Специфичен за пола вроден имунитет и стареене при дълголетни сладководни костенурки (Kinosternon Favescens: Kinosternidae)

Резюме

Заден план

Прогресивната дерегулация на имунната система с възрастта, наречена имуноостаряване, е добре проучена в системите на бозайници, но изследванията на имунната функция при дълголетни, диви популации, които не са бозайници, са оскъдни. В това проучване ние използваме 38-годишно проучване за повторно улавяне, за да определим количествено връзките между възрастта, пола, оцеляването, репродуктивната продукция и вродената имунна система при дългоживеещо влечуго, жълти кални костенурки (Kinosternon favescens;Testudines; Kinosternidae).

ползи от добавката Cistanche - повишава имунитета

Методи

Изчислихме процентите на преживяемост и специфичната за възрастта смъртност по пол въз основа на данни за повторно улавяне на 1530 възрастни жени и 860 възрастни мъже за 38 години улавяне. Ние анализирахме бактерицидната компетентност (BC) и два имунни отговора към чужди червени кръвни клетки - естествена антитяло-медиирана хемаглутинация (NAbs) и комплемент-медиирана способност за хемолиза (Lys) - при 200 възрастни (102 жени; 98 мъже), които варираха от На възраст от 7 до 58 години, уловени през май 2018 г. по време на излизането им от брумация и за които са налични данни за репродуктивна продукция и дългосрочно маркиране и повторно улавяне.

Резултати

Установихме, че женските са по-малки и живеят по-дълго от мъжете в тази популация, но скоростта на ускоряване на смъртността в зряла възраст е еднаква и за двата пола. За разлика от това, мъжете показват по-висок вроден имунитет от жените за всичките три имунни променливи, които измерваме. Всички имунни отговори също варират обратно пропорционално на възрастта, което показва имуносеценция. За женските, които са се размножили през предходния репродуктивен сезон, масата на яйцата (и следователно общата маса на съединителя) се е увеличила с възрастта. В допълнение към имуносеценцията на бактерицидна компетентност, женските, които са произвели по-малки съединители, също са имали по-ниска бактерицидна компетентност.

Изводи

Противно на общия модел на гръбначните животни с по-ниски имунни отговори при мъже, отколкото при жени (вероятно отразяващи потискащите ефекти на андрогените), ние открихме по-високи нива на всичките три имунни променливи при мъжете. В допълнение, противно на предишна работа, която не откри доказателства за имуносценция при боядисани костенурки или червеноухи плъзгащи се костенурки, ние открихме намаляване на бактерицидната компетентност, способността за лизиране и естествените антитела с възрастта при жълтите тинести костенурки.

Ключови думи

Вродена имунна функция, влечуги, стареене, специфични за пола, стареене

ползи от добавката Cistanche - повишава имунитета

Заден план

Стареенето в много гръбначни системи се характеризира със стареене на организма – намаляване на ефективността и изпълнението на физиологичните и клетъчните процеси [1], което води до намаляване на специфичното за възрастта оцеляване и плодовитост с напредване на възрастта [2]. Изследванията на стареенето в диви популации на гръбначни животни често се фокусират върху количественото определяне на свързаните с възрастта промени в плодовитостта и смъртността [3], но по-рядко върху физиологичните механизми, които могат да допринесат за такова демографско стареене (напр. [4–6]). Един такъв кандидат физиологичен механизъм е имунната функция, която играе критична роля за оцеляването. Доказано е, че намалената имунна функция оказва отрицателно въздействие върху оцеляването и възпроизводството [6–8]. Прогресивната дерегулация на имунната система с напредване на възрастта, наречена имуноостаряване, е добре проучена при хора както за вродените имунитети (чиято дисрегулация с възрастта може да доведе до хронично възпаление [9]), така и за придобития имунитет, където най-добре проучените промени са увеличаване на Т-клетките на паметта и намаляване на наивните Т-клетки с напредване на възрастта (но и тук имуносеценцията остава загадъчна [10]). Въпреки това, възрастово-специфичните промени в имунната система на дълголетни, диви популации, които не са бозайници, не са добре описани в литературата, а проучванията, фокусирани върху имуноостаряването на влечуги, са дори редки (прегледани в [8]). Стареенето на организмите, което води до демографско стареене в популациите, еволюирало в дивата природа. По този начин проучванията върху естествените популации са в добра позиция да разкрият еволюционно запазени процеси на стареене, които са възможни ограничения за това как протича стареенето. В същото време изучаването на организмовото и демографското стареене в дивата природа предоставя реалистични екологични контексти и разкрива степента, до която механизмите на стареене са гъвкави. По-специално, влечугите имат много характеристики, които ги препоръчват за изследване на механизмите на стареене, включително имуносеценция. Първо, те са сестрински клад на бозайниците, които заедно образуват монофилетичния клад на амниотите; имунната функция и клетъчните сигнални пътища са силно запазени при амниотите (прегледано в [11]). Второ, влечугите проявяват няколко фенотипа, които позволяват изследването на стареенето в редица физиологични и морфологични контексти, което не е възможно при повечето видове бозайници (напр. устойчивост на хипоксия, устойчивост на замръзване, отрова, броня, устойчивост на топлина, прегледано в [8 ]). С изключение на птиците, влечугите са пойкилотермични и много от тях продължават да растат като възрастни (напр. [12], но вижте [13]) и увеличават плодовитостта си с напредване на възрастта ([14–17], прегледано в [8]). Освен това много линии на влечуги имат уникални морфологични характеристики. Примери за последното включват защитни фенотипове - като външни ребрени клетки при костенурки и отрова при някои змии. Скорошни филогенетични анализи на нивата на смъртност при стареене показаха силна подкрепа за хипотезата, че линиите на влечуги със защитни фенотипове имат по-дълъг живот и по-бавно стареене от бозайниците с подобен размер, особено при костенурките [18], (вижте също [19, 20]). Наистина, сред 300 вида диви тетраподи [18], костенурките са уникални с това, че цялата линия се характеризира с видове с почти незначителна смъртност, стареене и дълъг живот – усещане, отразяващо се в плен [21]. Като се има предвид, че растежът (и следователно плодовитостта) може да продължи през целия живот на зряла възраст, селекцията срещу вредни мутации с фенотипове в късна възраст може да бъде по-силна в по-стари възрасти при костенурки и други влечуги с тези характеристики спрямо бозайниците (както в [22]). Тези черти предполагат, че имуносеценцията може да не се проявява по същия начин при влечугите в сравнение с други амниотни гръбначни животни, като бозайници или птици, и може дори да липсва поради селективен натиск върху поддържането на имунната функция с повишено възпроизводство (напр. [5]) . Тук се фокусираме върху разширяването на сравнителния пейзаж на изследванията на стареенето при костенурките, за да насърчим използването им като модели на бавно стареене. Имунната система на костенурките, подобно на други амниоти, включва вродени и придобити компоненти (прегледани в [23]), но последните анализи предполагат, че влечугите могат да разчитат в по-голяма степен на вродена защита в сравнение с бозайниците и птиците [24]. По-конкретно, въпреки че влечугите имат В и Т клетки, свързани с адаптивен имунитет, традиционният адаптивен бърз отговор при вторично излагане на патогени може да разчита в по-голяма степен на вродения имунитет [24]. Има нарастваща литература за свързаните с възрастта модели на вроден имунитет при ектотермични влечуги [4, 25–27], което предоставя първа линия на защита срещу чужди патогени. В същото време изследването на половите различия както в стареенето на организма, така и в демографското стареене се разшири до по-добро филогенетично покритие, включително влечуги [28]. Важно е, че тези изследвания са възможни в диви популации само със способността за точно възрастиране на индивидите, което изисква дългосрочно проучване за дълголетни видове ([29, 30], прегледано в [31]). Затова добавяме към тази литература, като изследваме аспекти на половата и възрастовата специфика на вродения имунитет, оцеляването, женското възпроизвеждане и връзките между тях при дългоживеещо влечуго. Използваме 38-годишно проучване за повторно улавяне на жълти кални костенурки с известна възраст (Киностернон фавесценс) за количествено определяне на връзките между възрастта, пола, оцеляването и репродуктивната продукция на вродената имунна система като интегративен подход за разбиране на имуноостаряването. Подобно на други костенурки, беше установено, че този вид старее бавно, когато половете се разглеждат заедно [18]. По-конкретно, ние оценихме три мерки за вроден имунитет – циркулиращи естествени антитела, комплемент-медиирана способност за лизиране и бактерицидна компетентност на плазмата – в нашата дългосрочна проучвана популация в Небраска (САЩ). Съгласно съществуващата парадигма за вродено имуноостаряване, ние прогнозирахме, че мерките за вроден имунитет ще намалеят с напредването на възрастта, въпреки някои доказателства за противното [5, 32].

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Резултати

През 2018 г. бяха взети проби от двеста животни за имунни променливи (N=98 мъжки, N=102 женски) и тези наблюдения включват нашите имунни данни. От тези 102 женски, 85 са възпроизведени през 2017 г. и те включват нашите репродуктивни данни за жените. И накрая, за анализа на стареенето на смъртността в популацията като цяло, използвахме нашата дългосрочна база данни от N=2380 уникални индивида с известна възраст (N=860 мъже, N=1530 жени ). В нашата извадка от индивиди с имунни данни (200 възрастни) възрастта е силно свързана с размера на тялото; по-възрастните животни са били по-големи както на маса, така и на дължина (напр. телесна маса, r=0.58, Pr.<0.0001; plastron length, r=0.60, Pr. <0.0001). Therefore body size was not included in models where age was an explanatory factor. In the immune data individuals, adult females were smaller than males and tended to be older (Table 1, Fig. S2), a result that is mirrored in the population as a whole (see Fig. 5 in [33]). Because adult females in our immune sample were significantly older than males, we z-transformed age for all analyses of innate immune function to dissociate the confound of age and sex. This allowed for a comparison of relatively old and young adult males and females.

Таблица 1 Размер, възраст и смъртност Стареене при жълти кални костенурки

В популацията като цяло жените са имали по-голяма средна и максимална продължителност на живота на възрастни (възрасти, на които 50 и 95% от възрастните са починали). Възрастните мъжки и женски костенурки показват повишаване на морала, свързано с възрастта, което показва стареене. Първоначалната смъртност при възрастни е по-висока при мъжете, отколкото при жените, но нивата на ускорение на смъртността са еквивалентни (Таблица 1, Фиг. 1). В нашата имунна подпроба от индивиди, трите мерки за вродена имунна функция са значително (положително) корелирани помежду си (естествено антитяло-медиирана хемаглутинация, комплемент-медиирана хемолиза и бактерицидна компетентност, таблица S1). Но тъй като корелациите бяха слаби (всички |r|< 0.28), we analyzed each variable separately. For all three variables, batch represents the reagents used. For bactericidal competence, five individual lyophilized pellets of Escherichia coli were used to generate control plates across the experiment; as control plates decreased in their colony count, a fresh control solution was made. For natural antibodies and cell lysis capability, two separate bottles of rabbit red blood cells were used sequentially. Significant variation among E. coli pellets and individual rabbits (that generate the red blood cells) is expected, and we controlled for it here as a batch effect in our models. All three immune variables declined with advancing age (BC and Lysis, Pr< 0.05; Nabs, Pr=0.08, Table 2, Fig. 2) and were higher in males than females (Table 2, Fig. 3). For the 85 females in our data for which we had both most-recent reproductive output and immune measures, clutch size did not change with age, whereas egg mass increased with age (Tables 3, S2, Fig. 4). Because clutch size did not change with age, a third measure of reproductive effort, total clutch mass followed the identical trend as egg mass and was not considered further. Interestingly, the three females greater than 50 years old had lower age-corrected egg mass (age>50 години), отколкото жените в следващия най-нисък възрастов интервал (N=13 възраст 40–50 години (t=2.45, Pr.=0.014)), което предполага възможността за стареене в репродуктивната продукция при много възрастни жени (виж Фиг. 4). За тези 85 репродуктивни жени, по-възрастните жени следват същата тенденция, наблюдавана при всички възрастни: намалена бактерицидна компетентност и комплемент-медиирана хемолиза с възрастта (Таблица 3, виж Фиг. 1). В допълнение, женските с по-големи съединители - независимо от възрастта - имат по-висока бактерицидна компетентност от тези с по-малки съединители (фиг. S1). За разлика от размера на съединителя, не открихме ефект на масата на яйцата върху имунната функция (данните не са показани).

Дискусия

Ползи от добавката Cistanche - как да подсилим имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Смъртност и репродуктивно стареене

Женските жълти кални костенурки живеят по-дълго от мъжките в тази популация; въпреки това, те остаряват със сходни темпове (фиг. 1), а възрастово-специфичната смъртност нараства с възрастта и при двата пола (фиг. 1), макар и бавно. Тези данни показват бавно стареене на смъртност при този вид, но не открихме доказателства за репродуктивно стареене в нашите женски проби. Малко ускоряване на възрастово-специфичната смъртност при възрастни костенурки е докладвано във филогенетичното изследване на големия тетрапод [18], както и в отделни дългосрочни проучвания за гигантски костенурки [34] и боядисани костенурки ([35, 36], но вижте [ 37, 38] и видове шарнирни костенурки [39]); въпреки това, при други видове костенурки, смъртността често остава постоянна с напредване на възрастта [40] или намалява с възрастта [3, 15, 41]. В популациите на костенурки в плен (напр. записи в зоопарковете) da Silva et al. [21] установяват, че повечето видове костенурки показват бавен или незначителен спад в смъртността с възрастта. Репродуктивното стареене при жените (т.е. намаляване на специфичната за възрастта репродуктивна продукция) не се наблюдава досега при видовете костенурки (боядисани костенурки [30], костенурки на Бландинг [15, 41], пустинни костенурки [3] и костенурки с кутия [42]) . Уорнър и колеги [30] отбелязаха намалено оцеляване при излюпване на боядисани костенурки от най-старите женски рисувани костенурки, въпреки липсата на намаляване на репродуктивната продукция. В допълнение, много репродуктивни изследвания на костенурки са показали положителни корелации между размера на съединителя, размера на яйцето и/или масата на съединителя с размера на тялото при костенурките ([43]; прегледано [44]), където размерът на тялото често е положително свързан с възрастта в костенурки (напр. настоящото изследване, [17, 32], но вижте [41]). Тези данни предполагат, че репродуктивното стареене рядко се случва при костенурките, ако изобщо се случва.

Фиг. 1 Преживяемост и специфична за възрастта смъртност при възрастни мъжки и женски K. favescens. Средната (50% жив) и максималната (5% жив) продължителност на живота е по-голяма при възрастни женски (черни пунктирани линии) жълти кални костенурки, отколкото при възрастни мъжки (сиви плътни линии). Оста Y е преживяемостта Lx за възрастни, започвайки от 11-годишна възраст. Линиите, падащи към оста x, показват специфичната за пола средна и максимална продължителност на живота в хронологична възраст. Вмъкването показва моделите на Gompertz за ускоряване на смъртността в зряла възраст; първоначалната смъртност при възрастни при мъжете е значително по-висока, отколкото при жените (повдигане на линиите), с еквивалентни увеличения (наклони на линиите) (Таблица 1). Оста Y е натурален логаритъм на специфичната за възрастта смъртност от монтирания модел на ускорение на Gompertz

Дълголетие и стареене, свързани с пола

Изследванията на половите различия в организмовото и демографското стареене остават редки при видовете, които не са бозайници. Вероятно има две причини за това: първоначалните доклади за демографията на дивите популации често обединяват данни за достатъчно мощност за оценка на ускорението на смъртността; и при много видове полът на младите екземпляри е неизвестен поради липсата на външни гениталии и трябва да разчита на развитието на вторични полови фенотипове, за да определи пола при наскоро зрели животни. В преглед на данните за дълголетие в плен, da Silva и колеги [21] съобщават, че средната продължителност на живота на възрастни мъже надвишава тази на женските с около 20%, противно на нашите резултати за жълтите кални костенурки. Въпреки това, изглежда, че по-дълголетието при женските в дивите популации на костенурки е моделът (рисувани костенурки [28, 45]), петнисти костенурки [46, 47], горски костенурки [48], картографски костенурки [49] гугри [50], костенурки [51] и червеноухи плъзгачи [52]). За разлика от това, знаем само за две проучвания, които съобщават, че мъжките костенурки надживяват женските в дивата природа (гоферови костенурки [53], но вижте [54], и популация от боядисани костенурки [36]. Необходими са допълнителни данни, но тези данните от полето контрастират с записите в плен, обобщени от [21], и предполагат възможно взаимодействие между пола и околната среда, свързано с дълголетието и стареенето.

Таблица 2 Анализ на дисперсията за имунните променливи за възрастни мъжки и женски жълти кални костенурки

Секс-специфична имунна функция

Открихме по-високи нива на имунна функция при мъже, отколкото при жени, обратното на общия модел при гръбначните [55, 56], и се предполага, че са свързани поне отчасти с потискането на имунната система от андрогени [57, 58]. Много видове костенурки са подходящи модели за този въпрос, тъй като им липсват полови хромозоми и следователно половете имат идентична геномна архитектура при зачеването. Вместо това Tey има зависимо от температурата определяне на пола (TSD), при което полът се определя от топлинната среда, преживяна по време на критичния период на ембрионалното развитие, премахвайки всякакво объркване между специфичните за пола геноми и специфичното за пола сексуално развитие [59]. López-Pérez и колеги [60] не откриха разлика в бактерицидната компетентност между мъжките и женските при вид мускусна костенурка (друга костенурка kinosternid с TSD). По същия начин Zimmerman и колегите [32, 61, 62] не откриха полова разлика в мерките за вроден имунитет при червеноухите плъзгащи се костенурки (също с TSD). Обратно, при рисуваните костенурки [5] – друг вид с TSD – се съобщава за по-висока комплемент-медиирана способност за хемолиза при мъжките и по-високи титри на естествени антитела при женските, без полов ефект върху бактерицидната компетентност. В допълнение, Фрийдбърг и колеги [63] откриха, че студените температури на инкубация, произвеждащи мъже, в друга TSD костенурка повишават имунокомпетентността при мъжките повече, отколкото при женските, но не откриха такива ефекти при тясно свързани конгенери. Въпреки че тези предварителни данни изглежда предполагат, че костенурките може да не следват общия модел на гръбначните животни на по-слаби имунни отговори при мъжете, очевидно са необходими допълнителни изследвания. Следвайки теорията на екоимунологията, която постулира асоциациите между имунната защита и стратегиите за историята на живота [64, 65], бихме очаквали по-дълголетният пол да инвестира по-сериозно в придобития спрямо вродения имунитет [66]; ограничените данни за продължителността на живота, специфични за пола, изключват цялостен тест за видовете.

растение цистанче, повишаващо имунната система

Разликите в поведението и моделите на активност могат да подложат женските жълти кални костенурки на по-голям натиск от инфекция, отколкото мъжките, което може да потисне имунната функция на жените [55, 56]. Нашият изследван вид има необичаен годишен цикъл на активност (вижте Методи). На нашия сайт за изследване възрастните мъжки излизат от брумация средно 5 дни преди женските през пролетта [Айвърсън и Грийн, непубликувани данни], остават активни във водата през юни по време на продължителните гнездови набези на женските и средно преминават към лятната естивация по-късно от жените [67]. Следователно годишният период на активност на този вид е необичайно кратък, като типичният мъжки е активен във водата може би с 25% по-дълго от типичната женска. Не е ясно обаче защо по-краткият сезон на активност на женските би ги изложил на по-голям натиск върху имунната система. Също така репродуктивната дейност се различава между мъжките и женските, като чифтосването и оплождането се случват във водния стълб, след което женските трябва да излязат от водата на сушата, за да депозират яйцата си (докато мъжките нямат такова задължително нападение на сушата) [67]. сезонни (напр. [концентрациите на циркулиращите стероиди при влечугите са високи 68, 69]) и по този начин моделът, който наблюдавахме на по-висока имунна функция при мъжките, може да се отдаде на вземането на проби само по време на пролетното поникване – т.е. много рано през сезона. Сезонните вариации в андрогените на костенурките са сравнително добре проучени и нивата на циркулиращия тестостерон при мъжките костенурки обикновено са много ниски в началото на пролетта (преглед в [69]), докато пикът е през пролетта при женските, докато се подготвят за овулация [69– 74]. Известно е, че тестостеронът потиска имунната функция ([57], но вижте [58]) и това може да обясни по-ниските имунни отговори при жените в сравнение с мъжете. Известно е обаче, че естрадиолът подобрява имунната функция [23] и обикновено е повишен при женските в началото на пролетта, последван от пик скоро след това във връзка с овулацията и яйцеполагането ([75], прегледано в [69]). По този начин, въз основа на нашето ранно пролетно вземане на проби, моделите на естрадиол и тестостерон са малко вероятни обяснения за по-ниските имунни отговори, наблюдавани при нашите жени. За съжаление, липсват ни данни за нивата на циркулиращите хормони в нашите изследвани видове, но предвид току-що описаните общи модели, въздействието на циркулиращите стероиди върху имунната функция все още не е ясно.

Фиг. 2 Вроденият имунитет намалява с възрастта при възрастни K. favescens. A Бактерицидната компетентност и B комплемент-медиираният лизис намаляват с възрастта по подобен начин за възрастни мъжки и женски жълти тинести костенурки (вижте таблица 2 за статистически резултати). Естествените антитела C (NAbs) показват същата тенденция. Във всички панели оста Y представлява остатъци от линейни модели с възраст, премахната от модела (Таблица 2). Оста X е z-трансформирана възраст с вмъкнати линии, които показват възраст в години за мъжки и женски възрастни костенурки. Регресии: BC остатъци=−{{10}}.138(zAge), R2=0.06; Остатъци от лизис=−0,01(zAge), R2=0.02; NAbs остатъци=−0,01(zAge), R2=0.01

Женска репродукция и имунна функция

Не открихме доказателства за имунна цена за женската репродукция. Нито размерът на съединителя (Таблица 3), нито масата на яйцата (данните не са показани) са повлияли отрицателно на която и да е имунна променлива. Наистина, женските, които снасят по-големи кладки яйца, имат по-висока бактерицидна способност (фиг. S1). Теорията за историята на живота прогнозира, че индивидите трябва да разпределят ресурси за черти като тези, които поддържат самоподдържането и възпроизводството, за да увеличат максимално годността си [76]. Възпроизвеждането обаче представлява значителен енергиен разход за женските и по този начин ресурсите, разпределени за възпроизвеждане, могат да дойдат за сметка на други черти [77]. Следователно може да се очаква, че жените, които инвестират много в текущата репродукция, ще изпитат компромис с текущата имунна ефективност [78]. Този компромис между репродукцията и имунната функция е изследван при други влечуги със смесени резултати. Гравидни западни сухоземни жартиерни змии (Tamnophis elegans) показват по-ниска пролиферативна способност на Т-лимфоцитите в отговор на митоген в сравнение с небременни конспецифици, но не показват разлика в БК между репродуктивните състояния [27]. За разлика от тях, бременни малки гърмящи змии (Sistrurus milarius) показват намалена способност за BC в сравнение с небременни змии [79]. Измерванията на вродения имунитет между репродуктивните състояния при рисуваните костенурки (Chrysemys picta) са зависими от възрастта [5]. По-конкретно, по-младите женски, които имат големи съединители, показват по-голяма способност за лизиране, отколкото по-възрастните жени с подобни големи размери на съединителя. Въпреки това, същото това проучване установи повишена БК при по-възрастни жени, което е в контраст с констатациите в това проучване за намаляване на имунната функция с напредване на възрастта. Освен това, независимо от възрастта, открихме, че по-големите размери на съединителя са свързани с по-висок BC и че няма ефект на възпроизвеждане върху производството на естествени антитела или способността за лизиране. Тези резултати предполагат, че компромисите между имунната функция и възпроизводството вероятно са специфични за имунния компонент.

Фиг. 3 Вроденият имунитет е значително по-висок при мъжки, отколкото при женски възрастни K. favescens. Обратно трансформирани средства на най-малкия квадрат ±1 SE за A) бактерицидна компетентност (оста y е съотношението на убитите колонии на E. coli) и B) естествени антитела (оста y е максималния титър на разреждане, при който настъпва хемаглутинация на заешки червени кръвни клетки ) и медииран от комплемента лизис (максимален титър на разреждане, при който настъпва лизис на заешки червени кръвни клетки). Звездичките представляват значителна полова разлика за дадена имунна мярка. (Вижте таблица 2 за статистически резултати). LS означава: BC=0.37, 0.62; NAbs=4.0, 4.6; Lys=8.2, 9.0

Таблица 3 Анализ на имунните променливи и репродуктивните усилия за репродуктивни женски жълти тинести костенурки

Фиг. 4 Масата на яйцето, а не размерът на съединителя, се увеличава с възрастта при възпроизвеждане на женски K. favescens. Оста Y представлява остатъците от линейния модел в таблица 3, като възрастта е премахната от модела. Остатъчна маса на яйцата=0.025 (Възраст) – 0,73, R2=0.40

Имуносесенция

От вродените имунни променливи, които изследвахме при жълти тинести костенурки, открихме доказателства за имуносесенция и при трите (фиг. 2; таблица 2). Резултатите от други проучвания са смесени. Например, по-големи (вероятно по-стари) червеноухи плъзгачи не показват промяна в BC в сравнение с по-малки индивиди [32, 61], подобно на констатациите за бактерицидна компетентност при боядисани костенурки, където възрастта е известна [5]. Последното проучване също съобщава за повишаване на хемаглутинацията при по-възрастни животни. Очевидно все още не е очевиден модел на свързани с възрастта промени във вродената имунна система при костенурките. Сред другите влечуги, различни от птиците, резултатите също са доста променливи (прегледани в [8, 26]). Например в популациите на жартиерни змии способността както за хемаглутинация, така и за хемолиза намалява при по-възрастните змии [27, 80], както и имунният отговор към митогенния фитохемаглутинин при гущерите с нашийник на Дикерсън [81]. Докато при водните питони хемаглутинацията се увеличава с възрастта [82]. Ще бъдат необходими допълнителни изследвания, за да се разбере тази вариация в посока на свързаните с възрастта промени във вродения имунитет при влечугите като цяло и конкретно при костенурките. Обратно, данните от бозайници и птици като цяло показват намаляване на имунната функция с възрастта. Освен това, в тези таксони, повечето наблюдавано имуноостаряване се случва в адаптивната имунна система [83–85] с по-слабо изразени промени, открити във вродения имунитет (прегледано в [6]), въпреки че и тук моделите не са непременно последователни в мерките за вроден имунитет [ 86]. Въпреки това, при влечугите, адаптивната имунна система реагира по-бавно на предизвикателства и не проявява стабилни реакции по време на повтаряща се експозиция на патоген (прегледано в [24, 87]). По този начин, вродената имунна функция и свързаните с възрастта промени в тази функция могат да бъдат критични за цялостното имунно здраве на влечугите.

Изводи

Тук се опитахме да разширим сравнителните съображения за вродената имуносесенция и нейните взаимодействия със смъртността и репродуктивното стареене. Избрахме отдавна проучена дива популация от (жълти кални) костенурки, за да тестваме за асоциации между тези мерки за стареене, тъй като скорошни широки сравнителни проучвания идентифицираха костенурката с изключително бавно стареене и дълъг живот. Независимо от това, измерванията на механизмите на стареене изискват известни възрасти, което е постижимо само чрез дългосрочно проучване за диви, дълголетни видове. Открихме, че смъртността и имунитетът имат специфични за пола характеристики; жените са живели по-дълго и са имали по-слаба вродена имунна функция от мъжете. Този резултат е поразителен въз основа на температурната зависимост на определянето на пола, като по този начин се изключва приносът на половите хромозоми към специфичното за пола стареене. И трите показателя за вроден имунитет намаляват с напредването на възрастта. При женските, масата на съединителя се увеличава с напредването на възрастта при жените и репродуктивната продукция не предсказва вродена имунна функция, освен че женските с по-големи съединители имат по-висока бактерицидна компетентност, което предполага липса на очевидни разходи за репродуктивни усилия за вродения имунитет при жените. Това е първото проучване, което изследва три оси на стареене при костенурки, група, характеризираща се с бавно до незначително стареене. Тези констатации относно имуноостаряването, смъртността и възпроизводството предполагат костенурките като нов модел за разбиране на механизмите на бавното стареене, или по-точно, изследването на универсалните механизми на стареене (като имуноостаряване) в монофилетична група, характеризираща се с бавно ускоряване на смъртността при възрастни и незначително репродуктивно стареене.

Методи

Вземане на проби от терен

Вземането на тъканни проби за жълтите кални костенурки (YMT) за това проучване се проведе на 20май 18 г. на езерото Gimlet на нашия дългосрочен изследователски обект в Националния резерват за диви животни Crescent Lake (CLNWR), в окръг Гардън, Небраска , САЩ (41 градуса 45.24′N, 102 градуса 26.12′W). Блатният комплекс Gimlet Lake е плитко (средна дълбочина 0,8 m), пясъчно езеро с блатни местообитания [88]. YMTs показват зависимо от температурата определяне на пола (TSD) с женски, произведени при топли условия на инкубация, а мъжки и женски, произведени при по-хладни условия [59]. От 1981 г. до 2018 г. тук се провеждат екологични проучвания за повторно улавяне и гнездене. На това място YMT обикновено зимуват на сушата, заровени в планински пясъчни хълмове в близост до влажни зони, излизат през април и май и мигрират към водата, след което повечето женски се връщат във водата същите пясъчни хълмове за гнездене през юни, въпреки че някои не се размножават всяка година [67, 87]. До юли всички костенурки започват да напускат влажните зони, за да живеят в пясъчните планини за остатъка от лятото (виж също [89]). По време на полеви сезони бяха изградени наносни огради успоредно на брега между три места за презимуване и езерото и наблюдавани непрекъснато всеки ден. През годините (включително 2017 г.), когато оградите са били поставени по време на сезона на гнездене, всяка уловена женска е била рентгенова, за да се определи размерът на съединителя, и е измерена ширината на всяко яйце на всяка рентгенова снимка. Регресионно уравнение, свързващо средната ширина на рентгеновата снимка на съединителя с действителната средна маса на яйцата от подгрупа гнезда, които впоследствие бяха изкопани, ни позволи да оценим масата на яйцата и масата на съединителя (и двете в g) за всяка бременна женска през 2017 г. (n{{24} }). Уравненията за тези отношения и ft са както следва: Действителна ширина на яйцето=0.98(Оценена ширина на яйцето)+1.52, R2=0.89; Действителна маса на яйце=0.64 (Прогнозна маса на яйце) – 6.07, R2=0.85; и в проба от N=1795 YMT яйца, събрани в продължение на няколко години, ширината на яйцето може надеждно да се използва за оценка на масата на яйцето (и следователно общата маса на съединителя) Маса на яйцето=0.68(Ширина на яйцето) – 6,77, R2=0.85 (Айвърсън, непубликувани данни). Това ни позволи да проучим ефектите от тези мерки за репродуктивна продукция върху имунитета през пролетта на 2018 г., когато тези 85 женски костенурки излязоха от брумация. Веднъж заловени, костенурките бяха транспортирани обратно в полевата лаборатория, където бяха записани морфометрични данни, включително максимална дължина на карапакса (CL в mm), максимална дължина на пластрон (PL в mm) и телесна маса (BM в g). До 0,5 ml цяла кръв се събира от цервикалния синус чрез хепаринизирана спринцовка с размер 26 и се центрофугира (7000 rpm) в криоепруветка за 5 минути, за да се разделят кръвните компоненти. Кръвната плазма се пипетира в отделна криоепруветка. Както плазмата, така и опакованите червени кръвни клетки бяха незабавно замразени в течен азот, докато бъдат транспортирани до държавния университет на Айова за съхранение при -80 градуса. Взетите проби от костенурки (98 мъжки и 102 женски) бяха транспортирани обратно до първоначалното им място за улавяне и освободени от противоположната страна на оградата, за да продължат към езерото.

Определяне на възрастта

Тъй като това проучване започна през 1981 г., възрастта в години при първоначалното улавяне на всяка костенурка беше оценена като броя на зимите след излюпването. Оценката на възрастта е една и съща всяка година и по този начин нашите методи за определяне на възрастта се прилагат за всички данни, разглеждани тук (популация и имунна подпроба). Тъй като всяка година в тази популация се произвежда само един щитовиден пръстен, възрастта на незрелите костенурки обикновено е равна на общия брой налични пръстени. Въпреки това, по време на изключително сурови години, може да няма никакъв растеж и два пръстена да се появят като един. Следователно преброяването на пръстените е минимална възраст и може да бъде подценено, ако пръстените не се преброят и оценят в контекста на общите модели на растеж на черупката в цялата популация. Чрез сравняване на модела на нарастване на растежа на костенурката на невъзрастна млада костенурка с общия модел на растеж на костенурката в популацията, възрастта при първото улавяне може да бъде надеждно определена до най-малко 12 години. Преброихме минималния брой пръстени на възрастни костенурки, уловени в ранните години на изследването, и възрастта беше оценена за всички тези костенурки, ако броят на пръстените беше по-малък от 20. Повечето костенурки обаче първоначално са били маркирани поотделно и остарели преди шестата си зима, а след това са остарели въз основа на действителния интервал на повторно улавяне. Възрастните женски бяха значително по-възрастни (и по-малки) от мъжете в нашите проби (Таблица S3; несдвоен t-тест, P=0.0003, вижте Фиг. S2 и Фиг. 5 в [33]). Следователно възрастта беше z-трансформирана в рамките на всеки пол до средно 0 с единична дисперсия. Тази променлива „възраст“ е използвана във всички статистически анализи. Изключихме данни от 26 непълнолетни.

Репродуктивен анализ

Репродуктивна продукция – размер на съединителя, обща маса на съединителя – нараства с увеличаване на размера и възрастта. Следователно, за анализите, които включват женската репродуктивна продукция заедно с възрастта в модела, ние използвахме сурови стойности на репродуктивната продукция, без да коригираме размера на тялото. Всички линейни модели бяха изпълнени в SAS v. 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, USA).

Анализ на оцеляването

Преживяемостта и специфичните за възрастта нива на смъртност на възрастни Kinosternon favescens от западна Небраска бяха оценени въз основа на модела на Gompertz (Таблица 1) [18, 90, 91], който оценява първоначалната вероятност за смъртност в началната възраст и степента на ускоряване на смъртността в цялата продължителност на живота. По-сложни модели (напр. включително постоянен термин на Makeham за независеща от възрастта смъртност, включително параметър на забавяне) не бяха подкрепени от тези данни въз основа на промяната в AIC (изчислена в пакета BaSTA R [90]). Моделирането на Gompertz беше приложено към нашия набор от дългосрочни данни за маркиране и повторно улавяне от езерото Gimlet, включително данни от 1530 индивидуални женски и 860 отделни мъжки. Възрастта на зрялост е средно 11 години и за двата пола, което е известно от дългосрочното наблюдение на възрастта и репродукцията в тази популация [88, 92, 93]. Тъй като съзряването зависи от размера, тези оценки на възрастта на зреене (т.е. 11 години) са максимални оценки (например случайна мъжка костенурка може да бъде идентифицирана на по-млада възраст). Тествахме чувствителността на използването на средна възраст на съзряване от 10 години без осезаем ефект върху оценките за продължителността на живота и смъртността при стареене (данните не са показани). Максималната и средната продължителност на живота на възрастните са изчислени като броя на годините след възрастта на първото възпроизвеждане до 95 и 50% от възрастните в синтетичната кохорта се смята, че са умрели. Наборите от данни бяха анализирани с помощта на функцията „basta“ от пакета BaSTA за R [90].

Имунни мерки

Съобщава се, че способността за медиирана от естествени антитела хемаглутинация и хемолиза (NAbs, лизис) е първата линия на защита срещу патогени при гръбначните (прегледано в [94]) и тези мерки за вродена имунна функция са изследвани при много влечуги видове (напр. [4, 5, 32, 80, 82, 95]). Завършихме анализите за NAbs и способност за лизиране съгласно анализа за хемолиза-хемаглутинация, адаптиран от [96] за използване при боядисани костенурки [5, 97]), използвайки заешки червени кръвни клетки. Използвахме две бутилки заешки червени кръвни клетки (HemoStat HemoStat Laboratories, Dixon, Калифорния, САЩ), за да завършим всички анализи. Пуснахме всички плочи с положителни и отрицателни контроли и проби в два екземпляра. По-високите титри за хемаглутинация показват по-голямо изобилие от естествени антитела в плазмената проба, тъй като високите титри са индикация, че естествените антитела са във високи концентрации дори във все по-разредена плазма [96]. По същия начин, по-високите титри за хемолиза показват, че плазмата е в състояние да лизира червените кръвни клетки дори при по-разредени концентрации [96]. По този начин повишените нива на естествени антитела и способността за лизис са свързани с повишена имунна функция. Ние оценихме бактерицидната компетентност (BC) на плазмата чрез количествено определяне на нейната способност да инхибира растежа на Escherichia coli, използвайки нашия публикуван протокол за боядисани костенурки [5, 97], адаптиран от [98]. Пет лиофилизирани пелети от E. coli (Microbiologicks, ATCC#8739) бяха използвани в настоящия експеримент, като всяка нова пелета се използваше за генериране на нов контролен разтвор, докато преминавахме през пробите. Повишената бактерицидна компетентност съответства на повишената имунна функция. Всички имунни тестове са проведени през пролетта на 2019 г. върху проби, събрани през пролетта на 2018 г.

Имунна мярка: статистически анализи

Зависимите променливи бяха анализирани с помощта на общи линейни модели с обяснителни променливи на zAge (стандартизирана възраст в рамките на всеки пол); Пол (възрастни мъже и възрастни жени); двупосочното взаимодействие между zAge и секса; и тестовата партида с променлива за неудобство (BC: N=4; NAbs и лизис: N=2), за да се отчетат контролните пелети (BC) или бутилката със заешки червени кръвни клетки (NAbs и лизис). Бактерицидната компетентност беше трансформирана в арксинус, за да отчете пропорционалните данни и да отговори на условията за нормалност. NAbs и Lysis бяха log-10 трансформирани, за да отговарят на условията за нормалност. Всички линейни модели бяха изпълнени в SAS v. 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Графиките са направени в ggplot2 [99].

Препратки

1. Харман Д. Стареене: преглед. Ann NY Acad Sci. 2001; 928: 1–21.

2. Ricklefs RE. Еволюцията на стареенето от сравнителна гледна точка. Функция Ecol. 2008; 22: 379-92.

3. Jones OR, Scheuerlein A, Salguero-Gómez R, Camarda CG, Schaible R, Casper BB, et al. Разнообразие на стареенето в Дървото на живота. Природата. 2014; 505 (7482): 169–73.

4. Schwanz L, Warner DA, McGaugh S, Di Terlizzi R, Bronikovski AM. Зависеща от състоянието физиологична поддръжка в дълголетен ектотерм, боядисаната костенурка (Chrysemys picta). J Exp Biol. 2011; 214: 88-97.

5. Judson JM, Reding DM, Bronikovski AM. Имуносесенция и нейното влияние върху репродукцията при дългоживеещи гръбначни. J Exp Biol. 2020;223:jeb223057.

6. Peters A, Delhey K, Nakagawa S, Aulsebrook A, Verhulst S. Имуносеценция при диви животни: мета-анализ и перспектива. Ecol Lett. 2019; 22: 1709–22.

7. Schmid-Hempel P. Вариация в имунната защита като въпрос на еволюционната екология. Proc R Soc B. 2003; 270 (1513): 357–66.

8. Hoekstra LA, Schwartz TS, Sparkman AM, Miller DA, Bronikovski AM. Неизползваният потенциал на биоразнообразието на влечугите за разбиране как и защо животните стареят. Функция Ecol. 2020; 34: 38-54.

9. Franceschi C, Capri M, Monti D, Giunta S, Olivieri F, Sevini F, et al. Възпаление и против възпаление: системна гледна точка за стареенето и дълголетието се появи от проучвания при хора. Mech Age Develop. 2007; 128: 92-105.

10. Pawelec G, Bronikowski AM, Cunnane SC, Ferrucci L, Franceschi C, Fülöp T, Gaudreau P, Gladyshev VN, Gonos ES, Gorbunova V, Kennedy BK, Larbi A, Lemaître JF, Liu GH, Maier AB, Morais JA, Nóbrega OT, Moskalev A, Rikkert MO, Seluanov A, Senior AM, Ukraintseva S, Vanhaelen Q, Witkowski J, Cohen AA. Ребусът на човешката имунна система е „стареенето“. Mech Age Develop. 2020;192.

11. Шварц TS, Брониковски AM. Пътища на молекулярния стрес и еволюцията на възпроизводството и стареенето при влечугите. В (T. Flatt & A. Heyland, eds.) Молекулярни механизми на еволюцията на историята на живота. Оксфорд: Oxford Univ Press; 2011. Стр. 193–209

12. Армстронг DP, Keevil MG, Rollinson NJ, Brooks RJ. Незначителните индивидуални вариации в неопределения растеж водят до значителни вариации в оцеляването и репродуктивната продукция през целия живот при дългоживеещо влечуго. Функция Ecol. 2007; 32: 752-61.

13. Omeyer LCM, Fuller WJ, Godley BJ, Snape RTE, Broderick AC. Детерминиран или неопределен растеж? Преразглеждане на стратегията за растеж на морските костенурки. Mar Ecol Prog Ser. 2018; 596: 199-211.

14. Брониковски AM, Arnold SJ. Еволюционната екология на вариациите в историята на живота в жартиерната змия Thamnophis elegans. Екология. 1999; 80: 2314–25.

15. Congdon JD, Nagle RD, Kinney OM, van Loben Sels RC. Хипотези за стареене на дълголетно гръбначно, костенурка на Бландинг (Emydoidea blandingii). Exp Gerontol. 2001; 36: 813-27.

16. Wilkinson PM, Rainwater TR, Woodward AR, Leone EH, Carter C. Определяне на растежа и продължителността на репродуктивния живот на американския алигатор (Alligator mississippiensis): доказателства от дългосрочни повторни улавяня. Копея. 2016; 104: 843–52.

17. Hoekstra LA, Weber RC, Bronikovski AM, Janzen FJ. Специфичен за пола растеж, форма и тяхното въздействие върху историята на живота на дълголетно гръбначно. Evol Ecol Res. 2018; 19 (6): 639–57.

18. Reinke BA, Cayuela H, Janzen FJ, Lemaître JF. Gaillard JM, плюс 110 други. Различните скорости на стареене при ектотермичните тетраподи дават представа за еволюцията на стареенето и дълголетието. Наука. 2022; 376: 1459–66.

19. Berkel C, Cacan E. Analysis of longevity in Chordata идентифицира видове с изключителна дълголетие сред таксоните и посочва еволюцията на по-дългия живот. биогеронтол. 2021; 22: 329-43.

20. Старк Г, Тамар К, Итеску Й, Фелдман А, Мейри С. Студени и изолирани ектотерми: двигатели на дълголетието на влечугите. Biol J Linn Soc. 2018; 125: 730-40.

21. da Silva R, Conde DA, Baudisch A, Colchero F. Бавното и незначително стареене сред Testudines предизвиква еволюционните теории за стареенето. Наука. 2022; 376: 1466-70.

22. Чарлсуърт Б. Фишър, Медавар, Хамилтън и еволюцията на стареенето. Генетика. 2000; 156: 927-31.

23. Zimmerman LM, Vogel LA, Bowden RM. Разбиране на имунната система на гръбначните: прозрения от гледна точка на влечугите. J Exp Biol. 2010; 213: 661-71.

24. Цимерман Л.М. Гледната точка на влечугите върху имунитета на гръбначните: 10 години напредък. J Exp Biol. 2020; 223 (Pt 21): jeb214171.

25. Palacios MG, Ganglof EJ, Reding DM, Bronikovski AM. Генетичният фон и топлинната среда влияят различно върху онтогенезата на имунните компоненти по време на ранния живот на ектотермично гръбначно. J Anim Ecol. 2020; 89: 1883–94.

26. Field EK, Hartzheim A, Terry J, Dawson G, Haydt N, Neuman-Lee LA. Вродена имунология и екоимунология на рептил: какво знаем и накъде отиваме? Integra Comp Biol. 2022; 62: 1557–71.

27. Паласиос MG, Брониковски AM. Имунните вариации по време на бременност предполагат специфични за имунния компонент разходи за възпроизводство при живородна змия с различни стратегии за жизнена история. J Exp Zool Част A. 2017; 327: 513–22.

28. Брониковски AM, Meisel RP, Biga PR, Walters JR, Mank JE, Larschan E, et al. Специфично за пола стареене при животните: перспектива и бъдещи насоки. Старееща клетка. 2022;21:e13542.

29. Рийд TE, Kruuk LE, Wanless S, Frederiksen M, Cunningham EJ, Harris MP. Репродуктивно стареене при дълголетна морска птица: нивата на спад в представянето в края на живота са свързани с различни разходи за ранно възпроизвеждане. Am Nat. 2008; 171: E89–E101.

30. Warner DA, Милър DA, Брониковски AM, Janzen FJ. Десетилетия полеви данни разкриват, че костенурките оцеляват в дивата природа. Proc Natl Acad Sci US A. 2016;113(23):6502–7.

31. Reinke BA, Miller DAW, Janzen FJ. Какво ни научиха дългосрочните теренни проучвания за динамиката на населението? Ann Rev Ecol Evol Sys. 2019; 50 (1): 261–78.

32. Zimmerman LM, Bowden RM, Vogel LA. Червеноухите плъзгащи се костенурки не отговарят на имунизацията с хемоцианин от лудница, но имат високи нива на естествени антитела. ISRN Zool. 2013a; 2013: 1–7.

33. Айвърсън Дж.Б. Медииран от климата неуспех в набирането в популация на костенурки и неговото отношение към северните граници на разпространение. Chelonian Cons Biol. 2022; 21 (2): 181–6.

34. Gibson CWD, Hamilton J. Популационни процеси в голямо тревопасно влечуго: гигантската костенурка от атола Алдабра. Екология. 1984; 61: 230-40.

35. Miller DAW, Janzen FJ, Fellers GM, Kleeman PM, Bronikovski AM. Биодемографията на ектотермичните тетраподи дава представа за еволюцията и пластичността на моделите на смъртност. В: Weinstein M, Lane MA, редактори. Социалност, йерархия, здраве: сравнителна биодемография. Washington DC: National Academies Press; 2014. стр. 295–313.

36. Reinke BA, Hoekstra L, Bronikovski AM, Janzen FJ, Miller DAW. Съвместна оценка на растежа и оцеляването от данни за маркиране и повторно улавяне за подобряване на оценките на стареенето в дивите популации. Екология. 2020;101(1):e02877. https://doi.org/10.1002/ecy.2877.

37. Keevil, MG 2020. Съвместна оценка на растежа и оцеляването от данни за маркиране и повторно улавяне за подобряване на оценките на стареенето в дивите популации: коментар. Екология e03232. https://doi.org/10.1002/ecy.3232.

38. Брониковски AM, Reinke BA, Hoekstra L, Janzen FJ, Miller DAW. Съвместна оценка на растежа и оцеляването от данни за маркиране и повторно улавяне за подобряване на оценките на стареенето в дивите популации: отговор. Екология. 2022:103:e03571. https://doi.org/10.1002/ecy.3571.

39. Cayuela H, Akani GC, Hema EM, Eniang EE, Amadi N, Ajong SN, et al. История на живота и зависими от възрастта процеси на смъртност при тропическите влечуги. Biol J Linn Soc. 2019; 128: 251-62. 40. Гибънс JW. Защо костенурките живеят толкова дълго? Бионаука. 1987; 37: 262-9.

41. Congdon JD, van Loben Sels RC. Връзки на репродуктивните черти и размера на тялото с достигането на полова зрялост и възраст при костенурките на Blanding (Emydoidea blandingii). J Evol Biol. 1993; 6: 547–57.

42. Милър JK. Бягство от стареенето: демографски данни от трипръстата костенурка (Terrapene Carolina Triunguis). Exp Gerontol. 2001; 36 (4–6): 829–32.

43. Moll EO. Репродуктивни цикли и адаптации. В: Harless M, Morlock H, редактори. Костенурки: перспективи и изследвания. Малабар, Флорида: Джон Уайли и синове; 1979. p. 305–20.

44. Iverson JB, Lindeman PV, Lovich J. Разбиране на репродуктивната алометрия при костенурките: хлъзгав наклон. Ecol Evol. 2019; 9: 11891–903.

45. Айвърсън Дж.Б. Chrysemys picta bellii (западна боядисана костенурка). Дълголетие. Herpetol Rev. 2022; 53: 484.

46. ​​Litzgus JD. Половите разлики в дълголетието при петнистата костенурка (Clemmys guttata). Копея. 2006; 2006: 281–8.

47. Ернст Ч. Растеж на петнистата костенурка (Clemmys guttata). J Herp. 1975; 9: 313-8.

48. Браун DJ, Schrage M, Ryan D, Moen RA, Nelson MD, Buech RR. Glyptemys insculpta (дървесна костенурка) дълголетие в дивата природа. Herpetol Rev. 2015; 46: 243–4.

49. Iverson JB, Smith GR, Rettig JE. Размер на тялото, растеж и дълголетие в северната костенурка (Graptemys geographical) в Индиана. J Herp. 2019; 53: 297-301.

50. Munscher E, Campbell K, Hauge JB, Hootman T, Osborne W, Butterfeld BP, et al. Pseudemys foridana peninsularis (полуостровна гушка) и Pseudemys nelsoni (флоридска червенокорема гушка). Дълголетие. Herpetol Rev. 2020; 51: 111–3.

51. Луис EL, Айвърсън JB. Terrapene ornata (богато украсена костенурка). Дълголетие. Herpetol Rev. 2018; 49: 530.

52. Люис EL, Айвърсън JB, Smith GR, Rettig JE. Размер на тялото и растеж на червеноухата плъзгачка (Trachemys scripta) в северния край на нейния ареал: прилага ли се правилото на Бергман? Herp Conserv Biol. 2018; 13: 700-10.

53. Curtin AJ, Zug GR, Spotila JR. Стратегии за дълголетие и растеж на пустинната костенурка (Gopherus agassizii) в две американски пустини. J Суха среда. 2009; 73: 463-71.

54. Medica PA, Nussear KE, Esque TC, Saethre MB. Дългосрочен растеж на пустинни костенурки (Gopherus agassizii) в популация на южна Невада. J Herpetol. 2012; 46: 213-20.

55. Klein SL. Хормоните и системите за чифтосване влияят на половите и видовите различия в имунната функция сред гръбначните животни. Behav Proc. 2000; 51: 149-66.

56. Клайн С.Л. Хормонални и имунологични механизми, медииращи половите различия при паразитна инфекция. Имунол срещу паразити. 2004; 26: 247-64.

57. Foo YZ, Nakagawa S, Rhodes G, Simmons LW. Ефектите на половите хормони върху имунната функция: мета-анализ. Biol Rev. 2007; 92: 551–71.

58. Кели CD, Stoehr AM, Nunn C, Smyth KN, Prokop ZM. Сексуален диморфизъм в имунитета при животни: мета-анализ. Ecol Lett. 2018; 21: 1885–94.

59. Janzen FJ, Paukstis GL. Определяне на пола в околната среда при влечуги: екология, еволюция и експериментален дизайн. Q Rev Biol. 1991;66(2):149–79.

60. López-Pérez JE, Meylan PA, Goessling JM. Базирана на пола търговия с вродена и придобита имунна система на Sternotherus minor. J Exp Zool. 2021; 333: 820-8.

61. Zimmerman LM, Paitz RT, Vogel LA, Bowden RM. Вариации в сезонните модели на вродения и адаптивен имунитет при червеноухата плъзгачка (Trachemys scripta). J Exp Biol. 2010; 213: 1477–148358.

62. Zimmerman LM, Clairardin SG, Paitz RT, Hicke JW, LaMagdeleine KA, Vogel LA и др. Хуморалните имунни отговори се поддържат с възрастта при дългоживеещите ектотерми, червеноухите плъзгащи се костенурки. J Exp Biol. 2013b; 216: 633-40.

63. Freedberg S, Greives TJ, Ewert MA, Demas GE, Beecher N, Nelson CE. Инкубационната среда влияе върху развитието на имунната система при костенурка с определяне на пола в околната среда. J Herpetol. 2008; 2008 (42): 536–41.

64. Лий К.А. Свързване на имунната защита и историята на живота на нивата на индивида и вида. Integr Comp Biol. 2006; 46: 1000–15.

65. Sheldon BC, Verhulst S. Екологична имунология: скъпи защити от паразити и търговия с в еволюционната екология. Тенденции Ecol Evol. 1996; 11: 317-21.

66. Palacios MG, Cunnick JE, Bronikovski AM. Сложното взаимодействие на условията, историята на живота и преобладаващата среда оформят имунната защита на змиите в дивата природа. Physiol Biochem Zool. 2013;86:547–58.

67. Айвърсън Дж.Б. Гнездене и родителски грижи при костенурката, Kinosternon favescens. Може ли J Zool. 1990; 68: 230-233.

68. Licht P. Ендокринни модели в репродуктивния цикъл на костенурките. Herpetologica. 1982; 38: 51-61.

69. Греъм SP, Ward CK, Walker JS, Sterrett S, Mendonça MT. Сексуален диморфизъм и сексуална вариация на репродуктивните хормони в Pascagoula Map Turtle, Graptemys gibbons. Копея. 2015; 103: 42-50.

70. Shelby JA, Mendonça MT, Horne BD, Seigel RA. Сезонни вариации в репродуктивните стероиди на мъжки и женски костенурки с жълти петна, Graptemys favimaculata. Gen Comp Endocrinol. 2000; 119: 43-51.