Микро при лептоспироза Бъбречно заболяване Ⅱ

4. Имунитетни отговори на гостоприемника към Leptospira spp.

Основният път на Leptospira е директното проникване през лигавиците или отворената кожа чрез кръв, тъкани, урина или замърсена вода, което се разпространява в системното кръвообращение и се разпространява в няколко органа, каточерен дроб, белия дроб и проксималния тубул нанефрон в бъбреците, където може да се размножи и да оцелее един месец [51]. В началната фаза на инфекцията,вроден имунен отговориграе основна роля като първа защитна линия при лептоспироза, засягайки реакцията нарецептори за разпознаване на образи, макрофагална фагоцитоза, индуциране на извънклетъчнанатрупване на неутрофили, инамеса на системата на комплемента [52].

Theимунен отговорпри хората играе съществена роля вразвитие на клинични признаци, както и вирулентните фактори на някои патогенни щамове. Повечето човешки лептоспирози са асимптоматични или леки и само 10% от случаите развиват тежки форми с полиорганна недостатъчност и повишена смъртност, свързана сцитокинова буряи състояние на имунопарализа. Патогенните видове стимулират хуморален отговор във фазата на бактериемия, въпреки че последващото поведение наимунен отговоре неясно. В проучвания на пациенти с множество клинични прояви на лептоспироза, тежестта на клиничната картина е свързана с различни серумни нива на цитокини, като TNF-, IL-10 и IL-6 [53], но това заключение остава спорно [54]. Тези условия са довели до повишен интерес към разбирането на имунния отговор като цяло и биологичните събития, които се случват по време на инфекция.

КОЛКО ВРЕМЕ НЕОБХОДИМО НА CISTANCHE ЗА РАБОТА?

4.1. Leptospira и системата на комплемента

Протеолитичната активност на лептоспиралните протеази срещу извънклетъчния матрикс позволява на инфекцията да навлезе в циркулационния поток. Системата на комплемента в кръвоносната система е един от основните механизми на вродения имунен отговор към патогенните Leptospira. Въпреки това, Leptospira е разработила стратегии за избягване на атаката на комплементната система чрез свързване на протеини с комплементни молекули и производство на протеази, като термолизин, термостабилен неутрален металопротеиназен ензим, който засяга С3 протеиновата верига. Патогенните щамове свързват фактор H (FH), протеин 1, свързан с фактор H на комплемента (FHR-1), фактор-H-подобен протеин 1 (FHL-1) и C4b свързващ протеин (C4BP), всички от които са отговорни за инхибирането на системата на комплемента [55]. Има три основни стратегии за укриване на комплемента от патогенни Leptospira [55,56] чрез намесата на регулаторите на комплемента на гостоприемника, протеазата на гостоприемника и бактериалната протеаза. За регулатори на комплемента Leptospira използва фактор Н (FH; регулатор на алтернативен път на комплемента) и С4 свързващ протеин (C4BP; регулатор на класически и лектин комплементни пътища), за да ускори разпадането на C3 конвертазите и също така да действа като кофактори за фактор I за разцепването на C3b и C4b [57,58]. Лептоспиралният протеин (LcpA), заедно с витронектин (Vn; терминален регулатор на пътя) свързва C9 и инхибира неговата полимеризация [59], като по този начин потенциално блокира образуването на мембранно-активиращ комплекс (MAC) [60]. В допълнение, патогенната Leptospira свързва няколко протеази на гостоприемника, като плазминогенен активатор от тип урокиназа (uPA), които индуцират активен плазмин [61] (серинова протеаза) за смилане на C3b, C4b и C5 на повърхността на Leptospira [62]. Освен това, металопротеазите и термолизинът, ендогенната протеаза на Leptospira, могат да разцепват и инактивират няколко комплементни протеини (C2, C3, C4 и фактор B) [60]. Комбинацията от регулатори на комплемента, от гостоприемника и патогенната Leptospira, улеснява бактериалната колонизация в целевите органи на гостоприемника [63].

4.2. Лептоспири и неутрофили

По време на инфекцията патогенните видове Leptospira предизвикват силно активиране на неутрофилите и провъзпалителен отговор. Неутрофилите са важни за контрола на микроорганизмите, но също така допринасят за увреждане на тъканите в гостоприемника. Доказано е, че ниските нива на извънклетъчно натрупване на неутрофили поради ниската неутрофилна активност в кръвообращението увеличават лептоспиремията, което показва, че вътресъдовото образуване на набиране на неутрофили може да бъде критично за предотвратяване на ранното разпространение на патогенни Leptospira [64].

4.3. Лептоспири и макрофаги

В началната фаза на инфекцията с Leptospira, макрофагите играят важна роля в елиминирането на спирохетите. Този ефекторен механизъм заедно с ефективния цитокинов отговор е свързан с фагоцитния контрол и разпространението на инфекцията, въпреки че Leptospira spp. доказано е, че индуцира апоптоза в макрофагите чрез пътя на Fas/FasL-caspase-8/-3 и улеснява тяхното оцеляване и пролиферация в гостоприемника поради освобождаването на индуциращ митохондриален фактор апоптоза и ендонуклеаза в заразените макрофаги [65]. Скорошни изследвания са проведени върху микро-транскриптома на макрофаги, заразени с Leptospira, за да се определят епигенетичните механизми, като пост-транскрипционна регулация от РНК. Макрофагите, заразени с Leptospira, са показали, че микроРНК (miPHK) се регулират от инфекция със спирохета, демонстрирайки, че тази регулация е жизненоважна в отговора на тези клетки на имунната система при инфекция с Leptospira [66]. В човешките макрофаги активирането на възпалението, медиирано от реактивни кислородни видове и лизозомален катепсин B, генериран от инфекция с Leptospira, има значителни нива на NLRP3 и IL-18, благоприятстващи производството на IL-1 и водещи до високо възможността за фагоцитоза и бързото моделиране на някои цитокини, свързани с резистентността към лептоспироза [67].

4.4. Хуморален отговор на Leptospira

Специфичният хуморален отговор срещу Leptospira се характеризира с производството на IgM и IgG антитела на третия ден от появата на симптомите. Освен това се съобщава за производство на IgA от първия ден до деветия месец след инфекцията; всъщност повишаването на IgM се използва като алтернативна мярка при ранната диагностика на лептоспироза [68]. Ефектът на хуморалния отговор при хора с лептоспироза позволява да се направи серологична диагноза след естествена инфекция [69]. Най-важният аспект на хуморалния отговор при инфекция с Leptospira може да бъде образуването на защитни антитела. Наличните понастоящем ваксини за лептоспироза са съставени от пълни клетъчни препарати и имат ограничения, като ниска ефикасност, множество странични ефекти, слабо генериране на имунна памет и липса на кръстосана защита за разликите в серовара. По този начин разработването на нови ваксини е необходимо за контрол на болестта и в момента се провеждат изследвания за производство на ваксини от генетична имунизация [70]. OMPs на Leptospira се считат за антиген с по-добра имуногенност за В-лимфоцити, които включват структурните епитопи OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} и LipL41263-282 [71]. Тези епитопи са обещаващи кандидати за разработването на универсална ваксина.

4.5. Адаптивен имунен отговор към Leptospira: Т-клетки и цитокини

Патогенните видове Leptospira индуцират имунен отговор, медииран от Т и В лимфоцити, придружен от експресията на цитокини, които могат да бъдат свързани с гравитационни диаграми. Активирането на Т клетки по време на инфекция с Leptospira инициира възпалителния отговор, главно чрез производството на цитокини. Това е критично за ранното елиминиране на инфекцията, но неконтролираното производство на провъзпалителни цитокини може също да доведе до свръхпроизводство на цитокини, последвано от състояние на имунопарализа, което може да доведе до сепсис и мултиорганна недостатъчност. Т-лимфоцитите произвеждат IL-1, IL-6, IL-12, интерферон (IFN)- и TNF-, които функционират като хемоатрактанти за набиране на левкоцити на мястото на инфекцията. Интересно е, че in ex vivo, наивните δ Т клетки пролиферират в култури от периферни кръвни мононуклеарни клетки (PBMCs), стимулирани с антигени на Leptospira, заедно с производството както на IL-17, така и на IFN [72]. Освен това, докато инфектираните с лептоспироза мишки от див тип демонстрират по-високи нива на изобилие от цитокини, включително IL-4, IL-10 и IL-13 в сравнение с неинфектирани мишки, индуцираната от Leptospira миша хронична нефрит (Daf1-/- мишки) показва по-висока експресия на гладкомускулен актин, IL-10, IL-13, но няма разлика между IL-12 и IL{{21} } нива [73]. Като такива, Daf1 и IL-17 могат да играят решаваща протективна роля в прогресията на ХБН като връзка между индуцираната от Leptospira миша ХБН с бъбречна фиброза [72,73]. Въпреки това, хипотезата за избран цитокинов отговор при прогресия на заболяването все още е неубедителна при човешката лептоспироза досега. При пациенти с тежка лептоспироза и белодробно засягане са получени повишени нива на IL-6, CXCL8 и IL-10 в сравнение с пациенти с лека лептоспироза [53]. Тези високи концентрации на цитокини при пациенти с лептоспироза подчертават ключовата им роля в развитието на тежка лептоспироза.

При пациенти с тежка инфекция се откриват CD4+ Т лимфоцити с провъзпалителен профил и продуценти на IL-2 и IFN-, докато CD4+ CD25 продуцират високо на IL-10 почти липсват. Регулирането на Т-лимфоцит-медиирания имунен отговор изглежда не предотвратява увреждането на тъканите, причинено от възпалителния отговор към Leptospira. В CD4+ T лимфоцитите на хора с тежка лептоспироза производството на TNF- и други провъзпалителни цитокини е по-високо, отколкото при тези с лека форма на заболяването, което показва, че тези цитокини могат да се използват като маркери на тежест в имунологичната фаза на инфекцията [74]. Производството на IL-10 е свързано с риска от смърт при хора с лептоспироза; въпреки това, проучване, проведено върху експонирани и асимптоматични хора, свързва производството на този цитокин с контрола на възпалителния отговор и оцеляването [74]. По време на инфекция с Leptospira възпалителните медиатори и действието на някои левкоцитни клетки, като Т-лимфоцити, се регулират бързо при резистентни индивиди, за разлика от това, което се случва при индивиди с тежки форми на лептоспироза [75].

За да обобщим, имунният отговор към инфекция с Leptospira не е напълно разбран поради клиничното поведение на пациенти с лептоспироза, които взаимодействат с различните вирулентни фактори на бактериалния геном, което дава на Leptospira солиден патогенен капацитет.

5. Клинични прояви

Клиничните прояви на лептоспирозата са разнообразни, вариращи от леки, неспецифични симптоми, като грипоподобни симптоми (треска, миалгия и главоболие), до тежки симптоми заедно с краен стадий на органни увреждания (напр. AKI, остра чернодробна недостатъчност и кървяща диатеза, известна още като синдром на Weil), остра хемоптиза от белодробен кръвоизлив, остра объркване от асептичен менингоенцефалит и остра сърдечна недостатъчност от остър или подостър миокардит [7]. Съответно, трите индикатора за подозирана инфекция с лептоспироза се състоят от (i)остро фебрилно заболяване, (ii) жълтеница и (iii)остра бъбречна травма[12]. Предикторите за тежка форма на лептоспироза са тежка миалгия в началото, силна склонност към кървене и изразена жълтеница. Интересното е, че наличието на едно от двете вече съществуващихронично бъбречно заболяване(малък размер на бъбрека) или уголемени, претоварени бъбреци с анурия са свързани с най-лошия изход [12]. Поради това пациентите с бъбречно заболяване, свързано с лептоспироза, трябва да бъдат лекувани незабавно.

6. Диагноза

6.1. Клинична диагноза

Диагнозата лептоспироза се основава на историята на експозицията, рисковите фактори и клиничните прояви. Високият индекс на подозрение може да заобиколи по-късно увреждане на органи. Симптомите на лептоспироза обаче често се бъркат с други причини за остър фебрилен синдром, като инфекция на денга, малария, хепатит и активно автоимунно заболяване. Липсата на патогномонични признаци на лептоспироза означава, че диагнозата се основава условно на оценката на треска и миалгия при пациенти от ендемична област. Поради тази причина лабораторната диагностика на лептоспирозата е от съществено значение.

6.2. Лабораторна диагностика

Лептоспирозата е трудна за лабораторно диагностициране, особено по време на острата фаза. Може да се извърши чрез директно идентифициране на спирохети или техни компоненти в телесни течности или тъкани, изолиране на лептоспири в култура или откриване на определени антитела в различни клинични фази. Лептоспирозата е трудна за разграничаване от болести като малария, треска от денга, рикетсия, грип, хепатит и жълта треска поради неясна клинична изява. В резултат на това са необходими лабораторни тестове за потвърждаване на диагнозата. Откриването на антитела срещу лептоспири, самите лептоспири или тяхната дезоксирибонуклеинова киселина е основата за тези тестове (ДНК). Текущата лабораторна диагностика включва както директна идентификация (откриване на спирохети на Leptospira или ДНК в пробите или изолиране на организма от проби), така и индиректно откриване (серологична диагноза или серология за идентифициране на лептоспирална инфекция, която се основава на откриване на специфични антитела срещу различни Лептоспирални антигени) (Таблица 1).

6.2.1. Директно микроскопско изследване, култура и откриване на антиген

Лептоспирите са тънки, ярки, активно подвижни спирали с характерно бързо въртене (потрепваща подвижност) под конвенционалния микроскоп с тъмно поле (DFM) и приблизително 10 лептоспири/mL са необходими за откриване на една клетка на поле. При една седмица по-голяма продължителност на инфекцията има приблизително 10% починали в добива на DFM (от 100 до 90%). За повишаване на чувствителността, няколко специални метода за оцветяване; Warthin–Starry silver оцветяване [76] и имунооцветяване (имунохистохимия, имунофлуоресценция, имуномагнитно улавяне на антиген и имунопероксидазно оцветяване [77]), които изискват първични антитела, специфични за серовар (в изолация или комбинация).

Таблица 1. Лабораторни изследвания за диагностика на лептоспироза.

LAMP, изотермично усилване, медиирано от веригата; PCR, полимеразна верижна реакция; NGS, секвениране от следващо поколение; IHA, индиректна хемаглутинация; ELISA, ензимно-свързан имуносорбентен анализ; IgM, имуноглобулин М; MAT, тест за макроскопска аглутинация; MCAT, микрокапсулен аглутинационен тест; ДНК, дезоксирибонуклеинова киселина; DFM, микроскопия в тъмно поле

Успоредно с това, посявката на Leptospira от кръв, урина, цереброспинална течност и биопсична тъкан е възможна през първите няколко дни до 10 дни след появата на симптомите на заболяването (стадий на лептоспироза). Тъй като те растат бавно (6–8 часа време за удвояване), придирчиви и склонни към замърсяване, пробите от култури трябва да се съхраняват поне 3–4 месеца, преди да бъдат изхвърлени като отрицателни) само с 23% чувствителност, но е необходимо за теста за лекарствена чувствителност [6]. Като такава, EMJH (Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris) среда (олеинов албумин комплекс) се състои от говежди серумен албумин (фракция V), Tween 80, амониев хлорид тиамин, монокалиев фосфат, динатриев фосфат и различни хранителни вещества [78] е най- обикновено се използва, докато по-специализираната среда T80/40/LH (полисорбат 40, лакталбумин хидролизат, супероксид дисмутаза и заешки серум) е необходима за някои серовари [79]. За първичната изолация на големия и разнообразен набор от придирчиви патогенни лептоспири, Hornsby–Alt–Nally (HAN) изглежда добра среда [80].

Откриването на лептоспирални антигени чрез имунопероксидаза, имунофлуоресценция или имуномагнитна система за улавяне на антиген е разработена за проби с ниско бактериално натоварване или микроскопия в тъмно поле не може да се използва, но не се извършва рутинно поради ограничението на първичното антитяло [77]. Обратно, разпознаване на нуклеинова киселина с нова ДНК амплификация; полимеразната верижна реакция (PCR) (т.е. вложена PCR, количествена PCR [qPCR]), медиираната с бримка изотермична амплификация (LAMP) и секвенирането от следващо поколение (NGS) са ценни за ранна и точна лабораторна диагностика, особено с Изолиране на Leptospira чрез инокулация на биологична среда и ДНК хибридизация (ДНК сонда) [81,82]. Разнообразие от лептоспирални цели (като 16S рибозомна РНК) или ДНК могат да бъдат амплифицирани за диагностика [83] и PCR в реално време (RT-PCR) е по-чувствителен и специфичен от стандартния PCR [84]. Тъй като някои RT-PCR праймери могат да се свържат с неспецифично място, което води до фалшиво положителни резултати, най-новите мултиплексни PCR анализи в реално време са разработени с помощта на два комплекта праймери [85]. Вложената PCR също помага при откриването на по-специфични и чувствителни ДНК сайтове с допълнителни набори от праймери [86,87]. Въпреки това, настоящите тенденции за диагностика на лептоспироза са използването както на серологични, така и на молекулярни техники, като PCR и ELISA (по-лесно от златния стандарт серологичен MAT), за страни с ограничени ресурси [88,89]. В допълнение, техниката LAMP [90] за откриване на 16S rRNA ген (rrs) е рентабилен, бърз и високоефективен метод за откриване на патогенните лептоспири в урината. Понастоящем NGS е най-прецизно базираният независим от културата метод за анализ на основния геном в телесни течности (кръв и урина) [91] и бъдещата посока на тестовете за лептоспироза би била да се придвижат към молекулярната класификация на лептоспирите, която преодолява ограничението на културална изолация на лептоспири от клинични проби. Следователно стойността на PCR в клиничната диагностика на лептоспирозата е особено добра и се появяват няколко съвременни техники

6.2.2. Откриване на антитела срещу Leptospira

Използват се няколко серологични диагнози; например специфични за рода тестове за антитела (индиректна хемаглутинация [IHA], ензимно-свързан имуносорбентен анализ [ELISA], Lepto Dri Dot [латексна аглутинация], микрокапсулна аглутинация [MCAT]) и тестове за специфични за серовар антитела (микроскопски тест за аглутинация [ MAT]) [92,93]. Като такива, MAT критериите за диагностициране са (i) четирикратно повишаване на титъра в сдвоени серуми (сероконверсия на текущата инфекция) или (ii) единичен висок титър (по-голям или равен на 1:400 или 1:800, по-висок при епидемия области) (серопозитивност) (антителата могат да персистират известно време след инфекцията или кръстосана реакция с други заболявания). Освен това MAT изисква жив панел от всички серовари на Leptospira в региона, с панел от локално стандартизирани серовари [93,94], следващ Световната организация за здравеопазване на животните (19 антигена, представителни за 15 серогрупи) [95]. Тъй като антителата се откриват 5-7 дни след инфекцията, MAT тестът може да бъде отрицателен (титър < 1:50) през първите няколко дни от инфекцията. Диагнозата на лептоспирозата може да бъде извършена чрез проби от урина [96], като се използват както серология, така и молекулярно откриване (16S rRNA), особено при пациенти със скорошна инфекция (MAT по-голям от или равен на 1:800 или ELISA IgM-положителен или и двете) [97] .

С ограничени ресурси резултатът от клиничната прогноза [98] въз основа на съответната клинична история и свързани лабораторни тестове с точкуване в седем аспекта е както следва: хипотония (3), жълтеница (2), мускулна болка (2), AKI (1,5) , нисък хемоглобин (3), хипокалиемия с хипонатремия (3) и неутрофилия (1) се предлага (граничен обобщен резултат от 4 има площта под кривата на работната характеристика на приемника {{10}}).78 ( 95% CI 0.68–0.89) за диагноза лептоспироза [77]). Този вероятностен резултат Thai-Lepto при приемане може да бъде диагностичен инструмент за ранна предполагаема диагноза на лептоспироза при пациенти с тежко клинично подозрение за заболяването.