joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

IL-22-медиирано бъбречно метаболитно препрограмиране чрез PFKFB3 за лечение на бъбречно увреждане

Wei Chen и др

Графичен абстракт

IL-22 отслабвабъбрекнараняванечрез метаболитно препрограмиране на бъбречни TECs, регулира митохондриалната функция и гликолизата в увредените TECs и облекчава натрупването на митохондриални ROS и дисфункционални митохондрии чрез индуциране на AMPK/AKT и PFBFK3 активности. Подобряващобъбрекнараняванена IL-22 чрез регулиране на метаболизма, релевантното сигнализиране е сертифицирано при животински модели на индуцирано от цисплатин бъбречно увреждане и диабетна нефропатия.

Резюме

Увреждането на бъбреците инициира влошаващите се метаболитни състояния в тубулните клетки, които водят до развитие на краен стадий на бъбречно заболяване (ESTD). Интерлевкин-22 (IL- 22) е ефективен терапевтичен антидот забъбрекнараняванечрез насърчаване на възстановяването на бъбреците, но малко се знае за основните молекулярни механизми. Тук първо предоставяме доказателства, че IL-22 отслабвабъбрекнараняванечрез метаболитно препрограмиране на бъбречни тубулни епителни клетки (TECs). По-конкретно, нашите данни предполагат, че IL-22 регулира митохондриалната функция и гликолизата в увредени TEC. Допълнителни наблюдения показват, че IL-22 облекчава натрупването на митохондриални реактивни кислородни видове (ROS) и дисфункционални митохондрии чрез индуциране на AMPK/AKT сигнализиране и PFBFK3 активности. При мишки, подобряване набъбрекнараняванеи некроза и подобряване на бъбречните функции чрез регулиране на тези релевантни за метаболизма сигнали и митохондриална годност на рекомбинантния IL-22 са сертифицирани при животински модели на индуцирано от цисплатин бъбречно увреждане и диабетна нефропатия (DN). Взети заедно, нашите открития разкриват нови механични прозрения за защитните ефекти на IL-22 върху бъбреците и подчертават терапевтичните възможности на IL-22 и участващите метаболитни регулатори при различни бъбречни заболявания.

КЛЮЧОВИ ДУМИинтерлевкин-22,бъбрекнараняване, метаболитно препрограмиране, митохондриална дисфункция

Цистанчеtubulosaпредотвратява бъбречно заболяване, щракнете тук, за да получите пробата

1. ВЪВЕДЕНИЕ

остърбъбрекнараняване(AKI), често срещан проблем за общественото здраве, свързан с висока смъртност и заболеваемост, засяга милиони хоспитализирани пациенти по света и показва бързо нарастваща честота.1–3 Основната патофизиология на AKI не е напълно разбрана, но включва увреждане и апоптоза на бъбречната тубулни епителни клетки (TECs), особено в проксималните тубули.4-7 Множество видове литература подкрепят, че тяхното тежко и продължително увреждане често причинява непълно и неадаптивно възстановяване на тъканите, което води до възпалителен отговор, тубулна дегенерация, бъбречна фиброза и евентуална прогресия до краен стадий на бъбречно заболяване (ESTD).8–10 За съжаление, освен базираната на диализа поддържаща грижа, няма добре установени терапевтични средства забъбрекнараняванеса налични. Следователно, проактивното лечение е много необходимо, за да се намалят страданията, които то причинява на пациентите, и значителната финансова тежестбъбрекнараняванена индивидите и обществото.

Интерлевкин-22 (IL-22), важен член на семейството на цитокините IL-10, наскоро привлече огромно внимание като средство за оцеляване при многобройни разстройства, причинени от увреждане на епитела.11–13 IL -22 предизвиква тъканна защита и хомеостаза предимно чрез активиране на STAT3 сигналния път и насърчаване на епителна пролиферация.14,15 Важно е, че проучванията показват, че експресията на IL-22R1 е ограничена до бъбречните проксимални TECs , и лечението с IL-22 може да предпази от увреждане на бъбречния епител и да ускори тубулната регенерация.16,17 Въпреки това, въпреки че натрупването на доказателства показва, че IL- 22 е ефективен терапевтичен антидот забъбрекнараняване, малко се знае за основните механизми на IL- 22-индуцираното възстановяване на TEC. Разбирането на молекулярната основа на IL-22 е важно както за изследване как IL-22 действа за инхибиране на AKI или ESTD, така и за откриване на молекулярни модификатори, както и за решаващи процеси, включени в предотвратяването на увреждане на бъбреците.

Възстановяването на бъбреците след увреждането е метаболитно зависим и сложен процес.18 Последните доказателства показват, че клетъчните метаболитни сигнатури могат да регулират оцеляването и пластичността на бъбречните клетки и по този начин да осигурят полезна механистична представа за това как метаболитните процеси контролират възстановяването на тъканите.19,20 По-конкретно, тези открития показват, че метаболитното препрограмиране от PGC1 или S-нитрозо-CoA редуктазната система предпазва отбъбрекнараняване. Механично повишената гликолиза и окислителното фосфорилиране (OXPHOS) може да насърчи растежа и защитните сигнални пътища или може да осигури по-високите енергийни нужди на митозата и анаболния биосинтез по време на възстановяването на органи.19,21 Наскоро нашите проучвания показаха, че IL-22 облекчава митохондриална дисфункция в черния дроб, която включва клетъчните метаболитни процеси.22,24 По този начин ние питаме дали IL-22 предпазва от увреждане на бъбреците и апоптоза чрез регулиране на техните метаболитни състояния. За да определим механизмите на IL-22 медиирано възстановяване на бъбреците, ние третираме човешки проксимални тубулни епителни клетки (PTECs) със стрес стимулация. Ние предполагаме, че IL-22 задвижва метаболитно препрограмиране за подобряване на гликолизата и OXPHOS, които предотвратяват дисфункцията на TEC. Освен това демонстрираме, че IL-22 индуцира тази програма чрез активиране на AMPK/AKT сигнализиране и неговите молекулярни модификатори за облекчаване на митохондриалната дисфункция. Нашите наблюдения хвърлят светлина върху регулирането на метаболитните състояния за лечение и профилактика на бъбречни заболявания и предоставят нови прозрения за разработване на ефективни нови интервенции за увреждане на органи като цяло.

Cistanche може да лекувабъбрекнараняване

2. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

2.1 Реактиви

Олигомицин, ротенон и цианид р-трифлуорометокси фенил-хидразон (FCCP) са получени от Sea horse Biosciences; рекомбинантен IL-22 е предоставен от Novoprotein (Китай); цисплатин (Crisp.), MitoTrackerGreen, LY294002, 5,5',6,6'-тетрахлоро-1,1',3,3'-тетраетилбензимидазолилкарбоцианинйодид (JC-1) и съединение С са получени от Beyotime Biotechnology (Китай); антитела, насочени към Glut1, -Actin, p-AMPK, AMPK и GAPDH, бяха закупени от Abcam; антитела за STAT3, p-STAT3 (Y705), AKT, p-AKT (S473), PFKFB3 и Caspase-3 са закупени от Cell SignalingTechnology; рапамицин, палмитинова киселина (Palm.), Z-VAD-FMK и глюкоза са получени от Sigma-Aldrich; MitoSOX, Hoechst33342, MitoTracker Red и PKH26 бяха получени от Invitrogen.

2.2 Клетъчна култура

Епителната клетка на човешкия проксимален тубул (HK{{0}}) е получена от Клетъчната банка на Шанхайския институт по биохимия и клетъчна биология, Китайската академия на науките и се поддържа, следвайки стандартни протоколи. HK-2 се посява в плочи с шест ямки (1 × 106 клетки/ямка) или 96-плаки с ямки (1 × 105 клетки/ямка) и култивирани в 90 процента RPMI1640 среда (Gibco), допълнена със 100 U/ml пеницилин, 100 µg/ml стрептомицин и 10 процента фетален говежди серум (FBS) (Gibco). Първо инкубирахме HK-2 с IL-22 (0,5 µg/ml) за 0,5 часа, след това 50 mM d-глюкоза или 5 µg/ml цисплатин или 0,2 mM палмитинова киселина или или 4 µM доксорубицин (DOX ) за 24 часа. В някои случаи клетките се култивират в присъствието на Z-VAD-FMK (10 цМ), съединение С (5 цМ), LY294002 (20 цМ) или рапамицин (50 nM) за посочените времена.

2.3 Експерименти с морско конче

Ние анализирахме TECs, използвайки Seahorse XF96 Extracellular Flux-Analyzer за промените в скоростта на извънклетъчната киселина (ECAR) и скоростта на консумация на кислород (OCR). Накратко, HK-2 (1 × 105) беше отгледан върху 96-плочи с Seahorse за една нощ. След това промихме клетките със среда за анализ на морско конче, съдържаща 1 mM пируват, 10 mM глюкоза и 2 mM глутамин (или без глюкоза за тестване на ECAR) в атмосфера без CO2 при 37◦C за {{18 }}.5 ч. Експерименталните данни бяха записани, след като посочените по-долу инхибитори бяха инжектирани при оптимална концентрация на FCCP (1.0 µM), олигомицин (1,0 µM), ротенон/антимицин А (0,5 µM), 2-DG (50 mM), или глюкоза (10 mM).

Cistanche може да лекуваувреждане на бъбреците

2.4 Мишки и животински модели

Мъжки BALB/c мишки (6–8 седмици) са закупени от Slaccas Experimental Animal Co. (Шанхай, Китай). Db / db и Db / m мишки бяха предоставени от Моделния център за изследване на животни на университета Нанкин (Нанкин, Китай). Всички мишки се държат в специални съоръжения без патогени (SPF) и се отглеждат, следвайки стандартни протоколи. За AKI модела мишките BALB/c получават цисплатин (20 mg/kg) или физиологичен разтвор чрез интраперитонеална инжекция. Db/db мишки бяха хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HFD) в посочените времеви точки за индуциране на диабетна нефропатия (DN). Db/m мишките бяха хранени с храна като контролна група. При експерименти с AKI върху животни, IL-22 е интраперитонеално инжектиран в доза от 0,5 mg/kg/ден или 1,5 mg/kg/ден в продължение на 4 последователни дни. При DN експерименти с животни, IL-22 е интраперитонеално инжектиран в доза от 2,5 mg/kg два пъти седмично в продължение на осем последователни седмици. Контролните мишки получиха подходящото количество PBS. Нашите експериментални процедури върху животни бяха извършени в съответствие с протоколите, оценени и одобрени от Комитета по етика на грижата за животните и употребата на Факултета по фармация, Университет Фудан. Имунохистохимично оцветяване, измерване на потенциала на митохондриалната мембрана, хистологично и оцветяване с реактивни кислородни видове (ROS) на бъбречни срезове бяха извършени, както е описано по-горе.22-24

2.5 PCR в реално време

Получихме общата РНК чрез TRNzol реактиви (Beyotime Biotechnology, Китай) от клетъчни или тъканни проби и след това ги транскрибирахме в cDNA, използвайки тестов комплект за MMLV-обратна транскриптаза (Beyotime Biotechnology). Нивото на експресия на иРНК се анализира от PCR инструментите в реално време (BioRad), като се използва SYBR green qPCR-mix комплект за анализ (Beyotime Biotechnology) и се стандартизира към GAPDH.

2.6 Поточна цитометрия

Бъбречните клетки се отглеждат и третират, както е описано по-горе. Оцветяването с MitoSOX (митохондриална ROS), MitoTracker Green (обща митохондриална маса) и MitoTracker Red (потенциал на митохондриалната мембрана) беше извършено съгласно инструкциите на производителя и предишни изследвания. 22–24 Получихме резултатите от проточния цитометър Beckman Coulter и Софтуер CytExpert (BD Biosciences).

2.7 Усвояване на глюкоза

Измерихме концентрациите на глюкоза в супернатантата на клетъчната култура чрез тест за поглъщане на глюкоза съгласно протокола на производителя и предишни изследвания (GAHK20; Sigma). Нормализацията на резултатите се извършва според броя на клетките.

2.8 Генен нокдаун

Използвахме малката интерферираща РНК (siRNA; RiboBio, Китай), за да унищожим специфичните гени. Първо, Lipofectamine RNAiMAX и siRNA (1 0 0 pmol) бяха внимателно смесени чрез пипетиране и инкубирани при 37 ° C за 0, 5 часа. След това променихме стандартната среда за клетъчна култура на коктейл за трансфекция и инкубирахме клетките в продължение на 6 часа за трансфекция на siRNA ген. След това променихме коктейла за трансфекция на свежа среда за клетъчна култура. След 48 часа бъбречните клетки се инкубират с IL-22 за по-нататъшни изследвания.

Cistanche може да лекуваувреждане на бъбреците

2.9 Уестърн блот

Екстрахирахме общи протеини от клетки или тъкан чрез RIPA лизисен буфер (Beyotime Biotechnology, Китай). След това събрахме лизатите чрез центрофугиране при 4 ° C при 12 000 rpm за 10 минути. Впоследствие лизатите се нагряват с буферите на пробата при 100 ° С в продължение на 15 минути, подлагат се на електрофореза с натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел (SDS-PAGE) и се пренасят електротрансферно върху мембрана от поливинилиден дифлуорид (PVDF) (Millipore, Германия). След това мембраните се блокират с 5 процента говежди серумен албумин (BSA) за 2 часа и се инкубират съвместно с първични антитела при 4 ° C за една нощ. След промиване три пъти, мембраните се инкубират с вторични антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян (CST, САЩ). Белтъчните петна се визуализират чрез подобрената хемилуминесцентна система за изобразяване.

2.10 Имунофлуоресценция

Бъбречните клетки бяха фиксирани с 3 процента –4 процента параформалдехид и пермеабилизирани с 0.1 процента Triton X-100. След това блокирахме клетките с 5% BSA за 2 часа. Клетките се инкубират една нощ с анти-GLUT1 антитялото при 4 ° С, промиват се четири пъти и след това се оцветяват с PKH26. Впоследствие бъбречните клетки се оцветяват с Hoechst 33342 и се поставят върху предметни стъкла. Данните са получени чрез конфокална микроскопия.

2.11 RNA-seq и биоинформатика

Пробите на TEC (2 × 1 0 7) бяха лизирани и общата РНК беше извлечена с помощта на RNeasy mini kit, съгласно протоколите на производителя (Beyotime, Шанхай, Китай). Еукариотната RNA-seq беше извършена с помощта на технологията за секвениране от следващо поколение (NGS) на системата за секвениране Illumina HiSeq, осигуряваща 50-базова дължина на четене. Подравняването на четенията на последователността беше извършено с помощта на TopHat v2.0.12 срещу UCSC mm10 монтаж. Анализът на диференциалната експресия беше изчислен с помощта на DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/release/ bioc/html/DESeq2.html) пакет и анализите на статистическата значимост бяха извършени в R (v3.1.1; http://www .r-project.org/). Свръхпредставянето на пътя беше извършено с помощта на R пакета ReactomePA.

2.12 Статистика

Данните бяха изразени като средно ± стандартно отклонение (SD) и бяха показани с помощта на GraphPad Prism 5.0. За резултатите, сравняващи две или повече групи, разликите бяха изчислени с помощта на t-теста на Стюдънт или еднопосочния анализ на дисперсията (ANOVA): ***p < 0.00="" 1,="" **p=""><0,01 и="" *p=""><>

Cistanche може да лекуваувреждане на бъбреците

3 РЕЗУЛТАТА

3.1 IL-22 запазва клетъчния метаболизъм в TECs

Тъй като се предполага, че митохондриите са важни органели, които интегрират клетъчния метаболизъм и апоптотичните процеси, ние оценихме митохондриалната функция в TECs, които бяха стимулирани сбъбрекнараняванефактори и третирани с IL-22.25 Както е показано на Фигура 1A–D, митохондриалната основна консумация на кислород (OCR), максималния респираторен капацитет (MRC) и дишането са блокирани значително в TEC при стресови ситуации. Трябва да се отбележи, че тези аномалии бяха до голяма степен предотвратени от лечението с IL- 22. Гликолизата в увредените TECs, доказана от скоростта на екстрацелуларно подкисляване (ECAR), също беше значително ограничена в сравнение с IL-22 плюс TECs, предизвикани от стимули (Фигура 1B и E). Освен това демонстрирахме, че компрометираното окислително фосфорилиране (OXPHOS) и гликолизата в увредените TECs не са вторичните ефекти на апоптозата чрез съвместно лечение с инхибитор на пан-каспаза (Фигура S1). И IL-22-медиирани репаративни ефекти върху метаболитни дефекти са специфични за бъбречните TECs (Фигура S2). Освен това, IL-22 насърчава HK2 клетки OXPHOS и гликолиза в отсъствието на стимули, което показва, че ефектите на IL-22 върху метаболитните пътища не са специфични за увредени TECs (Фигура S3). Освен това, нашите резултати също показват, че IL-22 насърчава експресията и транслокацията на IL-22R1. Междувременно фосфорилирането на STAT3 и ефектите на метаболитно препрограмиране на IL-22 бяха напълно обезоръжени от нокдаун на IL-22R1 (Фигура S4). Тези открития предполагат, че IL-22 възстановява метаболитното състояние на TECs чрез директно активиране на IL-22R1. Тъй като множество доказателства предполагаха, че Glut1 играе основна роля в гликолизата и глюкозната хомеостаза,26 ние попитахме дали IL-22 повлиява транслокацията или експресията на Glut1. Както се очакваше, ние демонстрирахме, че IL-22 не само насърчава преместения Glut1 към повърхността на клетъчната мембрана (PKH26) и експресията на Glut1, но също така повишава усвояването на глюкоза (Фигура 1F и G). Като цяло, тези наблюдения показват, че IL-22 може да подобри OXPHOS и гликолизата в увредените TEC.

ФИГУРА 1 IL-22 запазва митохондриалната годност и гликолизата в TEC. (A и B) Използваме анализатор на екстрацелуларен поток Seahorse XF96, за да тестваме промените в степента на извънклетъчната киселина (ECAR) и скоростта на потребление на кислород (OCR) на TEC. OCR и ECAR в TECs, инкубирани с 50 mM глюкоза, или 5 µg/mL цисплатин, или 0.2 mM палмитинова киселина, или 4 µM DOX в присъствието или отсъствието на IL{{8} }. (C) Максимален респираторен капацитет (MRC) на TECs, оценен чрез промени в реално време в OCR. (D и E) Криви в OCR и ECAR на TEC след инкубиране с олигомицин, FCCP, глюкоза, ротенон и {{10}}DG. (F) Локализация и експресия на ядрена (синя), Glut1 (зелена) и плазмена мембрана (червена) в TECs. (G) Консумация на глюкоза в TEC след лечение с IL-22 за 24 часа. n=3; скални ленти, 20 µm; t-тест на Стюдънт (несдвоен); ***p <0,001, **p=""><0,01, *p=""><>

3.2 IL-22 подобрява натрупването на дисфункционални митохондрии в TECs чрез активиране на митофагията

образуване на LC3 puncta в TEC след излагане на стимули (Фигура 2F). След това изчерпахме митофагията, за да оценим нейната функция върху метаболизма на тубулните клетки чрез siRNA-ATG5 (Фигура S6). Нашите данни предполагат, че изчерпването на митофагията в TECs значително инхибира защитните ефекти на IL-22 при запазване на митохондриалната годност (Фигура 2E), което показва, че IL-22 предотвратява митохондриалната дисфункция чрез активиране на митофагията.

ФИГУРА 2 IL-22 инхибира митохондриалната дисфункция и митохондриалното натрупване на ROS чрез индукция на митофагия. (A) Митохондриалната маса се оцветява и оценява чрез MitoTracker Green и поточна цитометрия. Митохондриалната ROS беше оценена в TECs, оцветени с MitoSOX (B). Потенциалът на митохондриалната мембрана беше оценен в TECs, оцветени с MitoTracker Green и MitoTracker Red (C); митохондриалното натрупване на ROS беше оценено от MitoTracker Green и MitoSOX (D). (E) Резултатите от конфокалното изображение предполагат митохондриална ROS продукция, белязана с MitoSOX. (F) Представителни микроскопични изображения показват образуване на LC3-GFP пунктат в присъствието или отсъствието на IL-22 TECs, стимулирани като (A) за 24 часа. (E) OCR се оценява в присъствието или отсъствието на IL-22 и siRNA-ATG5 за 24 часа. n=3; t-тест на Стюдънт (несдвоен); ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.3 IL-22 поддържа митохондриалната цялост на TECs чрез активиране на AMPK/AKT сигнализация

Сигнализацията AMPK, като ключов сигнализиращ център, свързващ клетъчното оцеляване и метаболизма, контролирания метаболизъм на глюкозата, липидния синтез и митохондриалната функция.28 Съгласно бъбречния защитен ефект на интерлевкин-22, медииран от метаболитно препрограмиране на TEC, ние оценихме дали IL-22 регулира митохондриалната цялост чрез активиране на AMPK сигнална трансдукция. Открихме, че IL-22 повишава активността на STAT3/AMPK/AKT сигнализираща трансдукция в увредените TECs, доказано от фосфорилирането на STAT3, AMPK и AKT (Фигура 3A). Освен това, тези процеси бяха блокирани в тубулни клетки без STAT3, което демонстрира, че IL-22 регулира AMPK/AKT сигнализиране чрез STAT3 (Фигура 3B и C; Фигура S7). Освен това инкубирахме TECs със съединение C и LY294002, за да инхибираме директно сигналните трансдукции на AMPK/AKT и след това оценихме техните митохондриални функции и състояния на метаболизъм. Резултатите разкриха, че съвместното лечение с тези сигнални инхибитори значително предотвратява подобрения OXPHOS и гликолитичен поток, индуциран от лечението с IL-22 (Фигура 3D–I), което предполага, че IL-22 насърчава метаболизма на TECs чрез активиране на AMPK /AKT сигнален път.

ФИГУРА 3 Индуцирането на AMPK/AKT сигнализиране от IL-22 поддържа митохондриалната годност. TEC бяха стимулирани с 50 mM глюкоза, или 5 µg/mL цисплатин, или 0.2 mM палмитинова киселина, или 4 µM DOX в присъствието или отсъствието на IL-22, Съединение C , или LY294002 за посочените часове. (A и B) Активирането на сигналния път на AMPK/AKT в TECs или STAT3-WT и STAT3–KD TECs беше оценено чрез Western blot анализ. (C и D) Бяха анализирани промените в OCR и ECAR на TEC. (E) Активирането на сигналния път на AMPK/AKT в TECs беше оценено чрез Western blot анализ. (F–I) Промените в OCR и ECAR на TECs бяха измерени в TECs спрямо TECs, третирани със Съединение C и LY294002. t-тест на Стюдънт (несдвоен); n=3; ***p <0,001, **p=""><0,01, *p=""><>

3.4 IL-22 запазва клетъчния метаболизъм и митохондриалната цялост на TECs чрез индукция на PFKFB3

Освен това, за да изследваме как са подобрени митохондриалната годност и метаболизъм на TECs, ние използвахме анализ на RNA секвениране (RNA-seq), за да оценим генната експресия след нараняване на стимули и лечение с IL-22. Ние демонстрирахме, че множество гени са значително променени в TEC след инкубация на IL-22 (Фигура 4А). Използвайки наличните бази данни, беше извършен анализ на обогатяването на генния набор на тези повишено регулирани гени, което предполага забележително обогатяване на гени в AMPK сигналния път и MYC насочва сигналния път (Фигура S8). Трябва да се отбележи, че PFKFB3 е значително индуциран от IL-22 измежду гените по време набъбрекнараняванефактори на стимулиране (Фигура 4А). Тези наблюдения също бяха показани чрез конфокални изображения, Q-PCR и Western blot. Високата експресия на PFKFB3 беше зависима от AMPK/AKT сигнализация (Фигура 4B и C; Фигура S9).

Предишни проучвания предполагаха, че PFKFB3 може да се регулира чрез многобройни сигнални трансдукции за ускоряване на епителната регенерация и възстановяване след нараняване. 29, 30 По този начин ние спекулирахме, че IL-22 индуцира PFKFB3, за да запази клетъчния метаболизъм на TECs и да поддържа тяхната митохондриална годност . Ние наблюдавахме, че инхибирането на AMPK/AKT сигнализирането намалява експресията на PFKFB3 (Фигура 4D). И така, ние заглушихме PFKFB3, за да проучим допълнително неговите функции в TEC след инкубация на IL-22. Нашите открития показват, че заглушеният PFKFB3 облекчава ефектите на метаболитно препрограмиране на IL-22 върху възстановяването на ECAR и OCR (Фигура 4E и F) и предотвратява усвояването на глюкоза, както и дисфункционалните митохондрии (Фигура 4G и H). Освен това, ние допълнително демонстрирахме, че ефектите на метаболитно препрограмиране на IL-22 са били напълно обезоръжени от STAT3-нокдаун, докато свръхекспресията на PFKFB3 може да бъде в състояние да спаси тези фенотипове, което предполага, че IL-22 възстановява метаболитно състояние на увредени бъбречни епителни клетки чрез директно насочване към STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3 сигнализиране (Фигура S10). Взети заедно, тези констатации показват, че активирането на PFKFB3 играе важна роля в митохондриалната годност и елиминирането на дисфункционалните митохондрии следбъбрекнараняване.

ФИГУРА 4 IL-22 поддържа целостта на митохондриите и клетъчния метаболизъм на TECs чрез индукция на PFKFB3. (A) График на вулкан за експресия на гени в TECs, стимулирани с глюкоза, или цисплатин, или палмитинова киселина, или CCl4 в присъствието или отсъствието на IL-22 за 24 часа. (B) Конфокални микроскопски данни показват свръхекспресия на PFKFB3 в TECs след лечение с IL-22, което изисква AMPK/AKT сигнализиращо активиране. (C) Резултатите от PCR в реално време показват, че IL-22 индуцира свръхекспресия на PFKFB3 в TECs, което може да бъде инхибирано от AMPK/AKT сигнален блок. (D) Активиране на сигналния път на AMPK/AKT/PFKFB3 в TECs след лечение със Съединение C и LY294002. (E и F) ECAR и OCR в TEC при наличие или отсъствие на IL-22 или si-PFKFB3 за 24 часа. (G) Консумация на глюкоза в TEC след третиране с IL-22 или si-PFKFB3 за 24 часа. (H) Митохондриалната дисфункция беше оценена в TECs, оцветени с MitoTracker Red и MitoTracker Green. t-тест на Стюдънт (несдвоен); n=3; ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.5 IL-22 облекчава увреждането на бъбреците при индуцирана от цисплатин AKI чрез потискане на бъбречното натрупване на ROS и митохондриална дисфункция

За да тестваме нашата хипотеза, че IL-22 регулира бъбречните метаболитни профили за потискане на увреждането на бъбречните тубули in vivo, ние първоначално оценихме бъбречните функции при мишки, третирани с IL-22-, на които е приложен цисплатин (Фигура 5А). Четири дни след инжектирането на цисплатин, IL-22 не само значително намалява тубулното клетъчно увреждане и кръвоизлив; тяхната бъбречна дисфункция също е била значително отслабена, което е оценено чрез серумните нива на уреен азот в кръвта (BUN) и креатинин (Cr) (Фигура 5B–D). Освен това предложихме IL-22 предотвратибъбрекнараняванечрез засилване на регенерацията на бъбреците и активиране на AMPK/AKT сигнализиране и PFKFB3 (Фигура 5E и F; Фигура S11). След това използвахме MitoSOX (специфично за митохондриите ROS багрило) и JC -1 (багрило, зависимо от потенциала на митохондриалната мембрана), за да оценим митохондриалната дисфункция, участваща в клетъчния метаболизъм и апоптозата. В бъбречните участъци на мишки, които са били третирани с цисплатин, има сравними натрупвания на ROS. Трябва да се отбележи, че четири дни след лечението с IL-22, нивата на ROS бяха значително намалени в увредените бъбреци в сравнение с ROS от мишки след лечение с PBS (Фигура 5G). Взети заедно, тези наблюдения предлагат доказателство, че IL-22 играе защитна роля при индуцирана от цисплатин AKI чрез контролиране на митохондриалната годност.

ФИГУРА 5 IL-22 облекчава увреждането на бъбреците при индуцирана от цисплатин AKI чрез инхибиране на бъбречното натрупване на ROS и дисфункционални митохондрии. (A) Схематична диаграма на експерименталните протоколи за оценка на защитните ефекти на IL-22 при индуцирано от цисплатин (20 mg/kg) увреждане на бъбреците. PBS като контролна група с носител и N-ацетил-1-цистеин (NAC, 150 mg/kg) като положителна контролна група. (B и C) Оценени са серумните нива на BUN, серумните нива на Cr, теглото на бъбреците и телесното тегло. Бяха представени представителни HE (D), Ki-67 оцветяване (E), MitoSOX (G) и JC{{10}} (G) изображения на бъбречните срезове. (F) Сравнението на STAT3/AMPK/AKT/PFKFB3 активиране в бъбречни екстракти от мишки, третирани с IL-22-, беше оценено чрез Western blot. t-тест на Стюдънт (несдвоен); n=3; ***p <0,001, **p=""><0,01, *p=""><>

3.6 IL-22 подобрява предизвиканото от диабет бъбречно увреждане чрез инхибиране на митохондриална дисфункция чрез активиране на AMPK/AKT сигнализация и PFKFB3

Ние и други демонстрирахме, че IL-22 може да упражнява защитна сила при диабетна нефропатия (DN), която е основната причина за ESTD.31–33 За по-нататъшно изследване на основните механизми, хранехме db/db мишки с високо- диети с мазнини (HFD) и след това ги третират с IL-22 (2,5 mg/kg, IP) в продължение на 8 седмици (Фигура 6А). Когато мишките бяха хранени само с HFD, открихме бъбречна тубулна фиброза и дилатация, в допълнение към атрофията. Обратно, когато мишките са третирани с IL-22, бъбречната фиброза и хистопатологията са значително подобрени, както и бъбречните функции. Подобрените бъбречни функции също бяха демонстрирани чрез понижени нива на серумен Cr, BUN и общи нива на албумин в урината/24 часа (UAE) (Фигура 6B–E). За да проучим дали тези дейности са свързани с митохондриите, ние оценихме митохондриалната функция, участваща в клетъчния метаболизъм и апоптозата. Резултатите показват, че повишените нива на ROS в митохондриите и натрупаните дисфункционални митохондрии са значително облекчени от лечението с IL-22 (Фигура 6F и G). За по-нататъшно изследване дали защитните функции на IL-22 в бъбрека са медиирани чрез PFKFB3, ние инжектирахме мишки с PFKFB3 shRNA аденовирус, за да унищожим PFKFB3. Нашите данни показват, че благоприятните ефекти на IL-22 върху индуцирано от HFD бъбречно увреждане, некроза, стеатоза, митохондриална дисфункция и натрупване на ROS и активирането на свързаните сигнални пътища са значително блокирани от нокдаун на PFKFB3 (Фигура 6B–G) . Повишената експресия на AMPK/AKT сигнализиране също се наблюдава след лечение с IL-22 (Фигура 6Н). Заедно с облекчаването на бъбречната дисфункция, експресиите на PFKFB3 и важни ензими в клетъчния метаболизъм също бяха подобрени в бъбреците на мишки, третирани с IL-22- (Фигура 6H и I). Освен това хистологичният анализ на основните органи не показва морфологични увреждания след инжектиране на IL-22, което предполага, че IL-22 може да бъде безопасен антидот без значителни странични ефекти или токсични реакции забъбрекнараняванеразстройства (Фигура 12S). Като цяло нашите данни предполагат, че IL- 22 облекчава увреждането на бъбреците чрез активиране на AMPK/AKT сигнална трансдукция, инхибиране на натрупването на ROS и регулиране на митохондриалната функция чрез PFKFB3.

ФИГУРА 6 IL-22 облекчава индуцираното от диабет бъбречно увреждане чрез AMPK/AKT сигнализиране и инхибиране на дисфункционални митохондрии чрез активиране на PFKFB3. (A) Схематична диаграма на експерименталните протоколи за оценка на защитните ефекти на IL-22 при индуцирано от диабет бъбречно увреждане. Db/m като контролна група на превозното средство. (B–D) Оценени са серумните нива на BUN, серумните нива на Cr и UAE. Бяха представени представителни HE (E), MitoSOX (F) и JC -1 (G) изображения на срезовете на бъбреците. (H и I) Сравнението на STAT3/AMPK/AKT/PFKFB3 активиране в бъбречни екстракти от мишки, третирани с IL-22-, беше оценено чрез Western blot. t-тест на Стюдънт (несдвоен); n=3; ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

4. ОБСЪЖДАНЕ

IL-22 се секретира от имунни клетки, като NK клетки, неутрофили, вродени лимфоидни клетки (ILC) и Т клетки, но не засяга директно тези клетки. Той предимно регулира функциите на епителните клетки поради ограничената експресия на IL-22R1 върху епителните клетки, включително TECs.15,34 Предишни проучвания предполагат, че IL-22 може да предпази от увреждане на бъбречния епител и да ускори тубулната регенерация чрез инхибиране на NLRP3 инфламазома и активиране на STAT3 и AKT сигнализиране.16,31 Въпреки това, основните механизми на тази защита все още не са изяснени. За по-нататъшно определяне на молекулярната основа на функцията на IL- 22 вбъбрекнараняване, ние първо изследваме дали IL-22 може да облекчи дисфункцията на бъбречните клетки и последващата апоптоза чрез регулиране на техните метаболитни състояния. Освен това, ние изучаваме два модела набъбрекнараняванезаболявания (AKI и DN) с приложение на IL-22 и сравнете наблюденията с тези на контролните групи. Ние посочваме, че IL-22 коригира метаболитното препрограмиране, за да поддържа целостта на митохондриите, намалява натрупването на ROS в митохондриите в увредени TECs и облекчава прогресивното увреждане на бъбреците и некрозата. Нещо повече, нашите открития предполагат, че IL- 22 може да активира свързаните с AMPK/AKT сигнални пътища в TECs и бъбреците, важни медиатори на заздравяването на епителните рани и оцеляването на клетките, за подобряване на митохондриалната дисфункция и влошаващите се метаболитни профили и отваряне на нов поле за IL-22 медииран бъбречен защитен механизъм. Като цяло нашите резултати показват, че бъбречните защитни ефекти на IL-22 се медиират чрез процеси на метаболитно препрограмиране.

Критичната роля на OXPHOS и гликолизата в защитата на бъбреците е разкрита в предишни проучвания, където балансирането на използването на гориво чрез инхибиторно S-нитрозилиране на пируват киназа М2 (PKM2) предпазва отбъбрекнараняване.19 Нашите резултати, предполагащи насърчаването на OXPHOS и гликолизата от IL-22 чрез увеличаване на експресията на метаболитни регулатори и усвояването на глюкоза, показват, че IL-22 обръща влошаващите се метаболитни състояния, свързани сбъбрекнараняване. Тези наблюдения са в съответствие с бъбречните защитни функции на рекомбинантния иризин и също така в съответствие с откритията от хепатоцитите, където както OXPHOS, така и гликолизата са необходими за клетъчните функции, но ако те се инхибират, тогава първичните тубулни клетки и хепатоцитите стават дисфункционални.35, 36

Митохондриалната дисфункция се очертава като ключова молекулярна основа, която интегрира метаболитни профили и клетъчна смърт. Тук илюстрираме, че при стимулиране на фактори на нараняване, лечението с TECs с IL-22 е подобрило натрупването на митохондриални ROS и дисфункционални митохондрии в сравнение с намалената митохондриална цялост и функция в контролните групи. Важно е, че сигналните пътища на AMPK, критични енергийни сензори, модулират метаболитните процеси, за да поддържат клетъчната хомеостаза и да предотвратят увреждане на клетките или тъканите.37–39 В настоящото проучване нашите наблюдения показват, че IL-22 запазва целостта и функцията на митохондриите чрез активиране на AMPK/AKT сигнализиране, за да се демонстрира, че IL-22 предотвратява митохондриална дисфункция по директен метод, което е жизненоважно за поддържане на дихателния капацитет на TEC. Освен това, ние демонстрираме, че IL-22 сигнализирането чрез STAT3 има директни ефекти върху запазването на митохондриалната годност, тъй като тези, които са били изследвани по-рано, че индуцираното STAT3 фосфорилиране е критично за запазване на целостта на митохондриите.40,41

Множество видове литература по-рано са посочили, че PFKFB3 играе ролята на централен модулатор в клетъчния метаболизъм. 29–30,42 Тук първо демонстрираме, че IL-22 насърчава активирането на PFKFB3 чрез AMPK/AKT сигнализиране в TECs, което предполага IL{ {6}} регулира метаболитните състояния чрез включването на контрола на PFKFB3. Освен това, предишни проучвания допълнително показват, че PFKFB3 е важен за контролиране на преувеличения OXPHOS и гликолизата в много клетки или тъкани.42,43 В съответствие с тези проучвания, нашите наблюдения също показват насърчаване на OXPHOS и гликолизата в IL-22- третирани TECs чрез активиране на PFKFB3. Сред многобройните модулатори надолу по веригата на IL-22, които са изследвани, нашите данни показват, че PFKFB3 е значително повишен след лечение с IL-22 по време на увреждане на TECs и че оста STAT3–AMPK/AKT PFKFB3 е жизненоважна за запазването на митохондриалната цялост по време набъбрекнараняване(Фигура 7). Те остават да бъдат изследвани дали IL-22 също регулира други метаболитни регулатори и процеси, свързани с бъбречно увреждане чрез активиране на STAT3–AMPK/AKT-PFKFB3 сигнален път.

ФИГУРА 7 Нашите открития илюстрират важна роля на IL-22 в контролирането на метаболизма на бъбречните клетки за лечение на бъбречно увреждане чрез активиране на оста STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3. Тези резултати предполагат, че терапевтичните възможности на IL-22 и насочването към свързаното метаболитно сигнализиране могат да бъдат пряко благоприятни за лечение или превенция на множество бъбречни увреждания

5 ИЗВОДИ

В заключение ние демонстрирахме терапевтичния потенциал и основните механизми на IL-22 при увреждане на бъбреците. IL-22 регулира метаболизма на бъбречните клетки чрез метаболитно препрограмиране, за да се запази целостта на митохондриите. Инхибирането на техните регулатори (т.е. AMPK, Akt и PFKFB3) може да доведе до анормални метаболитни профили и загуба на митохондриална годност, както е посочено в TECs със спонтанно -22 лечение, което е увеличило дисфункционалните митохондрии и митохондриалното натрупване на ROS. Най-важното е, че увреждането на бъбреците от митохондриална дисфункция и натрупването на ROS в модели на мишки бяха значително облекчени от лечението с IL-22 чрез активиране на STAT3-AMPK-AKT-PFKFB3 сигнализиране. По този начин, нашето проучване показа, че насочването към свързаното метаболитно сигнализиране може да бъде директно благоприятно за многобройни заболявания с увреждане на бъбреците и IL -22 е потенциален терапевтичен агент за предотвратяване и лечение на тези заболявания.

Продуктите Cistanche могат да лекуватувреждане на бъбреците

От: „IL-22-медиирано бъбречно метаболитно препрограмиране чрез PFKFB3 за лечениебъбрекнараняване' отWei Chen и др

---Clin. Превод Med. 2021;11:e324.

ПРЕПРАТКИ

1. Mehta RL, Burdmann EA, Cerdá J, et al. Разпознаване и лечение на острибъбрекнараняванев Международното дружество по нефрология 0от 25 Global Snapshot: мултинационално кръстосано проучване. Ланцет. 2016;387:2017-2025.

2. Lameire NH, Bagga A, Cruz D, et al. остърбъбрекнараняване: нарастваща глобална загриженост. Ланцет. 2013;382:170-179.

3. Mehta RL, Cerdá J, Burdmann EA, et al. Инициативата на Международното общество по нефрология 0by25 за острабъбрекнараняване(нула предотвратими смъртни случаи до 2025 г.): случай с правата на човека за нефрологията. Lancet. 2015;385:2616-2643.

4. Леви AS, Джеймс MT. остърбъбрекнараняване. Ann Intern Med.2017;167:ITC66-ITC80.

5. Jansen MPB, Florquin S, Roelofs JJTH. Ролята на тромбоцитите при острабъбрекнараняване. Nat Rev Nephrol. 2018;14:457-471.

6. Agarwal A, Dong Z, Harris R, et al. Клетъчни и молекулярни механизми на AKI. J Am Soc Nephrol. 2016;27:1288-1299.

7. Linkermann A, Chen GC, Dong G, Kunzendorf U, KrautwaldS, Dong Z. Регулирана клетъчна смърт при AKI. J Am Soc Nephrol.2014;25:2689-2701.

8. Ferenbach DA, Bonventre JV. Механизми на неадаптивно възстановяване след AKI, водещи до ускорено стареене на бъбреците и ХБН. Nat Rev Nephrol. 2015;11:264-276.

9. Chawla LS, Eggers PW, Star RA, Kimmel PL. остърбъбрекнараняванеи хронично бъбречно заболяване като взаимосвързани синдроми. N Engl J Med. 2014;371:58-66.

10. He L, Wei QQ, Liu J, et al. AKI при ХБН: повишено увреждане, потиснато възстановяване и основните механизми. Kidney Int.2017;92:1071-1083.

11. Forbester JL, Lees EA, Goulding D, et al. Интерлевкин -22 насърчава фаголизозомното сливане, за да индуцира защита срещу Salmonella enterica Typhimurium в човешки епителни клетки. Proc Natl Acad Sci USA. 2018; 115: 10118-10123.

12. Geng H, Bu HF, Liu F, et al. Във възпалени чревни тъкани и епителни клетки сигнализирането на интерлевкин 22 повишава експресията на H19 дълга некодираща РНК, която насърчава регенерацията на лигавицата. Гастроентерология. 2018; 155: 144-155.

13. Aden K, Tran F, Ito G, et al. ATG16L1 организира сигнализирането на интерлевкин-22 в чревния епител чрез cGAS-STING. J ExpMed. 2018; 215: 2868-2886.

14. Huber SN, Gagliani LA, Zenewicz FJ, et al. IL-22BP се регулира от инфламазомата и модулира туморогенезата в червата. Природата. 2012; 491: 259-263.

15. Lindemans CA, Calafiore M, Mertelsmann AM, et al. Интерлевкин -22 насърчава регенерацията на епитела, медиирана от чревни стволови клетки. Природата. 2015;528:560-564.

16. Xu MJ, Feng D, Wang H, Guan Y, Yan X, Gao B. IL-22 подобрява увреждането на бъбречната исхемия-реперфузия чрез насочване към епитела на проксималните тубули. J Am Soc Nephrol. 2014;25:967-977.

17. Kulkarni OP, Hartter I, Mulay SR, et al. Toll-подобен рецептор 4-индуциран IL-22 ускорява регенерацията на бъбреците. J Am Soc Nephrol. 2014;25:978-989.

18. Kang HM, Ahn SH, Choi P, et al. Дефектното окисляване на мастни киселини в епителните клетки на бъбречните тубули има ключова роля в развитието на бъбречна фиброза. Nat Med. 2015;21:37-46.

19. Zhou HL, Zhang R, Anand P, et al. Метаболитното препрограмиране от S-нитрозо-CoA редуктазната система предпазва отбъбрекнараняване. Природата. 2019;565:96-100.

20. Dumesic PA, Egan DF, Gut P, ​​et al. Еволюционно запазен uORF регулира PGC1 и оксидативния метаболизъм при мишки, мухи и червен тон. Cell Metab. 2019;30:190-200.

21. Shyh-Chang N, Zhu H, Yvanka de Soysa T, et al. Lin28 подобрява възстановяването на тъканите чрез препрограмиране на клетъчния метаболизъм. клетка. 2013; 155: 778-792.

22. Chen W, Luan J, Wei G и др. In vivo хепатоцелуларна експресия на интерлевкин-22 с използване на базирани на проникване хибридни наночастици като потенциални антихепатитни терапевтици. Биоматериали. 2018; 187: 66- 80.

23. Chen W, Zhang X, Fan J, et al. Свързването на интерлевкин-22 с аполипопротеин AI облекчава мишките от увреждане на черния дроб, предизвикано от ацетаминофен. Теранотика. 2017;7:4135-4148.

24. Zai W, Chen W, Wu Z и др. Насочено доставяне на ген на интерлевкин-22 в черния дроб чрез полиметформин и базирани на проникване хибридни наночастици за лечение на неалкохолна мастна чернодробна болест. ACS Appl Mater интерфейси. 2019;11:4842-4857.

25. Khacho M, Harris R, Slack RS. Митохондриите като централни регулатори на съдбата на нервните стволови клетки и когнитивната функция. Nat Rev Neurosci. 2019;20:34-48.

26. Ip WKE, Hoshi N, Shouval DS, Snapper S, Medzhitov R. Противовъзпалително действие на IL-10, медиирано от метаболитно препрограмиране на макрофаги. Наука. 2017; 356: 513-519.

27. Saito Y, Chapple RH, Lin A, Kitano A, Nakada D. AMPK защитава клетките, иницииращи левкемия, при миелоидни левкемии от метаболитен стрес в костния мозък. Клетъчна стволова клетка. 2015;17:585- 596.

28. Михайлова MM, Shaw RJ. AMPK сигналният път координира клетъчния растеж, автофагията и метаболизма. Nat Cell Biol. 2011;13:1016-1023.

29. Li FL, Liu JP, Bao RX, et al. Ацетилирането натрупва PFKFB3 в цитоплазмата, за да стимулира гликолизата и предпазва клетките от индуцирана от цисплатин апоптоза. Nat Commun. 2018; 9: 508.

30. De Bock K, Georgiadou M, Schoors S, et al. Роля на гликолизата, управлявана от PFKFB3-, в покълването на съдове. клетка. 2013; 154: 651-663.

31. Дудаков JA, Ханаш AM, van den Brink MR. Интерлевкин-22: имунобиология и патология. Annu Rev Immunol. 2015;33:747- 785.

32. Wang S, Li Y, Fan J, et al. Интерлевкин-22 подобрява бъбречното увреждане и фиброзата при диабетна нефропатия чрез инхибиране на активирането на инфламазома на NLRP3. Клетъчна смърт Dis. 2017; 8: e2937.

33. Shen YL, Chen W, Han L, et al. VEGF-B антитялото и интерлевкин-22 слетият протеин подобряват диабетната нефропатия чрез инхибиране на натрупването на липиди и възпалителните реакции. Acta Pharm Sin B. 2020. https://doi.org/10.1016/j. апсб.2020.07.002.

34. Ouyang W, O'Garra A. IL-10 семейство цитокини IL-10 и IL-22: от основна наука до клиничен превод. Имунитет. 2019;50:871- 891.

35. Xiang X, Feng D, Hwang S, et al. Интерлевкин-22 облекчава острата към хроничната чернодробна недостатъчност чрез препрограмиране на увредените пътища на регенерация при мишки. J Hepatol. 2020;72:736-745.

36. Chen W, Zai W, Fan J, et al. Интерлевкин-22 задвижва метаболитно адаптивно препрограмиране за поддържане на митохондриалната годност и лечение на чернодробно увреждане. Теранотика. 2020;10:5879-5894.

37. Peng H, Wang Q, Lou T, et al. Медиираните от миокини кръстосани смущения мускул-бъбрек потискат метаболитното препрограмиране и фиброзата в увредените бъбреци. Nat Commun. 2017; 8: 1493.

38. Saberi B, Ybanez MD, Johnson HS, Gaarde WA, Han D, Kaplowitz N. Протеин киназа c (PKC) участва в хепатотоксичността на ацетаминофен чрез c-jun-n-терминална киназа (jnk)-зависими и независими сигнални пътища. Хепатология. 2014;59:1543-1554.

39. Mo R, Lai R, Lu J, et al. Подобрената аутофагия допринася за защитните ефекти на IL-22 срещу индуцирано от ацетаминофен чернодробно увреждане. Теранотика. 2018; 8: 4170-4180.

40. Wegrzyn J, Potla R, Chwae YJ, et al. Функция на митохондриалния Stat3 в клетъчното дишане. Наука. 2009;323:793-797.

41. Chen W, Hu Y, Ju D. Генна терапия за невродегенеративни разстройства: напредък, прозрения и перспективи. Acta Pharm Sin B. 2020; 10: 1347-1359.

42. Cao Y, Zhang X, Wang L, et al. PFKFB3-медиираната ендотелна гликолиза насърчава белодробната хипертония. Proc Natl Acad Sci САЩ. 2019;116:13394-13403.

43. Doménech E, Maestre C, Esteban-Martínez L, et al. AMPK и PFKFB3 медиират гликолизата и оцеляването в отговор на митофагия по време на митотичен арест. Nat Cell Biol. 2015;17:1304- 1316.