Sidt2 е ключов протеин в пътя на автофагия-лизозомно разграждане и е от съществено значение за поддържането на структурата на бъбреците и функцията за филтриране Ⅱ
Nov 07, 2023
ДИСКУСИЯ
Голям брой проучвания показват, че LMP участват в бъбречната функция или структурната хомеостаза [21–25]. Нашето предишно проучване установи, че LMP Sidt2 засяга възпалителния сигнален път и причинява увреждане на гломерулните мезангиални клетки на мишката [28]. В това проучване за първи път изследвахме ефектите върху структурата и функцията на бъбреците на мишката, причинени от LMP Sidt2. Установено е, че делецията на Sidt2 води до сливане на процесите на краката на бъбрека на мишка, удебеляване на базалната мембрана, оток на бъбречните тубулни епителни клетки, увреждане на микровилите и повишена протеинурия на 24-ия час, което показва, че загубата на Sidt2 води до нарушена филтрационна функция и структурата на мишия бъбрек, но подробният му механизъм не е ясен.
Тъй като LMP са важни функционални единици на лизозомата [17] илизозомна дисфункцияе един от често срещаните патогенни фактори на много хронични бъбречни заболявания (CDKs) (справки [4, 29]), ние проведохме свързани изследвания на лизозоми след делеция на Sidt2 и открихме, че броят на киселинните лизозоми е намалял и рН на лизозоми, увеличени in vitro. Въпреки това, няма очевидни промени в броя на първичните лизозоми, свързани с автофагозоми и общите лизозоми чрез електронен микроскопски анализ. Катепсините представляват най-голямата група протеолитични ензими в лизозомите [30], сред които CTSB е една от най-разпространените лизозомни протеази [31].
Тъй като катепсините трябва да бъдат подкислени за съзряване (активиране), промяната в pH в крайна сметка ще доведе до значително намаляване на разграждането на протеина [32]. In vivo и in vitro нивата показват намалена активност и съдържание на лизозомна киселинна хидролаза, което допълнително потвърждава, че Sidt2 инхибира лизозомната функция чрез повлияване на съзряването на протеазите в лизозомите.
НАТИСНЕТЕ ТУК, ЗА ДА ВЗЕМЕТЕ БИЛКОВА ФОРМУЛА НА ЦИСТАНША ЗА БЪБРЕЦИ
Междувременно лизозомата действа като център за рециклиране за разграждане на клетъчни метаболити и отпадъчни продукти в края на автофагията [1]. Нормалната функция на лизозомно разграждане е от съществено значение за аутофагията, поддържането на клетъчната хомеостаза и позволяването на клетките да оцелеят във физиологични състояния [33–36]. Доказано е, че появата и развитието на много бъбречни заболявания са свързани с анормална аутофагия [37–39]. Скорошни проучвания установиха, че Sidt2 е лизозомален ДНК/РНК транспортер. Неконвенционалните видове аутофагия чрез RNавтофагия и DNавтофагия (RDA) са важни за селективното разграждане на РНК/ДНК [40]. По-рано установихме, че делецията на Sidt2 уврежда сливането на автофагозоми и лизозоми, причинявайки увредените митохондрии да не могат да бъдат разградени, което води до увреждане на структурата и функцията на скелетните мускули [41]. Следователно, в това проучване, ние изследвахме аутофагията, когато увреждането на бъбреците е причинено от делеция на Sidt2. Ние наблюдавахме, че автофаголизозомите се натрупват в бъбреците на Sidt2−/− мишки чрез електронна микроскопия. Автофагията е динамичен процес, включващ образуването на автофагозоми и образуването и разграждането на автофаголизозомите. Образуването на ранни автофагозоми се контролира от Atg гена, а образуването на LC3-II е знак за образуване на автофагозоми [42]. Открихме, че експресиите на свързаните с аутофагията протеини Atg и LC3-II се повишават след делеция на Sidt2, което показва, че активността на аутофагията може да бъде повишена. Въпреки това, натрупването на LC3-II може също да бъде причинено от блокиране на пътя на автофаголизозомите в края на автофагията
За по-нататъшно изследване на ефекта на Sidt2 върху състоянието на бъбречна аутофагия бяха измерени експресията и образуването на карго протеин P62, а също така бяха изследвани ефектите на лекарства, насочени към аутофагия (CQ и RAPA). P62 трябва да се комбинира с LC3B и след това да се разгради в лизозомата. Повишаването на нивото на протеин P62 често представлява блокиране на потока на автофагията [43]. За да елиминираме причината за увеличаването на производството на P62, ние измерихме нивото на иРНК на P62 и открихме, че производството на P62 е намалено, така че натрупването на LC3-II вероятно се дължи на възпрепятствано разграждане. За да проучим по-нататък процеса на автофагия, проведохме експеримент с обръщане на хлорохин. Хлорохинът може да неутрализира киселинната среда на лизозомата и впоследствие да унищожи функцията на лизозомата и да инхибира автофагията [44]. Увеличаването на LC3-II протеин преди и след лечение с CQ отразява броя на автофагозомите, разградени от лизозомите, което може да отразява активността на аутофагията. Същият CQ флип тест може също да се използва за определяне на степента на разграждане на P62 през автофаголизозомния път. В съответствие с нашите резултати, изтриването на Sidt2 доведе до намаляване на потока на аутофагията поради блокирания край на аутофагията. В същото време, в експеримента RAPA, нивата на протеини LC3-II и P62 се повишават значително в групата Sidt2−/−, което може допълнително да потвърди, че липсата на Sidt2 уврежда крайната фаза на аутофагията.
Крайната фаза на автофагията включва образуването и разграждането на автофаголизозомите. Използвахме експерименти за съвместна локализация на LAMP1 и LC3B имунофлуоресценция, за да открием сливането на автофагозоми и лизозоми [45, 46] и резултатите показаха, че сливането на автофагозоми и лизозоми е блокирано след делеция на Sidt2. Експериментът за двойно маркиране Ad-mCherry-GFP-LC3B открива образуването и разграждането на автофаголизозоми [27]. Освен това се потвърждава, че блокирането на образуването и разграждането на автофаголизозомите е основната причина за увреждането на структурата и функцията на бъбреците след делеция на Sidt2.
От горните резултати можем да заключим, че отсъствието на Sidt2 причинява намаляване на броя на киселинните лизозоми и че дисфункцията на подкисляването на лизозомите засяга узряването на хидролизираните ензими. Това може да е най-важната причина за увреждане на пътя на разграждане на автофагия-лизозома в допълнение към нарушенията на автофагозомата и сливането на лизозомите. Междувременно, нарушеният процес на автофагия може да бъде тясно свързан с увредената бъбречна структура и филтърна функция след делеция на Sidt2 (фиг. 8). Нашето проучване разглежда само част от ефектите на Sidt2 върху структурата и функцията на бъбреците, но това, което е интересно е, че натрупването на ключови протеини на автофагия и увреждането на структурата и функцията на бъбреците, причинени от делецията на Sidt2, са подобни на промените в ключовите протеини на автофагията и значително повишена протеинурия, наблюдавана при диабетна нефропатия [37, 47]. Възстановяването на лизозомната функция може да бъде потенциална нова стратегия за лечение на диабетна нефропатия [37]. Очакваме, че Sidt2 ще предостави начин за изследване на патогенезата и лечението на бъбречните заболявания в бъдеще.
Изследване на протеин в урината при мишки Случайно избрани 12-седмични WT мишки и Sidt2−/− мъжки мишки бяха поставени в метаболитни клетки и гладуваха, но им беше дадена вода. Бяха събрани 24-часови проби от урина и след това тествани за протеин в урината (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, CHN, C035-2-1) (моля, вижте Допълнителните материали за подробни методи). Клетки MPC5 миши гломерулни подоцити бяха закупени от BeNa Culture Collection и култивирани с 10% FBS (Excell Bio, Южна Америка, FSP500) и DMEM с ниско съдържание на глюкоза (Sigma-Aldrich, 6046). SV40 MES 13 миши гломерулни мезангиални клетки бяха закупени от типичната клетъчна банка на комитета за съхранение на култури на Китайската академия на науките и култивирани с 10% FBS (Excell Bio, Южна Америка, FSP500) и високо глюкозен DMEM (Sigma-Aldrich, 6429) . Концентрацията на CO2 в кутията за клетъчни култури се поддържа на 5% и температурата се поддържа на 37 градуса. Хлорохин (CQ) и рапамицин (RAPA) са закупени от Sigma-Aldrich (C6628, V900930). 10 mM CQ и 25 mg/mL рапамицин бяха разтворени в ултра-чиста вода. CQ се добавя към петриевата паничка, така че крайната концентрация да е 50 μM, и се инкубира в продължение на 16 часа като инхибитор на автофагията. Рапамицин се добавя към петриевата паничка при крайна концентрация от 15 μM и се инкубира в продължение на 2 часа като активатор на автофагия. CRISPR/Cas9 редактираща гени лентивирусна векторна система беше използвана за отстраняване на гена Sidt2 Lenticrispr-v2 (AddgenePlasmid49535, Feng Zhang) бяха закупени плазмиди и инструментът за онлайн дизайн на sgRNA (http://crispr.mit.edu/) беше използван за проектиране на sgRNA, насочена към Sidt2.
Праймерните последователности бяха както следва: F: 5'-ACCACACCGTGACCC CAC-3', R: 5'-GTTGCGGGTCACTGGTGT-3', синтезирани от биотехнологична компания (Sangon Biotech, Shanghai, CHN). Използвайки лентивирусната система CRISPR/Cas9, плазмидът Lenticrispr-v2 беше линеаризиран и свързан с загрятия sgRNA дуплекс за конструиране на рекомбинантния плазмид Lenticrispr-v{{1{{180}}}} Sidt2. Трансфекционният реагент Vigofect (Vigorous Biotechnology, Пекин, CHN) беше използван за трансфектиране на плазмида Lenticrispr-v2 и рекомбинантния плазмид Lenticrispr-v2-Sidt2, за да се конструира лентивирусът. Полученият лентивирус се трансфектира в MPC5 клетки и SV40 MES 13 клетки. След 48 часа клетките се инкубират с пуриномицин в продължение на 72 часа до селекция. Оцелелите клетки бяха групата Sidt2+/+ и групата Sidt2−/−, които бяха успешно трансфектирани. Изолиране на РНК и PCR анализ в реално време Trizol (Invitrogen) беше използван за извличане на РНК от миши бъбречни клетки и специфичният RT-PCR метод беше както е описано по-рано [21]. Праймерните последователности на RT-PCR са както следва: Актин (сенс: F: 5′- GGACTCC TATGTGGGTGACG-3′, R:5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3′), P62 (сенс: F:5 ′- GGACCCATCTACAGAGGCT G-3′, R: 5′-ATCACAATGGTGGAGGGTGC-3′), Sidt2(сенс: F:5′-TAGTGCCTGTTACCACGTCTGC-3′, R:5'-GGATGCAGTCTGTG TAGAGCACA{ {48}}′). Western blotting Специфичният метод е както беше споменато по-горе [28]. В това проучване първичните антитела включват заешки анти-LC3B (1:1000; Sigma-Aldrich L7543), заешки анти-P62 (1:1000; Abcam ab205719), миши анти- -актин (1:1000; Sigma Aldrich A5316), заешки анти-Sidt2 (1:1000; Invitrogen PA5-69064), заешки анти-Atg5 (1:1000; технология за клетъчно сигнализиране 9980S), заешки анти-Atg7 (1:1000; технология за клетъчно сигнализиране 8558S) , заешки анти-Atg12 (1:1000; Cell Signaling Technology 2011S), миши анти-LAMP1 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology H4A3), заешки анти-катепсин B (1:1000; Cell Signaling Technology 31718S). Ad-mCherry-GFP-LC3B Клетките бяха инокулирани върху Nunc петриеви панички със стъклено дъно. След отглеждане до подходяща плътност се добавя Ad-mCherry-GFP-LC3B (Beyo time, Shanghai, CHN, C3011-10 mL), което води до крайна концентрация от 10 -11 vp/mL. След стимулиране в продължение на 48 часа, броят на mCherry и GFP флуоресцентни точки се наблюдава директно под лазерния конфокален микроскоп (Leica SP8, Германия). Имунофлуоресценция Клетките се инокулират върху петриеви панички със стъклено дъно и се фиксират с параформалдехид. След блокиране, клетките се инкубират за една нощ с първично антитяло и след това се инкубират с вторично антитяло за 90 минути на тъмно. Клетките бяха фотографирани с помощта на лазерно сканиращ конфокален микроскоп (Leica SP8, Германия) след боядисване на ядрата с DAPI (1 ug/mL). Първичните антитела включват P62 (1:200; Abcam ab205719), LAMP1 (1:200; Santa Cruz Biotechnology H4A3), LC3B (1:200; Sigma-Aldrich L7543); вторични антитела включват анти-миши вторични анти Cy3-конюгирани Affinipure кози анти-миши IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00009-1), CoraLite488-конюгирани Affinipure кози анти-миши IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00013-1), CoraLite594- конюгиран Affinipure кози анти-заешки IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA{{144 }}). За LysoTracker (Beyotime, Shanghai, CHN, C1046), ние също инокулирахме клетките върху петриеви панички със стъклено дъно. След отглеждане до подходяща плътност, към клетките се добавя течност от клетъчна култура, съдържаща крайна концентрация на LysoTracker от 75 nM, които се фотографират след 45 m стимулация. Използвайте ImageJ, за да преброите броя на флуоресцентните точки и корелационния коефициент на Pearson. Наблюдения с трансмисионен електронен микроскоп От всяка група, 3−5 12-седмични мъжки мишки Sidt2−/− и WT бяха избрани на случаен принцип, за да се подготвят проби за електронна микроскопия от бъбречната тъкан и специфичният метод е както е описано по-рано [48] , направете на случаен принцип снимки на срезовете с помощта на електронен микроскоп, има повече от 10 снимки, направени от срезове на бъбреците за всяка мишка, изберете на случаен принцип 3–5 снимки с 8000 × увеличение от снимките с електронен микроскоп на всяка мишка, изчислете броя на автофаголизозомите на снимката и сравнете групата Sidt2−/− с групата WT. По отношение на подготовката на проби от клетъчен електронен микроскоп, изстържете не по-малко от 105 клетки със скрепер за клетки и ги съберете в EP епруветка, след това центрофугирайте при 800 rpm/min за 5 m, изхвърлете супернатантата и я напълнете с фиксатора за електронен микроскоп. След съхранение в 4 градусов хладилник за повече от 1 час може да се предостави за проверка. Снимката с електронен микроскоп е направена от KingMed Diagnostics (Гуанджоу, Китай). LysoSensor Клетките се инокулират върху 96-ямкова плака. След нарастване до подходяща плътност се добавя предварително загрята (37 градуса) среда, съдържаща 1 µM LysoSensorDND-160® (Thermo Fisher L7545). Клетките се инкубират в продължение на 5 минути при 37 градуса и след това средата се отстранява и заменя след промиване на клетките три пъти с PBS. Режимът WellScan беше използван за четене на плаката в BioTek Citation 5 (BioTek, Winooski, VT, САЩ). Флуоресценцията беше измерена с помощта на Ex360nm/Em450nm и Ex380nm/Em540nm дължини на вълната на възбуждане/излъчване и рН на лизозомата беше определено от съотношението на Em540 към Em450. Статистически анализ Резултатите бяха изразени като средна стойност ± SEM. Статистическото сравнение между две групи беше извършено с помощта на несдвоени t-тестове. Когато софтуерът Graphics 8.0 е използван за статистически анализ, P <0,05 се счита за статистически значимо. Всяка група от експерименти в това изследване се повтаря поне три пъти независимо. НАЛИЧНОСТ НА ДАННИ Наборите от данни, генерирани и/или анализирани по време на настоящото проучване, са достъпни от съответния автор при разумно искане.
ПРЕПРАТКИ
1. Settembre C, Fraldi A, Medina DL, Ballabio A. Сигнали от лизозомата: контролен център за клетъчен клирънс и енергиен метаболизъм. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013; 14: 283–96.
2. Lamming DW, Bar-Peled L. Лизозома: Метаболитният сигнален център. Трафик. 2019; 20: 27-38.
3. Ballabio A. Страхотната лизозома. EMBO Mol Med. 2016; 8: 73–76.
4. Yamamoto T, Takabatake Y, Takahashi A, Kimura T, Namba T, Matsuda J, et al. Предизвиканата от диета с високо съдържание на мазнини лизозомна дисфункция и нарушен автофагичен поток допринасят за липотоксичност в бъбреците. J Am Soc Nephrol. 2017; 28: 1534–51.
5. Nonclercq D, Wrona S, Toubeau G, Zanen J, Heuson-Stiennon JA, Schaudies RP, et al. Тубулно увреждане и регенерация в бъбрек на плъх след остра експозиция на гентамицин: проучване във времето. Рен Фейл. 1992; 14: 507-21.
Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:
Имейл:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/телефон:+86 15292862950
Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
