни антиоксидантни вещества, като витамин С, витамин С, каротеноиди и др. Тези съставки могат да поглъщат свободните радикали, да намалят оксидативния стрес и да подобрят устойчивостта на имунната система.

Click cistanche tubulosa ползи

Ключови думи:

ваксинация; белодробна чума; бърза защита; полимер F1; мономер F1; LcrV; модел мишка.

1. Въведение

Грам-отрицателната бактерия Yersinia pestis е етиологичният агент на бубонната и белодробната чума. Стотици милиони са починали поради смъртоносния характер на инфекциите, причинени от този опустошителен патоген в три големи пандемии и в множество локални огнища, регистрирани през последните две хилядолетия [1,2]. Поради високата си инфекциозност и смъртоносност Y. pestis е класифициран като потенциален биотерористичен агент (https://www.cdc.gov/plague/bioterrorism/index.html, достъпен на 9 юли 2021 г.). След откриването и широкото използване на антибиотиците, разпространението и смъртността, причинени от чумата, рязко са намалели [3,4].

Въпреки това антибиотичната терапия срещу чумата има ограничения; за да бъде ефективно, лечението трябва да се приложи скоро след появата на симптомите, които в началото са подобни на тези на обикновена инфекция на горните дихателни пътища и поради това често се диагностицират погрешно. Всяко забавяне на прилагането на антибиотици, специфични за лечение на чума, може да наруши тяхната ефективност и да доведе до значителна смъртност сред лекуваните лица [5]. Неотдавнашното изолиране на вирулентни щамове Y. pestis, резистентни на множество антибиотици, включително тези, препоръчани за терапия, и загрижеността, че такива променени фенотипове могат да бъдат въведени злонамерено във вирулентни щамове за биологична война или биотероризъм, налага разработването на допълнителни мерки за противодействие [6–8] . Наистина, неотдавнашното приложение на антибиотици от втора линия, допълнителни терапевтични модалности и комбинацията от антибиотична и фагова терапия показват обещаващи резултати при миши модел на пневмонична чума [9,10].

Наскоро демонстрирахме, използвайки миши модел на бубонна чума, че прилагането на F1 капсулен антиген на Y. pestis предизвиква защитен имунитет в рамките на дни и следователно може да служи като терапевтична интервенция за предотвратяване на заболяването [11,12]. Това бързо начало на защита включва бързо активиране на вродени B1b клетки, които се намират в перитонеалните и плевралните кухини, което води до производството на циркулиращи анти-F1 IgM и IgG антитела [11,12]. Полимерната структура на F1 е от съществено значение за бързото индуциране на имунитет срещу чума, както се демонстрира от наблюдението, че, противно на полимерния F1, конструираният мономерен кръгъл пермутиран F1 протеин (monoF1) не успява да се асоциира с перитонеални B1b клетки веднага след имунизацията, и съответно, производството на анти-F1 антитела беше забавено [12]. В това проучване, използвайки миши модел на интраназална инфекция с Y. pestis, ние изследвахме способността на F1 антигена да осигури бърз защитен имунитет срещу белодробна чума, която представлява най-тежката проява на заболяването.

Това проучване установява, че както в случая с имунитета срещу бубонна чума, полимерната природа на F1 е от съществено значение за бързия, както и за дълготраен имунитет след ваксинация с единична доза от антигена. Тъй като F1 и LcrV антигените представляват най-вероятните кандидати за ваксини срещу чумна субединица и е показано, че предизвикват бърз защитен имунитет в миши модел на белодробна чума [13], ние разширихме това проучване, като разгледахме възможността за допълнително ускоряване на монтирането на защита срещу белодробна чума чрез комбиниран F1 с LcrV формулировка.

2. Материали и методи

2.1. Етична декларация

Това проучване е проведено в строго съответствие с препоръките за грижа и използване на лабораторни животни на Националния институт по здравеопазване. Всички експерименти с животни са извършени съгласно израелското законодателство и са одобрени от Комитета по етика за експерименти с животни към Израелския институт за биологични изследвания (Номера на разрешителни: IACUC-IIBR M-50-18, IACUC-IIBR M-36-19, IACUC -IIBR M-64-19, IACUC-IIBR M-73-20). След интраназалното провокиране, мишките се наблюдават ежедневно. В нашите проучвания за оцеляване бяха използвани хуманни крайни точки. Мишки, показващи загуба на изправящия рефлекс, бяха евтаназирани чрез цервикална дислокация.

2.2. Животни

Женски мишки C67BL/6 на възраст от шест до осем седмици бяха закупени от Envigo (Йерусалим, Израел). Мъжки и женски CD-1 на подобна възраст са закупени от Charles River (UK).

2.3. Имунизация на животни с пречистени антигени

PolyF1: Полимерният F1 протеин се пречиства от супернатантата на културата на клетки на Е. coli, експресиращи caf1 оперона на щама Y. pestis Kimberley53, както е описано по-рано в [14]. Молекулното тегло на пречистения F1 се определя като по-високо от 1000 kDa чрез хроматография с изключване по размер, като се използва колона Superdex 200 (Cytiva, MA, USA).

MonoF1: ​​Плазмидът pAH34L, кодиращ мономерния F1 (cpCaf1), беше любезно получен от д-р Daniel Peters и проф. Jeremy H. Lakey, Newcastle University, UK [15]. pAH34L беше въведен в Lemo21 (DE3) E. coli, закупен от New England Biolabs (Ipswich, MA, USA). Произволно избрани трансформанти се отглеждат при 37 °C и 220 rpm в бульон Terrific, допълнен с ампицилин (200 µg/mL). Експресията се индуцира в средата на log чрез добавяне на изопропил-тиогалактопиранозид (IPTG; 1 mM) и културите впоследствие се инкубират при 18 °C и 220 rpm за допълнителни 19 часа. Бактериалните пелети бяха претеглени (мокро тегло) и разтворени с реагент за лизис на В клетки CelLytic™ съгласно инструкциите на производителя (Merck-Sigma, Rehovot, Израел).

Рекомбинантният Tol3–cpCaf1 слят протеин се пречиства чрез улеснена течна хроматография под налягане (PFLC) върху HisTrap™ HP колона съгласно указанията на производителя (Cytiva, MA, USA). Tol3 частта се отделя от cpCaf1 чрез разцепване с тромбин (Merck-Sigma, Rehovot, Израел) и реабсорбция на първата върху регенерирана HisTrap™ HP колона. Частта cpCaf1 (monoF1) се събира от фракцията на потока и се диализира екстензивно срещу 1 × PBS. Ендотоксините бяха отстранени чрез метода за разделяне на фазите Triton X-114, както е описано по-рано в [16]. Количеството протеин се измерва с помощта на метода на бицинхониновата киселина (Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Thermo). Чистотата на мономерния F1 се проверява чрез SDS-PAGE, последвано от оцветяване с Coomassie blue и чрез Western blot анализ, използвайки заешки анти-F1 антитела, както е описано по-рано в [11].

LcrV: LcrV кодиращата последователност с пълна дължина от вирулентния щам Y. pestis Kimberley53 беше клонирана в експресионния вектор pGEX (GE Healthcare, Чикаго, Илинойс, САЩ) и въведена в клетки на Е. coli. Установено е, че LcrV кодиращата последователност е идентична с LcrV на щама Y. pestis CO92. Рекомбинантният LcrV се произвежда и пречиства, както е описано от Leary et al. [17]. Ендотоксините бяха отстранени от пречистен LcrV, както е описано по-горе.

Общо 20 до 160 µg полиF1 и LcrV или 80 µg моноF1 бяха адсорбирани върху 2 процента алуминиев хидроксид (AlOH) гел (Brennentag Biosector, Дания) до крайна концентрация от 0,36 процента. Индивидуални мишки се имунизират подкожно, като се използва постоянен обем от 200 uL, приложен в долната част на гърба.

2.4. Характеризиране на серологичния отговор

На мишките се взема кръв от опашката и индивидуалните IgG титри, генерирани срещу F1 и LcrV в серума, се определят чрез ELISA, както беше съобщено по-рано в [11]. Титрите на IgG1 и IgG3 бяха измерени с помощта на изотип-специфични алкални фосфатаза-конюгирани кози анти-миши антитела (Jackson Laboratories, Farmington, CT, USA).

Бронхоалвеоларен лаваж (BAL): Мишките се анестезират с разтвор на кетамин/ксилазин и трахеята се разкрива, като се внимава допълнително да не се причини кървене. Беше направен малък разрез и беше поставена гъвкава канюла {{0}} (BD Neoflon™) и закрепена с хирургически конец. Белите дробове се промиват с 1 × PBS, като се използва спринцовка от 1 mL luer-lock, която е свързана към закрепената канюла. Лаважната течност, която беше замърсена с някакви следи от кръв, беше изхвърлена. Промивната течност се изчиства чрез центрофугиране (400 × g, 4 ◦C) и супернатантата се филтрира стерилно преди ELISA. Концентрациите на анти-F1 и анти-LcrV антитела в BAL течността (BALF) на ваксинирани животни бяха определени с помощта на разредени Mab 57 (F1) и Mab 59 (LcrV), докладвани по-рано в [18] като стандартни криви, включени във всяка {{14} }плоча за изпитване на кладенец. Границите на откриване (LOD) за анти-F1 IgG и анти-LcrV антитела в BALF бяха определени съответно на 0,8 ng/mL и 0,15 ng/mL.

2.5. Инфекция на мишката

Интраназалните (вътрешни) инфекции се извършват, както е описано по-рано в [19]. Накратко, цикъл, пълен с типични Y. pestis Kim53 бактериални колонии, беше събран и разреден в бульон за сърдечна инфузия (HIB, Difco), допълнен с 0.2 процента ксилоза и 2,5 mM CaCl2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, САЩ) до OD660 от 0.{01 и се отглеждат за 22 часа при 28 ◦C и 100 rpm. В края на инкубационния период (OD660 ≈ 4), културата се промива и разрежда във физиологичен разтвор (0,9 процента NaCl) до желаната инфекциозна доза, която се проверява чрез преброяване на образуващи колонии единици след посяване и инкубиране върху BHIA плаки (48 часа при 28 ◦C). Мишките се анестезират със смес от 0,5 процента кетамин HCI и 0,1 процента ксилазин и след това се инфектират интраназално с 35 µL/мишка от бактериалната суспензия. Интраназалната LD50 на щама Kim53 спрямо C57BL/6 мишки е 1100 cfu и 2100 cfu спрямо CD-1 мишки. Стойностите на LD50 се изчисляват съгласно метода, описан от Reed и Muench [20]. Заболеваемостта и смъртността при мишки се наблюдават ежедневно в продължение на 21 дни. В края на този период клирънсът на патогена се проверява чрез посяване на хомогенати от далака от оцелели животни върху BHIA плаки, допълнени с 200 µg/mL стрептомицин (48 часа при 28 °C).

2.6. Характеризиране на миши модел на белодробна чума

Интраназално инфектирани мишки бяха анестезирани в посочената времева точка след експозиция с разтвор на кетамин/ксилазин и хепаринизирана кръв беше изтеглена чрез сърдечна пункция. Впоследствие медиастиналният лимфен възел (mdLN), белите дробове и далака бяха изрязани и намачкани до едноклетъчна суспензия върху 70 µm найлонова мрежа (цедка за клетки, Falcon, Corning, NY, USA) в 1 × PBS . Броят на Y. pestis Kim53 в различните органи и кръв се определя чрез посяване на серийно разредени клетъчни суспензии върху BHIA плаки, допълнени с 200 ug/mL стрептомицин. За хистологичен анализ мишките бяха анестезирани и техните трахеи бяха канюлирани, както е посочено по-горе. Колона (0,7 × 30 cm, KONTES, Сейнт Луис, Мисури, САЩ), пълна с буфериран разтвор на формалдехид (10 процента крайна концентрация) беше свързана към канюлата и белите дробове бяха "надути" само от гравитацията. Напълнените с фиксатор бели дробове се държат в същия буфер в продължение на 14 дни и след това се обработват, за да се образуват вградени в парафин блокове. Срезове от един до три микрометра бяха оцветени със стандартно оцветяване с еозин/хематоксилин (H&E) и с комплект за оцветяване Masson-Goldner (Merck, Rehovot, Израел) за откриване на фиброза. В допълнение, белодробни срезове бяха оцветени за Y. pestis, като се използват вътрешни заешки анти-F1 IgG антитела (1:10, 000) и комплекта Histostain®-SP (ZYMED®, Invitrogen, Waltham, MA, САЩ ). Оцветените срезове се изобразяват с помощта на ICC3 камера, свързана с микроскоп Axioscope A1 (Zeiss, Германия).

2.7. Статистически анализ

Значимостта между титрите, регистрирани при мишки, принадлежащи към повече от две групи, се определя чрез непараметричен Kruskal-Wallis с post hoc тест на Dunn. Тестът за логаритмичен ранг (Mantel-Cox) беше използван за сравнение между кривите на преживяемост, получени в различните ваксинирани групи. Разликите се считат за значими, ако p По-малко или равно на 0.05. Изчисленията бяха извършени с помощта на софтуер GraphPad Prism.

3. Резултати

В предишно проучване ние демонстрирахме, че ваксинирането на мишки с естествената полимерна форма на F1 капсулния антиген на Yersinia pestis води до бързо предизвикване на защита срещу бубонната чума. Съответно се предполага, че прилагането на F1 може да се разглежда не само като профилактична мярка, но и като терапевтична интервенция в спешни случаи, като например огнища, включващи естествено срещащи се или злонамерено създадени резистентни на антибиотици щамове [12]. В този доклад предизвикването на бърза защита беше разпитано в случай на белодробна чума, като се използва добре установен миши модел, състоящ се от излагане на мишки на патогена чрез интраназална инокулация. Показано е, че този модел запазва патогенността, характеризираща респираторните прояви на първична пневмонична чума (допълнителна фигура S1) [10,19,21–24].

3.1. Бърз защитен имунитет, осигурен от F1 и LcrV в миши модел на белодробна чума

Способността на F1 антигена да предизвика бърза защита беше тествана чрез експерименти, при които C57BL/6 мишки бяха ваксинирани чрез еднократно приложение на AlOH-адсорбиран polyF1 (20, 80 и 160 µg/мишка), докато контролните животни бяха инжектирани само с адювантът. Способността на ваксинираните мишки да преживеят смъртоносна интраназална инфекция с вирулентния Y. pestis щам Kim53 (10LD50=11,000 cfu) се оценява три и седем дни след ваксинацията в сравнение с контролни животни (Фигура 1 ). След три дни се наблюдава само умерено удължаване на времето до смърт и оцеляване (с незадоволителна статистическа значимост) (Фигура 1А). Удължаването на времето между ваксинацията и заразяването само с още 4 дни (общо 7 дни) позволи спасяването на всички мишки, ваксинирани с високите дози polyF1 (80 и 160 µg/мишка), както и 87 процента от мишките, ваксинирани с ниска доза polyF1 (Фигура 1B).

Способността на F1 антигена да индуцира бърз защитен имунен отговор срещу белодробната чума ни насърчи да проучим дали имунизацията с допълнителен защитен антиген, LcrV, би подобрила допълнително имунното състояние на животните чрез ускоряване на появата на защитен имунитет. В действителност, когато смъртоносното заразяване с Y. pestis беше извършено 3 дни след комбинираната ваксинация, прилагането на LcrV и polyF1 смесен състав (80 µg или 160 µg от всеки от антигените) успя да спаси 30-50 процента от мишки (Фигура 1C). Най-вече, удължаването на периода между ваксинацията и предизвикването до седем дни осигури пълна защита на всички ваксинирани животни при всички дози от антигените (Фигура 1D). Способността на polyF1 самостоятелно или в комбинация с LcrV да осигури бърз защитен имунитет срещу белодробната чума в рамките на една седмица не беше повлияна от увеличаване на провокационната доза на интраназална експозиция с десет пъти (Фигура 1E), потвърждавайки устойчивостта на защитеното състояние.

3.2. Кинетика на хуморалния отговор след ваксинация с F1 и LcrV

Наблюдението, че комбинираната ваксина LcrV и F1 индуцира бърз защитен имунитет предполага, че хуморален отговор е предизвикан малко след това. За да се разгледа тази възможност и да се определи приносът на хуморалния отговор срещу всеки от антигените за защита срещу Y. pestis, кинетиката на специфичните IgG антитела, генерирани срещу двата отделни антигена, се анализира 5-9 дни след ваксинация с единична доза на C57BL/6 мишки със смесен състав от polyF1 и LcrV (Фигура 2А). Както се очакваше, въз основа на предишни наблюдения, титрите на анти-F1 IgG антитела (GMT=1.35 × 103) вече бяха откриваеми в серумите на всички ваксинирани животни на ден 5 след ваксинацията (Фигура 2B).

Постепенно повишаване на титрите на анти-F1 IgG антитела се наблюдава през следващите дни, достигайки ~60-кратно по-високи нива на ден 9 след ваксинацията (GMT=8.26 × 104, Фигура 2B). Анти-F1 IgG антителата също могат да бъдат открити в белодробната течност, започвайки от ден 7 след ваксинацията, достигайки концентрация до ~1 µg/mL на ден 9 (Фигура 2C). Интересното е, че докато анти-LcrV хуморалният отговор изоставаше в сравнение с този, предизвикан от polyF1 (ден 7 GMT=613, Фигура 2D), по-високо увеличение на нивата на анти-LcrV IgG антитела беше измерено през следващите дни, показвайки общо увеличение от ~160-кратно (GMT=1 × 105, Фигура 2D). Анти-LcrV IgG антитела също могат да бъдат открити в белодробната течност на ваксинирани мишки, започвайки от Ден 8, макар и в по-ниска концентрация в сравнение с нивата на анти-F1 (Фигура 2Е).

Рязкото увеличение на анти-LcrV IgG титрите, наблюдавано на дни 8-9 след ваксинацията, изглежда не включва активиране на вродени B1b клетки, както се предполага от наблюдението, че IgG3 фракцията на тези антитела е под откриваемостта в сравнение с фракцията на анти-F1 IgG3 антитяло ([12] и допълнителна фигура S2). Следователно, данните показват, че LcrV може също да генерира бърз хуморален отговор, осигуряващ, в комбинация с F1, ефективна защита срещу белодробна чума още една седмица след ваксинацията. Освен това, наблюдението, че анти-F1 и анти-LcrV IgG антитела се натрупват в белите дробове на ваксинирани животни предполага, че локалният отговор в белите дробове може да бъде важен за постигане на имунитет срещу пневмонична чума.

3.3. Значението на F1 полимерната структура за бързото начало на защитен имунитет

По-рано сме публикували констатации, силно подкрепящи идеята, че кватернерната полимерна архитектура на F1 е от съществено значение за способността му да индуцира бърза защитна реакция срещу бубонна чума [12]. Следователно в това проучване този въпрос беше разгледан и в случай на защита срещу белодробна чума. Мишките бяха ваксинирани с мономерен или полимерен F1, като и в двата случая се налага съвместно прилагане на LcrV (80 ug от всеки антиген/мишка). Три, четири и пет дни по-късно мишките бяха провокирани интраназално с летална доза Y. pestis Kim53. Данните за оцеляване, изобразени на Фигура 3, показват, че ваксинирането със смес от polyF1 и LcrV предпазва съответно 25 процента, 62,5 процента и 87,5 процента от мишките (Фигура 3А) от смъртоносно заразяване.

Обратно, всички мишки, ваксинирани със сместа monoF1 и LcrV, се поддадоха на инфекцията, с изключение на групата, ваксинирана 5 дни преди заразяването, която показа ниско ниво от 25 процента защита (Фигура 3B). Ваксинирането с несмесени формулировки, състоящи се или от polyF1, monoF1, или LcrV (80 µg/мишка) 4 дни преди заразяването, не предпазва животните. Въпреки това, ваксинирането с polyF1 дава значително забавяне на смъртността в сравнение с всички други експериментални групи (р <0.001; Фигура 3C). Взети заедно, тези резултати ясно показват, че полимерната форма на F1 е от съществено значение за получаване на бърз защитен отговор в комбинация с LcrV.

3.4. Характеризиране на дългосрочния защитен имунитет, предизвикан от еднократна ваксинация с F1 и LcrV

И накрая, ние проверихме дали класическият дългосрочен защитен имунитет срещу пневмонична чума се различава при мишки, ваксинирани с monoF1 или polyF1. Съответно, CD1 мишки бяха ваксинирани веднъж само с monoF1 или polyF1, както и чрез прилагане на състави, които включват комбинация с LcrV. Нивото на специфични антитела в серума на ваксинирани животни се измерва шест месеца по-късно. Данните, изобразени на Фигура 4А, показват, че анти-F1 IgG титрите са по-високи във всички групи, ваксинирани с polyF1, отколкото в тези, ваксинирани с monoF1. Високи и постоянни анти-LcrV IgG титри бяха измерени при всички мишки, ваксинирани с LcrV.

Период от 6 месеца след имунизация (3 дни след вземане на кръв за определяне на титъра), мишките бяха провокирани интраназално с летална доза, състояща се от 100LD50 от Y. pestis Kim53, и преживяемостта беше наблюдавана в продължение на 21 дни (Фигура 5). Мишките, ваксинирани с polyF1 като единичен антиген, бяха само частично защитени, докато всички мишки, които бяха ваксинирани с monoF1, се поддадоха на инфекцията, подобно на контролните наивни мишки (Фигура 5А). Трябва да се отбележи, че анти-F1 IgG титрите, които бяха измерени в серумите на животни, ваксинирани с polyF1-, не показват силна корелация с преживяемостта срещу белодробно предизвикателство (Фигура 5В). Добавянето на LcrV позволява пълна защита за мишките, които са ваксинирани с monoF1, както и за тези, които са ваксинирани с polyF1 (Фигура 5А), което показва, че анти-LcrV отговорът дава възможност за пълно проявление на защитната стойност на анти-F1 отговора. Подобни резултати по отношение на хуморалните отговори и преживяемостта при белодробно предизвикателство са получени при ваксинирани мъжки CD-1 мишки (допълнителна фигура S3), което показва, че изследването не е предубедено от пола на животните (имайте предвид, че първоначалните експерименти са проведени с женски животни) .

Взети заедно, тези резултати показват, че F1 сам по себе си може да предизвика бързо начало на защита срещу белодробна чума, което зависи от неговата естествена полимерна структура. Добавянето на LcrV към polyF1 не само съкращава времето, необходимо за постигане на такава бърза защита, но също така осигурява продължителен и ефикасен защитен имунитет срещу белодробната проява на чума, както беше описано по-горе.

4. Дискусия

Неотдавнашното изолиране на вирулентни щамове Y. pestis, които са резистентни към няколко антибиотици, включително тези, препоръчани за терапия [8,25,26], се дължи на търсенето на допълнителни контрамерки срещу белодробната чума, като ваксини, които предизвикват бърз имунитет, висок обществено здраве и клинично значение. Ваксините като цяло се считат за превантивни мерки срещу инфекциозни заболявания и следователно се доставят на здрави хора години напред. Съответно по-голямата част от предклиничните проучвания, изследващи разработването на ваксина срещу чумата, включват продължителни режими на ваксиниране преди смъртоносно предизвикателство [13, 27–29]. По-рано сме съобщавали, че ваксинирането с естествената полимерна форма на капсулния F1 антиген предизвиква много бърз и мощен В-клетъчно зависим имунен отговор, който защитава животните дори няколко часа след смъртоносно подкожно заразяване с Y. pestis [11,12].

В тези проучвания ние показахме, че една ваксинация с F1 индуцира натрупването на анти-F1 антитела (IgM и IgG) в серума в рамките на няколко дни чрез активиране на вродени B1b клетки. Тази субпопулация от В клетки се намира в перитонеалната кухина на мишки и обикновено генерира серологични отговори срещу непротеинови полимерни антигени, като LPS и полизахариди, които съставят капсулата на много патогени (пневмококи, менингококи и др.) [30]. Тези бързи имунни отговори се характеризират с Т-клетъчна независимост и генериране на IgG3 серотип на мише антитяло. Ние показахме, че всички горепосочени характеристики се отнасят и за бързия защитен отговор, генериран от F1. Освен това, ние показахме, че полимерната природа на F1 е от съществено значение за този бърз имунен отговор, тъй като мономерният F1 (генериран от кръговата пермутация на гена caf1) не успя да активира B1b клетки, изостанали след полимерния F1 в кинетиката на титъра на IgG. не генерират IgG3 серотип и не успяват да осигурят бързо начало на защита. Този бърз отговор е придружен от конвенционалния по-бавен Т-клетъчно зависим адаптивен отговор срещу F1. Следователно, ние предполагаме, че полимерният F1 генерира два серологични отговора, действащи успоредно: единият, който е Т-клетъчно независим чрез B1b клетки, а вторият включва фоликуларни В клетки по Т-клетъчно зависим начин [12].

В този доклад предишното проучване беше разширено чрез разглеждане на способността на F1 антигена да осигури бърз защитен отговор в по-предизвикателния миши модел на пневмонична чума. Ние показваме, че еднократно приложение на AlOH-адсорбиран полимер F1, седем дни преди летално интраназално предизвикателство с вирулентен щам Y. pestis, може да предизвика ефективен защитен отговор (Фигура 1). Това изненадващо наблюдение почти няма прецедент, не само по отношение на скоростта на реакцията, но и по отношение на факта, че способността на F1 антигена да осигури защита в миши модел на белодробна чума рядко се обръща внимание [31]. Наблюдението, докладвано тук, е в съответствие с това, документирано от Derbise и нейните колеги [32] относно откриването на анти-F1 антитела скоро след ваксинацията. Тук показваме, че добавянето на LcrV към polyF1 е не само полезно в дългосрочен план, както се съобщава по-рано [33,34], но също така ускорява защитния имунен отговор срещу Y. pestis интраназално предизвикателство само до няколко дни (Фигури 2 и 5).

Способността за генериране на бърза защита срещу белодробна чума чрез ваксиниране с F1 и LcrV укрепва подобни констатации, докладвани по-рано от Williamson и колеги [13], при които ваксинирането с F1 и LcrV осигурява бърза защита срещу аерозолно предизвикателство с Y. pestis. Рязкото увеличение на титрите на анти-LcrV IgG, наблюдавани на 8-ия и 9-ия ден, показва, че много мощни имунни механизми са активирани от LcrV рано след имунизацията. Липсата на анти-LcrV IgG3 антитела в серума, тяхната различна кинетика и по-ниските нива на анти-LcrV IgG антитела, намерени в белодробната течност, силно предполагат, че дискретни имунни механизми са активирани от F1 и LcrV антигените, и двата от които най-много вероятно е допринесъл за бързото предизвикване на защитния отговор (Фигура 3C).

Подобно на предишните ни наблюдения в модела на мишка с бубонна чума, способността да се индуцира бърз защитен имунен отговор срещу белодробната чума зависи от полимерната структура на F1 антигена (Фигура 3). Това наблюдение предполага, че преобладаващата кандидат-ваксина срещу чумна субединица, която се състои от мономерен F1 и LcrV като слят протеин [35,36], не се очаква да осигури бързо начало на имунитет срещу белодробната чума; това предположение обаче трябва да бъде изследвано експериментално. Серологичният отговор, генериран от LcrV, въпреки че е по-бавен от този на polyF1 (Фигура 2), все още позволява бърз защитен адаптивен отговор, който предотвратява леталния ефект на белодробната чума. Този сравнително бърз серологичен отговор вероятно произтича от способността на LcrV антигена да образува димери или тетрамери в разтвора, както беше установено в предишни проучвания [37,38] и нашите непубликувани данни. В светлината на нашите открития върху ефекта на мултимерната структура на F1 за ускоряване на генерирането на хуморален имунен отговор, рекомбинантното инженерство на LcrV протеина, което позволява мултимеризация в по-голяма степен, може допълнително да ускори отговора. В съответствие с това предположение, заслужава да се отбележи неотдавнашният доклад, който документира, че микрокристалите, съдържащи F1 и LcrV, са по-защитни от подобна ваксина, съставена от тези антигени в разтворима форма [39]. Това наблюдение предполага, че увеличаването на плътността на антигените, което по своята същност се среща в F1 полимера, може да подобри и евентуално да ускори защитните хуморални реакции.

В допълнение към способността си да индуцира бърза индукция на имунитет, в експерименти, насочени към дълголетието на защитното състояние, единичната имунизация с полимерен F1 генерира по-стабилни и еднакви титри на IgG от тези с мономерен F1 (Фигура 4). Въпреки това, ваксинацията само с polyF1 осигурява само частична защита срещу пневмонично заболяване. Трябва да се отбележи, че специфичните анти-F1 IgG титри, измерени в отделни мишки, слабо корелират с тяхната способност да оцелеят при предизвикателството (Фигура 5В). Ваксинирането на мишките с комбинация от всяка форма на F1 заедно с LcrV генерира по-високи нива на защита (Фигура 5). Тези констатации са в съответствие с предишни проучвания, които показват, че ваксинацията с ваксина с убити цели клетки (KWC), която индуцира анти-F1 IgG, но не и анти-LcrV IgG титри, е неефективна за осигуряване на имунитет срещу белодробна чума [13,40] .

Докато в проучването за дълголетие polyF1 осигурява само частичен късен имунитет, този протеин демонстрира способността да защитава напълно мишките малко след ваксинацията, което предполага участието на допълнителни краткотрайни имунни механизми, които допринасят за изчистването на патогена при бързо експерименти за имунитет. Наскоро демонстрирахме, че ваксинацията с атенюирания щам Y. pestis EV76 задейства механизъм за хранителна защита, който отмени механизмите на вирулентност, медиирана от сидерофор, на патогена, конкуриращ се за железни йони, налични в гостоприемника, допринасяйки за бързото начало на имунитет срещу чума [ 41]. Изясняването на поддържащите краткотрайни механизми, които синергизират с анти-F1 хуморалния имунен отговор, може да подпомогне разработването на подобрени ваксини срещу белодробна чума, както и срещу други смъртоносни инфекциозни заболявания.

Допълнителни материали:

Следната подкрепяща информация може да бъде изтеглена от https: //https://www.mdpi.com/article/10.3390/vaccines11030581/s1, Фигура S1: Характеризиране на белодробна чума след интраназална инокулация на Y. pestis Kim53. Фигура S2: Изотипна характеристика на анти-F1 и анти-LcrV антитела в серумите на ваксинирани мишки. Фигура S3: Продължителност на серологичния отговор и оцеляване на мъжки мишки след еднократна ваксинация с мономерен F1 и полимерен F1 самостоятелно или с LcrV.

Авторски принос:

Концептуализация, EM и YL; Подреждане на данни, YL; Формален анализ, YL; Разследване, MA, AT, DG, YV, AZ и YL; Методология, YL; Ресурси, TH и AM; Надзор, ЕМ; Писане - оригинална чернова, EM и YL; Писане—преглед и редактиране, TC, EM и YL Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране:

Това изследване е финансирано от Израелския институт за биологични изследвания, грант номер SB/07.

Изявление на институционалния съвет за преглед:

Не е приложимо.

Изявление за информирано съгласие:

Не е приложимо.

Декларация за наличност на данни:

Данните, представени в това проучване, са достъпни при поискване от съответните автори.

Конфликти на интереси:

Авторите декларират липса на конфликт на интереси.

Препратки

1. Butler, T. Plague и други Yersinia инфекции; Greenough, W., Merigan, TC, Eds.; Plenum Medical Book Company: Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ, 1983 г.

2. Рандреманана, Р.; Андрианайвоариманана, В.; Николай, Б.; Ramasindrazana, B.; Paireau, J.; Тен Бош, QA; Rakotondramanga, JM; Rahajandraibe, S.; Рахелинирина, С.; Ракотоманана, Ф.; и др. Епидемиологични характеристики на епидемия от градска чума в Мадагаскар, август-ноември 2017 г.: Доклад за огнище. Lancet Infect. дис. 2019, 19, 537–545. [CrossRef]

3. Kugeler, KJ; Staples, JE; Hinckley, AF; Gage, KL; Mead, PS Епидемиология на човешката чума в Съединените щати, 1900–2012. Emerg. заразявам. дис. 2015, 21, 16–22. [CrossRef]

4. Kugeler, KJ; Мийд, PS; Кембъл, SB; Нелсън, Калифорния Модели на антимикробно лечение и резултат от заболяване сред пациенти с чума в Съединените щати, 1942–2018 г. Clin. заразявам. дис. 2020, 70, S20–S26. [CrossRef]

5. Годфред-Като, С.; Cooley, KM; Fleck-Derderian, S.; Becksted, HA; Ръсел, З.; Meaney-Delman, D.; Мийд, PS; Нелсън, Калифорния. Лечение на човешката чума: систематичен преглед на публикувани сборни данни за антимикробната ефикасност, 1939–2019 г. Clin. заразявам. дис. 2020, 70, S11–S19. [CrossRef]

6. Галиманд, М.; Guiyoule, A.; Gerbaud, G.; Расоаманана, Б.; Chanteau, S.; Карниел, Е.; Courvalin, P. Мултилекарствена резистентност в Yersinia pestis, медиирана от трансферируем плазмид. Н. англ. J. Med. 1997, 337, 677–680. [CrossRef]

7. Уелч, TJ; Fricke, WF; McDermott, PF; Бяло, DG; Rosso, ML; Раско, DA; Mammel, MK; Епингер, М.; Rosovitz, MJ; Вагнер, Д.; и др. Множествена антимикробна резистентност при чума: възникващ риск за общественото здраве. PLoS ONE 2007, 2, e309. [CrossRef]

8. Lei, C.; Kumar, S. Yersinia pestis антибиотична резистентност: систематичен преглед. Osong Public Health Res. Перспектива. 2022, 13, 24–36. [CrossRef]

9. Зауберман, А.; Гур, Д.; Леви, Y.; Афталион, М.; Vagima, Y.; Тидхар, А.; Читлару, Т.; Mamroud, E. Прилагане след експозиция на Yersinia pestis жива ваксина за потенциране на антибиотично лечение от втора линия срещу пневмонична чума. J. Инфектирайте. дис. 2019, 220, 1147–1151. [CrossRef]

10. Вагима, Й.; Гур, Д.; Афталион, М.; Моисей, С.; Леви, Y.; Маковицки, А.; Холцман, Т.; Орен, З.; Segula, Y.; Фателевич, Е.; и др. Фаговата терапия потенцира втора линия антибиотично лечение срещу пневмонична чума. Вируси 2022, 14, 688. [CrossRef]

11. Леви, Й.; Flashner, Y.; Тидхар, А.; Zauberman, A.; Афталион, М.; Лазар, С.; Гур, Д.; Шаферман, А.; Махмуд, Е. Т клетките играят съществена роля в медиираната от анти-F1 бърза защита срещу бубонна чума. Vaccine 2011, 29, 6866–6873. [CrossRef]

12. Леви, Й.; Vagima, Y.; Тидхар, А.; Афталион, М.; Гур, Д.; Нили, У.; Читлару, Т.; Zauberman, A.; Mahmoud, E. Насочването на капсулния антиген Yersinia pestis F1 от вродени B1b клетки медиира бърз защитен отговор срещу бубонна чума. NPJ ваксини 2018, 3, 52. [CrossRef]

13. Williamson, ED; Stagg, AJ; Eley, SM; Тейлър, Р.; Грийн, М.; Jones, SM; Titball, RW Кинетика на имунния отговор към ваксината (F1 плюс V) в модели на бубонна и белодробна чума. Vaccine 2007, 25, 1142–1148. [CrossRef]

14. Холцман, Т.; Леви, Y.; Маркъс, Д.; Flashner, Y.; Mamroud, E.; Коен, С.; Fass, R. Производство и пречистване на олигомери с високо молекулно тегло на Yersinia pestis F1 капсулен антиген, освободен от култура с висока клетъчна плътност на рекомбинантни клетки на Escherichia coli, носещи оперона caf1. Microb. Cell Factories 2006, 5, P98. [CrossRef]

15. Chalton, DA; Musson, JA; Flick-Smith, H.; Walker, N.; Макгрегър, А.; Lamb, HK; Williamson, ED; Милър, Дж.; Робинсън, JH; Lakey, JH Имуногенност на антиген на Yersinia pestis ваксина, мономеризиран чрез кръгова пермутация. заразявам. имунна. 2006, 74, 6624–6631. [CrossRef]

16. Печ, Д.; Anspach, FB Отстраняване на ендотоксин от протеинови разтвори. J. Biotechnol. 2000, 76, 97–119. [CrossRef]

17. Лиъри, SE; Williamson, ED; Griffin, KF; Ръсел, П.; Eley, SM; Titball, RW Активна имунизация с рекомбинантен V антиген от Yersinia pestis предпазва мишките от чума. заразявам. имунна. 1995, 63, 2854–2858. [CrossRef]

18. Mechaly, A.; Vitner, EB; Леви, Y.; Гур, Д.; Барлев-Грос, М.; Sittner, A.; Корен, М.; Леви, Х.; Махмуд, Е.; Fisher, M. Епитопно комбиниране на нови моноклонални анти F1 и анти LcrV антитела и тяхното приложение в прост, кратък HTRF тест за клинично откриване на чума. Патогени 2021, 10, 285. [CrossRef]

19. Тидхар, А.; Flashner, Y.; Коен, С.; Леви, Y.; Zauberman, A.; Гур, Д.; Афталион, М.; Елханани, Е.; Цви, А.; Шаферман, А.; и др. Липопротеинът NlpD е нов фактор на вирулентност на Yersinia pestis, който е от съществено значение за развитието на чума. PLoS ONE 2009, 4, e7023. [CrossRef]

20. Рийд, LJ; Muench, H. Прост метод за оценка на петдесет процента крайни точки12. Am. J. Epidemiol. 1938, 27, 493–497. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com