Сероварите на Salmonella Enterica при отсъствие на TtrA и PduA гени засилват клетъчния имунен отговор по време на инфекции при пилета

Salmonella spp. е един от основните хранителни патогени, отговорен за причиняването на икономически загуби в птицевъдната индустрия и за последиците за общественото здраве. Както способността за оцеляване на патогена в чревната среда по време на възпаление, така и връзката им с имунната система на гостоприемника, играят ключова роля по време на инфекции при домашни птици. Целта на това проучване беше да се определи количествено присъствието на популациите макрофаги и CD4+ /CD8+ клетки с помощта на имунохистохимична техника в търговски линии на пилета, експериментално заразени с див тип и мутантни щамове на Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium без ttrA и pduA гени. Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA предизвиква по-висок процент от оцветената област в сравнение с дивия тип, с изключение на леките кокошки носачки. Щамът от див тип Salmonella Typhimurium и инфекциите със Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA водят до подобен модел, при който при 1 и 14 dpi сливиците на цекума и илеума на птиците показват по-изразителна оцветена област в сравнение с 3 и 7 dpi. Във всички изследвани линии се наблюдава изразена инфилтрация на макрофаги в сравнение с CD4+ и CD8+ клетки. Като цяло, животните, заразени от мутантния щам, показват положително оцветена област, по-висока от дивия тип. Делециите както в ttrA, така и в pduA гените доведоха до по-интензивна инфилтрация на макрофаги и CD4+ и CD8+ клетки в птиците гостоприемници, което предполага липса на атенюация на патогена, дори при различни щамове Salmonella.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Salmonella enterica е хранителен патоген, който причинява загуби на добитъка, както и въздейства пряко върху общественото здраве. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) и Typhimurium (Salmonella Typhimurium) се свързват основно с хранителни инфекции от десетилетия. Между 1995 г. и 2010 г. Salmonella Enteritidis е идентифицирана в 34,2% от всички проби, положителни за Salmonella spp1. Освен това, Winter et al.2 публикуват значително проучване, изследващо ролята на гена, кодиращ тетратионат, като избират серотипа Salmonella Typhimurium, но използват мишки като експериментален модел. Като вземем това предвид, задълбочаването на познанията ни за взаимодействието гостоприемник-патоген може да помогне за подобряване на измерванията на контрола и ликвидирането. Няколко фактора участват в патогенезата на салмонелозата, като например способността на патогена да се репликира в среда на възпалена лигавица, в зависимост от усвояването на хранителни вещества и анаеробното дишане2. Наличието на хранителни вещества обаче не гарантира оцеляване на бактериите в конкурентна среда, гъсто населена с други микроорганизми. По този начин способността на Salmonella enterica да метаболизира тетратионат, като използва тетратионат редуктаза за производство на 1,2-пропандиол като енергиен източник, дава предимство във фитнеса. Този ензим се състои от TtrA, TtrB и TtrC. Първата цитирана субединица принадлежи към суперсемейството на молибдоптерин (MPT) и има свързващ домен на FeS, който участва в редуцирането на тетратионата в тиосулфат (S2O3 2-)2–4. Te 1,2-пропандиол се използва от бактериални микрокомпартменти (MCP). Тази структура се състои от седем различни протеина, сред които PduA е основният компонент на MCP структурата5. Първо, 1,2-пропандиол се превръща в пропионалдехид, който от своя страна се редуцира до пропанол и пропионат чрез пропандиол дехидратазната активност. Този процес генерира АТФ чрез фосфорилиране, електронен (1-пропанол) градиент за регенериране на NAD и посредник (пропионил-CoA), който може да се използва като въглерод и източник на енергия в целия метил цитрат чрез, като зависи от синтезирания витамин В12 по ендогенен начин6. По време на инфекции при пилета, способността на сероварите на Salmonella enterica да нахлуват и оцеляват в чревните епителни клетки и макрофаги е последвана от избягване на имунния отговор7. В този контекст инфекцията е критична фаза, която зависи от взаимодействието между бактериалните и гостоприемниковите клетки и способността на бактериите да преодолеят бариерите на чревния епител, за да гарантират колонизацията и репликацията. Независимо от това, той активира възпалителния и имунния отговор8, който води до ендоцитоза и фагоцитоза съответно от епителни и антиген-представящи клетки (APCs). Антимикробната активност на тези клетки задейства вроден отговор чрез макрофаги, а модулът на адаптивния имунен отговор разчита на CD4+ и CD8+ активиране9. За да хвърлим светлина върху взаимодействията гостоприемник-патоген зад чревната инфекция от Salmonella при пилета, ние оценяваме популацията от клетки на имунната система по време на чревна колонизация и системна инфекция при птици от търговски линии, предизвикани от див тип мутантни щамове на Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium , носещи делеции в гени, свързани с метаболизирането на тетратионат (ttrA) и 1,2-пропандиол (PDU).

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Резултати

Експеримент 1—Провокация със Salmonella Enteritidis.

Резултатите от количественото определяне на присъствието на клетките на имунния отговор в сливиците на цекума, цекума, илеума и черния дроб от бройлери, леки кокошки носачки и полутежки кокошки носачки са показани в таблици 1, 2 и 3. Открихме още CD 4+ и клетъчна инфилтрация на макрофаги от бройлери, заразени със Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA (SEΔttrAΔpduA), отколкото от бройлери, заразени със Salmonella Enteritidis див тип щам (wt-SE) или незаразени птици, във всички оценени тъкани. Установено е изключение за CD4+ клетъчна инфилтрация при 3 dpi в сливиците на цекума, илеума и черния дроб и за инфилтрация на макрофаги при 3 и 14 dpi в черния дроб от SEΔttrAΔpduA заразени бройлери. Освен това, броят на инфилтрираните CD8+ клетки се наблюдава в по-голямо количество от птици, заразени с SEΔttrAΔpduA при 1 и 7 dpi в цекума и черния дроб, при 3 dpi в цекумните сливици и 14 dpi в илеума. За разлика от това, заразените с wt-SE птици имат висока инфилтрация на CD8+ клетки в илеума и сливиците на цекума при 1 и 7 dpi, съответно (Таблица 1; Допълнителна фигура S1). Таблица 2 и допълнителна фигура S2 показват CD4+ и CD8+ и инфилтрация на макрофаги, открити в тъканите на полутежки кокошки носачки. Като цяло, имаше голяма вариация между областите на клетъчни инфилтрати, засягащи както предизвикателния щам, така и изследваните тъкани. Птиците, провокирани с SEΔttrAΔpduA, показват по-високи площи, покрити от CD4+ клетки (в илеума при 1 и 14 dpi и черния дроб при 7 dpi) и макрофаги (в илеума при 7 dpi и черния дроб при 3, 7 и 14 dpi), отколкото в същата тъкан на заразени с wt-SE птици. От друга страна, CD8+ клетки бяха открити в по-големи количества в сливиците на цекума (при 1 и 7 dpi) и цекума (при 3 dpi) на птици, заразени с щам wt-SE. Наблюдаван по различен начин при бройлери и полутежки пилета носачки, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA предизвиква по-малко интензивен имунен отговор клетъчни области от дивия тип при заразяване от леки кокошки носачки. Птиците, заразени с Wt-SE, показват по-големи инфилтрационни зони на CD4+ в сливиците на цекума (при 1 и 3 dpi), цекума (при 3, 7 и 14 dpi), илеума (при 1 и 7 dpi) и черния дроб (при 14 dpi). По подобен начин предизвикателствата с SEΔttrAΔpduA са довели до намалени зони на инфилтрация на двата CD8+ в сливиците на цекума (при 1 dpi) и илеума (при 7 и 14 dpi), и макрофаги в тонзилите на цекума и цекума (при 3 dpi), в сравнение с птици, заразени с wt-SE. Не са наблюдавани значителни промени в областта на клетките на имунната система на CD8+ и клетките на макрофагите в черния дроб както от SEΔttrAΔpduA, така и от заразени с wt-SE птици. Подробните резултати от предизвикателството с леки кокошки носачки са показани в таблица 3 (вижте допълнителна фигура S3).

Таблица 1. Представяне на значителната разлика, свързана с количественото разпределение на различни клетки с имунен отговор в органи на бройлери, заразени с диви и мутантни щамове Salmonella Enteritidis в различни дни след заразяването. DPI, дни след инфекцията; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis див тип; ns, няма съществена разлика. В рамките на всеки орган и DPI * означава разлика чрез двупосочен ANOVA, последван от сравнителния тест на Bonferroni между стойностите на диви и мутантни щамове (*P По-малко или равно на 0.05; **P По-малко отколкото или равно на 0.01; ***P По-малко или равно на 0,001; ****P По-малко или равно на 0,0001). Щамът, представен в таблицата (∆-SE или wt-SE) като значим в рамките на органа и DPI е този, който показва основната зона на инфлтрация към всяка клетка.

Таблица 2. Представяне на значителната разлика, свързана с количественото разпределение на различни клетки на имунен отговор в органите на полутежки кокошки носачки, заразени с диви и мутантни щамове Salmonella Enteritidis в различни дни след заразяването. DPI, дни след инфекцията; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis див тип; ns, няма съществена разлика. В рамките на всеки орган и DPI, * означава разлика чрез двупосочен ANOVA, последван от сравнителния тест на Bonferroni между стойностите на диви и мутантни щамове (*P По-малко или равно на 0.{{10}}5 ; **P По-малко или равно на 0.01; ***P По-малко или равно на 0,001; ****P По-малко или равно на 0,0001). Щамът, представен в таблицата (∆-SE или wt-SE) като значим в рамките на органа и DPI е този, който показва основната зона на инфлтрация към всяка клетка.

Таблица 3. Представяне на значителната разлика, свързана с количественото разпределение на различни клетки с имунен отговор в органи на леки кокошки носачки, заразени с диви и мутантни щамове Salmonella Enteritidis в различни дни след заразяването. DPI, дни след инфекцията; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis див тип; ns, няма съществена разлика. В рамките на всеки орган и DPI * означава разлика чрез двупосочен ANOVA, последван от сравнителния тест на Bonferroni между стойностите на диви и мутантни щамове (*P По-малко или равно на 0.{{10}}5 ; **P По-малко или равно на 0.01; ***P По-малко или равно на 0,001; ****P По-малко или равно на 0,0001). Щамът, представен в таблицата (∆-SE или wt-SE) като значим в рамките на органа и DPI, е този, който показва основната област на инфилтрация към всяка клетка.

растение цистанче, повишаващо имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Експеримент 2—Провокация със Salmonella Typhimurium.

Резултатите от количественото определяне на присъствието на клетките на имунния отговор в сливиците на цекума, цекума, илеума и черния дроб от бройлери, полутежки кокошки носачки и леки кокошки носачки са показани съответно в таблици 4, 5 и 6. Като цяло, бройлери, заразени от мутантния щам, показват положителна маркирана площ, по-висока от тези, заразени с щам от див тип Salmonella Typhimurium (wt-STM), през всичките четири дни за вземане на проби. Освен това не са наблюдавани промени в клетките на имунния отговор в неинфектираните контролни групи. Те CD4+ клетъчни площи във всички тъкани на бройлери достигнаха статистическа разлика при 1 dpi, с по-големи инфилтрации за предизвикателството със Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA (STM∆ttrA∆pduA). Значителна разлика между областта на количествено определения имунен отговор от STM∆ttrA∆pduA- и заразени с wt-STM птици е била, с по-големи инфилтрации, когато предизвикателството е с мутантния щам в цекума и илеума при 1 dpi, и черен дроб при 14 dpi (CD8+ клетки); в цекума, илеума и черния дроб при 1 и 14 dpi (макрофаги) (Таблица 4; Допълнителна фигура S4). Резултатите от полутежки носачки не показват статистическа разлика между заразяване с мутант и див тип щамове за CD4+ клетки в цекума и CD8+ клетки в цекумните тонзили и илеума през всичките 4 дни оценени след инфекции (Таблица 5; Допълнителна фигура S5). Въпреки това, когато се наблюдава значителна зона на концентрация на клетки на имунната система, полутежките кокошки носачки бяха заразени от STM∆ttrA∆pduA: основна област на инфилтрация на макрофаги във всички изследвани тъкани (при 1 и 14 dpi); основна област на инфилтрация на CD4+ клетки в сливиците на цекума и черния дроб (при 1, 7 и 14 dpi) (Таблица 5; Допълнителна фигура S5). Таблица 6 и допълнителна фигура S6 показват CD4+, CD8+ и инфилтрация на макрофаги, открити в тъканите на леки кокошки носачки. Птиците, провокирани със STM∆ttrA∆pduA, показват основната област на клетките на имунната система на CD4+ и макрофагите в сливиците и цекума (при 14 dpi) и илеума (при 1 и 14 dpi) в сравнение с клетките на имунния отговор площ от същите тъкани от заразени с wt-STM птици. Не е открита статистическа разлика за зоната на инфилтрация на CD8+ в сливиците на цекума, цекума и илеума от заразените птици. За разлика от резултатите, получени в други тъкани, черният дроб от заразени с STM∆ttrA∆pduA птици имаше по-експресивна оцветена зона от клетки на имунен отговор за CD4+ и CD8+ клетки при всичките четири dpi, и макрофаги при 1 и 14 dpi.

Таблица 4. Представяне на значителната разлика, свързана с количественото разпределение на различни клетки с имунен отговор в органи на бройлери, заразени с Salmonella Typhimurium диви и мутантни щамове в различни дни след заразяването. DPI, дни след инфекцията; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium див тип; ns, няма съществена разлика. В рамките на всеки орган и DPI * означава разлика чрез двупосочен ANOVA, последван от сравнителния тест на Bonferroni между стойностите на диви и мутантни щамове (*P По-малко или равно на 0.05; **P По-малко отколкото или равно на 0.01; ***P По-малко или равно на 0,001; ****P По-малко или равно на 0,0001). Щамът, представен в таблицата (∆-STM или wt-STM) като значим в рамките на органа и DPI, е този, който показва основната зона на инфлтрация към всяка клетка.

Таблица 5. Представяне на значителната разлика, свързана с количественото разпределение на различни клетки на имунен отговор в органите на полутежки кокошки носачки, заразени с Salmonella Typhimurium диви и мутантни щамове в различни дни след заразяването. DPI, дни след инфекцията; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium див тип; ns, няма съществена разлика. В рамките на всеки орган и DPI, * означава разлика чрез двупосочен ANOVA, последван от сравнителния тест на Bonferroni между стойностите на диви и мутантни щамове (*P По-малко или равно на 0.{{10}}5 ; **P По-малко или равно на 0.01; ***P По-малко или равно на 0,001; ****P По-малко или равно на 0,0001). Щамът, представен в таблицата (∆-STM или wt-STM) като значим в рамките на органа и DPI, е този, който показва основната зона на инфлтрация към всяка клетка.

Таблица 6. Представяне на значителната разлика, свързана с количественото разпределение на различни клетки с имунен отговор в органи на леки кокошки носачки, заразени с диви и мутантни щамове Salmonella Typhimurium в различни дни след заразяването. DPI, дни след инфекцията; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium див тип; ns, няма съществена разлика. В рамките на всеки орган и DPI * означава разлика чрез двупосочен ANOVA, последван от сравнителния тест на Bonferroni между стойностите на диви и мутантни щамове (*P По-малко или равно на 0.{{10}}5 ; **P По-малко или равно на 0.01; ***P По-малко или равно на 0,001; ****P По-малко или равно на 0,0001). Щамът, представен в таблицата (∆-STM или wt-STM) като значим в рамките на органа и DPI, който показва основната област на инфилтрация към всяка клетка.

Дискусия

Бактериите, когато са изложени на анаеробни условия, могат да използват тетратионат и 1,2-пропандиол метаболитни субстрати за източници на енергия и дишане10. Така Salmonella spp. отдавна е обект на изследвания за това как изтриването на гени, за които е известно, че са отговорни за тези пътища, би повлияло на тяхното оцеляване в гостоприемника. Доколкото ни е известно, беше публикувано само едно проучване, изследващо едновременно тетратионат- и пропандиол-кодиращи генни роли. Нашата изследователска група докладва ефектите от тези заличавания чрез оценка на системната инфекция и фекална екскреция на Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium в търговски линии на пилета11. За да се увеличи дискусията по този въпрос, настоящите резултати подчертаха имунната клетка, инфилтрирана в различни тъкани на пилешки линии, предизвикани както от див тип, така и от мутантни щамове, носещи делеции в ttrA и pduA гени. През 2-седмичния експеримент положително оцветените области на CD4+ и CD8+ клетки и макрофаги следват предимно подобен модел, при който при 1 и 14 dpi представят по-голям брой имунни отговори клетки. Това може да се обясни с първичния контакт на защитната система на гостоприемника, когато патогенът нахлуе. Предишният доклад показа, че при заразени пилета, дори когато Salmonella не се екскретира при 12 dpi, инфекцията може да стане положителна чрез тампон от клоака от 13 dpi12, обяснявайки защо областите на клетките на имунната система при 3 и 7 dpi са по-ниски, но отново се увеличават . На пръв поглед би се очаквало, че предизвиканият отговор на гостоприемника ще бъде намален, когато и pduA, и ttrA бъдат изтрити, тъй като тези гени играят важна роля в оцеляването по време на инфекция от Salmonella 2, 4, 13-15. Въпреки това, нашите резултати, сравняващи двоен мутант без двата гена, показаха обратното, мутантните щамове на Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium задействаха клетки с по-висок имунен отговор, отколкото дивите видове щамове.

Ползи от Cistanche tubulosa- укрепване на имунната система

Най-късата оцветена зона може да доведе до голям брой колонии в чревния тракт, потвърждавайки предишно проучване, при което щамовете Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA и Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA са възстановени в по-голям брой от тампони от клоака, отколкото техният див тип корелира11 . Salmonella може да се държи като извънклетъчна или вътреклетъчна бактерия, в зависимост от наличния хранителен репертоар и възниква като превключване между чревна колонизация и интернализация в клетките гостоприемници16. Когато бактериите бъдат погълнати и убити от макрофагите, някои пептидни фрагменти се прехвърлят на повърхността на антиген-представящата клетка, като се кодират от главния комплекс за хистосъвместимост (МНС), клас II. Това свързване на пептид-MHC II стимулира T CD4+ лимфоцитите. Въпреки това, ако бактерията реши да нахлуе в клетката гостоприемник, навлизайки в цитоплазмата на макрофага, пептидната връзка с друг тип МНС, клас I, стимулира производството на Т CD8+ лимфоцити17. Интересното е, че CD4+ и CD8+ клетките представят един и същ модел на макрофагите по време на експеримента, дори представлявайки различни имунни отговори. Тъй като CD4+ и CD8+ клетките представляват главно Т лимфоцити, които са част от адаптивния имунен отговор, макрофагите са част от вродения имунен отговор9. В допълнение към това, ние забелязахме, че бройлерите представят по-изразителни положително маркирани зони от кокошките носачки, потвърдено от предишно проучване, при което бройлери, заразени с мутантни щамове, показват, например, по-инвазивна чревна колонизация и системна инфекция11. Нашите открития предполагат, че имунохистохимичният подход предоставя интересна информация за поведението на клетките на имунния отговор върху множество органи от различни търговски линии по време на инфекция със серовари на Salmonella enterica. Нещо повече, настоящото изследване показва, че изтриването на двата гена, дори в различни щамове на Salmonella, е довело до бактерии, които предизвикват клетка с по-висок имунен отговор в гостоприемника, което показва, че патогенът не е бил атенюиран. Можем да смятаме, че може би Salmonella е успяла да намери друг механизъм за оцеляване, като стане още по-патогенна. Използването на ttr и pdu оперони в съзвучие с cob и PRP оперони е показано в предишното проучване като необходимо за анаеробно дишане16, което ни кара да вярваме, че не само е необходимо да изтрием повече гени от всеки оперон18, но също така имаме да обмисля изтриването на целия този набор, за да достигне до по-малко патогенни щамове на Salmonella enterica.

Материали и методи

Експериментите, извършени съгласно съответните насоки и разпоредби, бяха одобрени от Комитета по етика при използването на животни на Държавния университет в Сао Пауло (CEUA/Unesp Process—006621/18; на 10 май 2018 г.), бяха проведени в патологията на птиците Лаборатория на Катедрата по патология, териогенология и едно здраве от Училището по селскостопански и ветеринарни науки, Държавен университет в Сао Пауло (FCAV/Unesp), Джаботикабал, Бразилия.

Бактериални щамове и мутантна конструкция.

Използваните тук бактериални щамове се съхраняват в криопротекторна среда, съставена от Lysogeny бульон (LB; BD DifcoTM, САЩ), допълнен с 30% глицерол (Merck, BR—H30402394 228) и се съхраняват в ултра-фризер (− 80 градуса ) в лабораторията по патология на птиците от FCAV/UNESP. Salmonella Enteritidis P125109 (номер за достъп: AM933172) и Salmonella Typhimurium str. 9819 бяха индуцирани до резистентност към налидиксова киселина и спектиномицин (Nalr Spcr) и те предоставиха генетичната основа за конструиране на мутантни щамове чрез Lambda-red техника 20 с незначителни модификации, описани в Saraiva et al.11. Конструираните тук мутантни бактерии са идентифицирани в текста като SEΔttrAΔpduA (Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA) и STMΔttrAΔpduA (Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆due).

Експеримент in vivo.

Експеримент 1—Salmonella Enteritidis. Тридесет и шест 1-дневни пилета от всяка от три различни линии (бройлери, полутежки кокошки носачки и леки кокошки носачки), общо сто и осем животни, бяха получени от търговски люпилни. При пристигането дъното на кутиите за транспортни карти беше изследвано, за да се потвърди статусът на птиците без Salmonella21 и животните бяха настанени в метални клетки в аклиматизираното помещение и получиха храна без антибиотици и вода ad libitum. През първия ден беше избрана програма за 24-h светлина, за да се осигури оптимално поглъщане на вода и храна, след което беше приета 12-h програма за светлина през първата седмица, намалявайки до 8 часа през останалите дни. Инокулумът се приготвя съгласно Berchieri Junior et al.22. За целта замразените култури се инокулират в LB и се инкубират за една нощ при 37 градуса при 150 rpm. На следващия ден бактериалните култури се прехвърлят в прясна среда и се инкубират в продължение на 18 часа при същите условия, както преди. След това 0,2 mL от културите, съдържащи 108 образуващи колонии единици на mL (CFU/mL), се инокулират орално чрез метална сонда директно в реколтата на птиците. Бяха формирани девет групи (А до I) и разделени на случаен принцип според различните линии и щамове (Таблица 7). На един, три, седем и 14-дни след заразяването (dpi), три птици на група всеки ден, до сутринта, бяха евтаназирани чрез цервикална дислокация, за да се вземе медиалната секция на сливиците на цекума, цекума, и илеум, и дисталната секция на левия дял на черния дроб за по-нататъшен имунохистохимичен (IHC) анализ. За целта пробите бяха потопени в n-хексан pa (n-Hexano pa, Synth, Бразилия), предварително охладен в течен азот. Веднага след замразяването на тъканта, тя се прехвърля в 2 ml криоепруветка (Corning, САЩ) и се кондиционира в течен азот. След вземане на проби, тъканите се съхраняват при -80 градуса до процеса за IHC.

Експеримент 2—Salmonella Typhimurium. Този експеримент беше проведен, следвайки същите характеристики, споменати по-горе в Експеримент 1. Тридесет и шест пилета (на възраст 1 ден) бяха разделени на случаен принцип в девет групи (А до I) въз основа на техните родословия и щамове (Таблица 7).

Таблица 7. Установени групи според различните линии и щамове. SE∆ttrA∆pduA, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; STM∆ttrA∆pduA, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis див тип; wt-STM, Salmonella Typhimurium див тип; NC, отрицателна контрола.

Имунохистохимия.

Тъканна секция. Събраните проби бяха прехвърлени от -80 градуса в криостат (Leica CM1860, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Германия) при -22 градуса, където бяха индивидуално блокирани в OCT съединение (Tissue-Tek®, Sakura Finetek Europe BV, Холандия) за 30 минути преди това до 6 µm секция с помощта на нископрофилни остриета за еднократна употреба (Leica 819, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Германия). Трябва да се отбележи, че срезовете са направени при -22 градуса, с изключение на чернодробните срезове, които са направени при -15 градуса. Бяха подготвени слайдове, съдържащи три повторения на разделянето на всеки орган за отбелязан отговор на имунната клетка, с изтъняване между всяко повторение. С помощта на четка за боядисване разрезите на тъканните срезове се поставят върху хистологични предметни стъкла, предварително обработени с поли-1-лизин (Sigma-Aldrich, Обединено кралство, кат. № P4832) и силан (Sigma-Aldrich, САЩ. Кат. № 440574). Слайдовете се съхраняват при -20 градуса след това до IHC оцветяване. Оцветяване на имунни клетки. Първо, предметните стъкла се потапят в 200 mL охладен ацетон (Acetone PA—ACS, Synth, Бразилия) и се инкубират при -20 градуса за 10 минути. След това предметните стъкла се прехвърлят във влажна камера (EasyPath®, Бразилия) при стайна температура за 5 минути, за да изсъхнат пробите. След това предметните стъкла се промиват с PBS и се оставя локва за 5 минути, за да се избегне дехидратация на тъканите. Десет, тъканите се потапят в 200 mL 4% H2O2 за 10 минути на тъмно място и се промиват отново с PBS. Зоната около тъканните срезове беше изсушена с абсорбираща хартия и пробата беше заобиколена от хидрофобна писалка (Dako Pen, Dako Denmark A/S, Дания). Стъпката на измиване, оставяща локва, се повтаря както преди. Комплектът без биотин Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection—Micropolymer (Abcam©, USA) беше използван за оцветяване на имунните клетки, като се избра методът Avidin-Biotin Streptavidin Peroxidase Complex (ABC). За тази цел локвата беше отстранена и към тъканите бяха добавени капчици реагент за блокиране на неспецифичен фонов цвят. Предметните стъкла се държат във влажната камера на тъмно място в продължение на 30 минути, етапът на промиване се повтаря и се добавят 200 µL първично антитяло (Mouse Anti-Chicken CD4-UNLB; Mouse Anti-Chicken CD{{34} } UNLB; Миши анти-пилешки моноцит/макрофаг-UNLB, Southern Biotech, САЩ), разреден в съотношение 1:200 (v/v) в реагент за разреждане на антитяло (Antibody diluent, Abcam©, USA) се добавя след това. Слайдовете се инкубират при 4 градуса за 18 часа. На следващия ден предметните стъкла се измиват както преди. Десет капчици от вторичното антитяло (Reveal Complement, Abcam©, САЩ) бяха добавени след отстраняване на излишния PBS и камерата за влажност беше поставена на тъмно място за 30 минути. Впоследствие капка 3,3'-диаминобензидин (DAB Chromogen 50×, Abcam©, САЩ) се разрежда в 1 mL субстрат (DAB Substrate, Abcam©, САЩ), чийто обем е достатъчен за три слайда, и се добавя към тъканните участъци. Една минута по-късно предметните стъкла се потапят в 200 mL dH2O за 5 минути. След това те се прехвърлят в пластмасов куб, съдържащ хематоксилин на Харис (Êxodo Científca, Бразилия) и се оставят за 1 минута. Отзад предметните стъкла се промиват в продължение на 10 минути под течаща вода при ниско налягане. Слайдовете бяха подложени на серията алкохол-ксилол (70% алкохол, 90% алкохол, 100% алкохол, ксилен I и ксилен II). В крайна сметка покривните стъкла бяха поставени върху предметните стъкла след добавяне на капка безводна среда за монтиране (Entellan®, Merck, Бразилия). Изображенията от тъканните срезове бяха взети на случаен принцип, като бяха избрани пет произволни зрителни полета, като се използва оптичен микроскоп (леща 400×) (Coleman®, модел N-120) с адаптер за цифрова камера, за по-нататъшен статистически анализ (фиг. 1 ).

Анализ на данни.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Процентът на CD{{0}} и CD8+ клетки и макрофаги беше изчислен с помощта на Image-Pro Plus v.4.5.0.29 (MediaCybernetics, САЩ). Те се определят количествено като процентни стойности чрез положителна площ/обща площ на имунния клетъчен маркер. Статистическият анализ и графиките бяха извършени с помощта на софтуера GraphPad Prism v.8.0.1 за macOS (софтуер GraphPad, La Jolla Калифорния, САЩ) и данните бяха изпратени на дисперсионен анализ (ANOVA), последван от множество сравнения на Bonferroni, като се има предвид ниво на значимост, по-ниско от 5% (P По-малко или равно на 0,05).

Фигура 1. Разрез на цекума на бройлери, заразен със Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA, показващ имунореакции в макрофагите, 7 дни след заразяването (×400; авидин–биотин стрептавидин пероксидаза, насрещно оцветена с хематоксилин).

Препратки

1. Freitas Neto, OC, Penha Filho, RC & Barrow, PA Източници на човешка нетифозна салмонелоза: Преглед. Браз. J. Poult. Sci. 12 (1), 1–11. https://doi.org/10.1590/S1516-635X2010000100001 (2010).

2. Winter, SE et al. Чревното възпаление осигурява респираторен акцептор на електрони за Salmonella. Nature 467, 426–429. https://doi.org/ 10.1038/nature09415 (2010).

3. Hinsley, AP & Berks, BC Специфичност на дихателните пътища, участващи в редуцирането на серни съединения от Salmonella enterica. Микробиология (четене) 148, 3631–3638. https://doi.org/10.1099/00221287-148-11-3631 (2002).

4. Tiennimitr, P. et al. Чревното възпаление позволява на Salmonella да използва етаноламин, за да се конкурира с микробиотата. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 108, 17480–17485. https://doi.org/10.1073/pnas.1107857108 (2011).

5. Staib, L. & Fuchs, TM Регулиране на използването на фукоза и 1,2-пропандиол от Salmonella enterica serovar Typhimurium. Преден. Microbiol. 6, 1116. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.01116 (2015). 6. Horswill, AR & Escalante-Semerena, JC Катаболизъм на пропионат в Salmonella Typhimurium LT2: Две дивергентно транскрибирани единици включват prp локуса при 8,5 сантизоми, prpR кодира член на сигма -54 семейството на активаторите и prpBCDE гените представляват оперон. J. Bacteriol. 179, 928–940. https://doi.org/10.1128/jb.179.3.928-940.1997 (1997).

7. Soria, MC, Soria, MA, Bueno, DJ & Terzolo, HR Сравнение на 3 метода на култивиране и PCR анализи за откриване на Salmonella Gallinarum и Salmonella Pullorum в храни за домашни птици. домашни птици. Sci. 92, 1505–1515. https://doi.org/10.3382/ps.2012-02926 (2013).

8. Van Immerseel, F. et al. Динамика на имунната клетъчна инфилтрация в lamina propria на цекума на пилета след неонатална инфекция с щам Salmonella Enteritidis. Dev. Comp. Immunol. 26, 355–364. https://doi.org/10.1016/s0145-305x(01)00084-2 (2002).

9. Montassier, HJ Fisiopatologia do sistema imune. В Doenças das Aves (eds AndreattiFilho, RL et al.) 467–489 (FACTA, 2020 г.).

10. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, TA & Roth, JR. Алтернативният акцептор на електрони тетратионат поддържа B12-зависим анаеробен растеж на Salmonella enterica serovar Typhimurium върху етаноламин или 1,{{4} }пропандиол. J. Bacteriol. 183, 2463–2475. https://doi.org/10.1128/JB.183.8.2463-2475.2001 (2001).

11. Saraiva, M. et al. Дешифриране на ролята на гените ttrA и pduA за серовари на Salmonella enterica в модел на инфекция на пилета. Птичи патол. https://doi.org/10.1080/03079457.2021.1909703 (2021).

12. Beal, RK, Wigley, P., Powers, C., Barrow, PA & Smith, AL Кръстосано-реактивните клетъчни и хуморални имунни отговори към Salmonella enterica серовари Typhimurium и Enteritidis са свързани със защита срещу хетероложно повторно предизвикване. ветеринарен лекар Immunol. Имунопатология. 114, 84–93. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2006.07.011 (2006).

13. Winter, SE & Bäumler, AJ Спиращо дъха постижение: За да се конкурира с чревната микробиота, Salmonella кара своя гостоприемник да осигури респираторен акцептор на електрони. Чревни микроби 2, 58–60. https://doi.org/10.4161/gmic.2.1.14911 (2011).

14. Ривера-Чавес, FI и др. Salmonella използва енергийни таксита, за да се възползва от чревното възпаление. PLoS Pathog. 9, e1003267. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003267 (2013).

15. Khan, CM Te Динамични взаимодействия между Salmonella и микробиотата, в рамките на предизвикателната ниша на стомашно-чревния тракт. Вътр. Sch. Рез. Не. 2014, 1–23. https://doi.org/10.1155/2014/846049 (2014).

16. Yoo, W., Kim, D., Yoon, H. & Ryu, S. Ензимът IIANtr регулира инвазията на Salmonella чрез катаболизъм на 1,2-пропандиол и пропионат. Sci. Представление 7, 44827. https://doi.org/10.1038/srep44827 (2017).

17. Salyers, AA & Whitt, DD Защита на гостоприемника срещу бактериални патогени: защита на тъканите и кръвта. В Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach (eds Salyers, AA & Whitt, DD) 16–29 (ASM Press, 1994).

18. Góes, V. et al. Salmonella Heidelberg странична загуба на ген на респираторни изисквания в модел на инфекция на пиле. Микробен патоген. 171, 105725. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2022.105725 (2022).

19. Barrow, PA, Hassan, JO & Berchieri, A. Jr. Намаляване на фекалната екскреция на Salmonella Typhimurium щам F98 при пилета, ваксинирани с живи и убити S. Typhimurium организми. Epidemiol. заразявам. 104, 413–426. https://doi.org/10.1017/s095026880 0047439 (1990).

20. Datsenko, KA & Wanner, BL Едноетапно инактивиране на хромозомни гени в Escherichia coli K-12 с помощта на PCR продукти. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 97, 6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.1201632977 (2000).

21. Zancan, FB, Berchieri Junior, A., Fernandes, SA & Gama, NMSQ Salmonella spp. изследване в транспортна кутия на еднодневни птици. Браз. J. Microbiol. 31, 230–232. https://doi.org/10.1590/S1517-83822000000300016 (2000).

22. Berchieri, A. Jr., Murphy, CK, Marston, K. & Barrow, PA Наблюдения върху устойчивостта и вертикалното предаване на Salmonella enterica serovars Pullorum и Gallinarum при пилета: Ефект на бактериална и генетична основа на гостоприемника. Птичи патол. 30, 221–231. https://doi.org/10.1080/03079450120054631 (2001).