Симулираната микрогравитация влияе върху свързаните с имунитета биомаркери при рак на белия дроб
Aug 10, 2023
Резюме: Микрогравитацията е нова стратегия, която може да послужи като допълнителен инструмент за разработване на бъдещи терапии за рак. При рак на белия дроб влиянието на микрогравитацията върху клетъчните процеси и миграционния капацитет на клетките е добре разгледано. Въпреки това, ефектът му върху механизмите, които движат прогресията на белодробния рак, остава в начален стадий. В това проучване е показано, че 13 диференциално експресирани гена са свързани с прогнозата за рак на белия дроб при симулирана микрогравитация (SMG). Използвайки анализ на обогатяване на набор от гени, тези гени са обогатени в пътища на хуморален имунитет. Вместо това, алвеоларните базално-епителни (A549) клетки бяха изложени на SMG чрез 2D система clinostat in vitro. В допълнение към промяната на морфологията и намаляването на скоростта на пролиферация, SMG върна фенотипа на епителен към мезенхимален преход (EMT) на A549, ключов механизъм в прогресията на рака. Това се доказва чрез повишена експресия на епителен Е-кадхерин и намалена експресия на мезенхимален N-кадхерин, следователно проявявайки по-малко метастатично състояние. Интересното е, че наблюдавахме повишена експресия на FCGBP, BPIFB, F5, CST1 и CFB и тяхната корелация с EMT под SMG, което ги прави потенциални туморни супресорни биомаркери. Заедно тези открития разкриват нови възможности за създаване на нови терапевтични стратегии за лечение на рак на белия дроб.
Ключови думи: симулирана микрогравитация; EMT; рак на белия дроб; метастази; туморен супресор; биомаркер
Ефекти на билката цистанче-противотуморно
1. Въведение
Космосът е известен с липсата на гравитационен вектор, който засяга тялото на ниво органи, тъкани и клетки. Микрогравитацията, състояние на привидна безтегловност, е значителен космически стресор, за който е известно, че оказва значително влияние върху човешкото здраве, като загуба на костна маса, мускулна атрофия и сърдечно декондициониране [1,2]. Въздействието на микрогравитацията върху раковите клетки също е нарастващ фокус на интерес в изследванията на космоса и рака. Доказано е, че микрогравитацията потиска активността на имунните клетки и нарушава системите на множество тела, което може да увеличи риска от развитие на рак [2–4]. Поради тези очевидни здравословни проблеми микрогравитационната среда даде възможност на изследователите да проучат биофизичните механизми, повлияни от микрогравитацията, и помогна за откриването на терапии за невродегенеративни разстройства, имунотерапии и потенциално по-добри и по-насочени противоракови терапии [4–6]. Многобройни проучвания са добре документирали и прегледали голямото значение, което микрогравитацията има върху клетъчната прогресия, пролиферацията и апоптозата в безброй туморни клетъчни линии, включително рак на белия дроб [7–12]. Въпреки това, много други изследвания, включващи микрогравитация, показват, че предизвикват промени в генната експресия, които участват в пролиферацията на раковите клетки, метастазите и оцеляването, измествайки клетките към по-малко агресивен фенотип [13,14]. Това може да хвърли светлина върху нови разбирания за биологията и диагностиката на тумора, като по този начин подчертава микрогравитацията като иновативен инструмент за откриване на нови цели с надеждата за разработване на нови изследователски подходи и подобряване на терапевтичните стратегии. Ракът на белия дроб, с недребноклетъчен рак на белия дроб (NSCLC) като най-известен тип, е водеща причина за смърт, представлява 12% от всички ракови заболявания и е най-често диагностицираният рак [15]. В проучвания, включващи микрогравитация, които могат да ни насочат към по-добро разбиране на канцерогенния процес, беше показано, че клетките на рак на белия дроб губят стволовите си клетки след излагане на микрогравитация, като по този начин засягат растежа и функцията на раковите клетки [11]. Проучване на Ahn et al. показват, че излагането на ракови клетки на белия дроб (A549) на микрогравитация предизвиква бърза миграция и пролиферация. Това се обяснява с повишените нива на матрични металопротеази (MMP-2 и MMP-9) при микрогравитация, като по този начин играе решаваща роля в инвазията и миграцията на рака [10]. В друго проучване Chung et al. установиха, че симулираната микрогравитация не повлиява значително пролиферацията на белодробни ракови клетки, а по-скоро увеличава миграцията в сравнение с контролната група при нормална гравитация [16]. Напротив, Chang et al. показват намаляване на миграцията в клетъчната линия A549 на рак на белия дроб след 24 часа излагане на условия на микрогравитация [17]. Въпреки значителните ефекти на микрогравитацията върху клетъчното поведение, което включва апоптоза, миграция и инвазивност, нейният ефект върху рака на белия дроб все още не е напълно изяснен. Добре установено е, че епителните клетки претърпяват няколко биохимични промени, за да установят мезенхимален фенотип, който повишава устойчивостта на апоптоза, инвазивността и миграционните способности. Такъв биологичен процес е известен като преход от епител към мезенхим (EMT), отличителен белег на прогресията на рака [18]. Връзката на ЕМТ с прогресията на рака е добре обсъдена. Известно е, че туморите активират ЕМТ чрез регулиране на транскрипционните фактори, експресиране на протеини на клетъчната повърхност и производство на ECM-разграждащи ензими. След като ЕМТ се активира, туморните клетки губят своята клетъчно-клетъчна адхезия и придобиват миграционни и инвазивни свойства [19]. Само две проучвания показват, че симулираната микрогравитация индуцира преходен епителен към мезенхимален преход (EMT) в кератиноцитите [9]. В допълнение, такива явления бяха подчертани в MCF-7 клетки и HUVEC [20]; обаче, нито едно проучване не е фокусирано върху ефекта на микрогравитацията върху ЕМТ при рак на белия дроб. Въпреки многото важни открития, направени относно способността на микрогравитацията да модулира туморогенни и метастатични процеси на рак, точните механизми, управлявани от микрогравитационния град, остават сравнително неизвестни, което прави отворени въпроси относно адаптивните промени, които се случват на молекулярно ниво. В това проучване ние идентифицирахме сигнатура на свързани с имунитета гени (FCGBP, BPIFB1, F5, CFB и CST1), които значително показват повишена експресия на mRNA в A549 клетки под ефекта на симулирана микрогравитация (SMG). В допълнение, ние оценихме приноса на SMG в прогресията на рак на A549 чрез регулиране на EMT. FCGBP, BPIFB1, F5, CFB и CST1 и тяхната корелация с ключовите маркери на EMT показват потенциално по-малко метастатичен фенотип на рак на белия дроб при SMG. Констатациите от това проучване предоставят основа за бъдещи изследвания, които са необходими за идентифициране на основните механизми, които ще развият нашето разбиране и ще помогнат за разработването на нови терапевтични стратегии за лечение на рак на белия дроб.
Ползи от cistanche tubulosa-антитуморен
2. Резултати
2.1. Топ често срещани диференциално експресирани гени, идентифицирани в белодробни ракови клетки при симулирана микрогравитация (SMG) в сравнение с земната гравитация (GG)
За да идентифицираме гени, участващи в рак на белия дроб при симулирана микрогравитация (SMG), ние първоначално изследвахме гени, които са различно експресирани при SMG в сравнение с наземната гравитация (GG) за рак на белия дроб при човека, използвайки публично достъпната база данни Gene Expression Omnibus (GEO). Бяха избрани два набора от данни, GSE78210 и GSE36931, които включват генна експресия за две различни човешки клетъчни линии на рак на белия дроб, A549 и Colo699, култивирани в условия на 2D и 3D клетъчна култура. Разликите в профилите на генетична експресия между SMG и GG проби бяха представени в графики на вулкани (Фигура 1). Идентифицираните диференциално експресирани гени (DEG; Фигура 2) за всеки набор от данни бяха разделени на тези, които са регулирани нагоре при рак на белия дроб (21 гена в A549 и 29 гена в Colo699 от набора от данни GSE78210 и 47 гена в A549 от набора от данни GSE36931) и тези които са регулиран надолу I рак на белия дроб (40 гена в A549 и 27 гена Colo699 от набора от данни GSE78210 и 87 гена в A549 от набора от данни GSE36931), както е представено в таблица 1. Тринадесет DEG са значително силно експресирани в A549 клетки от наборите от данни GSE78210 и GSE36931 в SMG в сравнение със състоянието GG. Най-често срещаните гени бяха идентифицирани с помощта на уеб инструмента InteractiVienn (Фигура 2A). Кандидат-гените включват AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP и BPIFA1. За да се установи дали идентифицираните DEG участват в общи пътища, кандидат-гените бяха качени в Metascape (http://metascape.org; достъпен на 11 ноември 2021 г.). Интересното е, че тези гени са обогатени с пътища, включващи хуморален имунен отговор и регулирана екзоцитоза (Фигура 2В).
Фигура 1. Диаграма на вулкан, показваща диференциално експресирани гени (DEGs) с помощта на GEO Omnibus. (A) Диаграма на вулкан, показваща DEG под SMG и GG ефекти в A549 клетки, използвайки (A) GSE78210 и (B) GSE36931 набори от данни. (C) Диаграма на вулкан, показваща DEG под SMG и GG ефекти в клетъчна линия Colo699, използвайки набор от данни GSE78210. Червеният цвят показва гени с повишена регулация, докато синият цвят показва гени с понижена регулация.
Таблица 1. Общи гени, които са различно експресирани при SMG в сравнение с GG в клетъчни линии A549 и Colo699 на рак на белия дроб. Всеки набор от данни имаше промени на гънките, коригирани за извличане на най-добрите 5% от DEG. За GSE36931 промяната на сгъването (FC) беше коригирана, за да включва само гени с FC по-голяма или равна на 4 или по-малка или равна на -4. За GSE78210 FC беше коригиран, за да включва само гени с FC по-голям или равен на 3 или по-малък или равен на -3.
Фигура 2. Тринадесет често споделяни DEG между набори от данни GSE78210 и GSE36931 при рак на белия дроб. (A) Диаграма на Venn, показваща 134 DEG в GSE36931 (клетъчна линия A549), 61 DEG в GSE78210 (клетъчна линия A549) и 56 DEG в GSE78210 (клетъчна линия Colo699) при условия на SMG в сравнение с GG. От общо идентифицираните 251 гена беше установено, че 13 DEG са общи между двата набора от данни, GSE78210 и GSE36931, в клетъчната линия A549. Диаграмата на Venn е генерирана с помощта на InteractiVinn.
2.2. Диференциално експресираните гени, свързани с клиничната прогноза на пациентите с белодробен аденокарцином
Диференциално експресираните гени, корелирани с клиничната прогноза на пациентите с белодробен аденокарцином За да се оцени клиничната прогностична стойност на кандидат-гените при пациенти с белодробен аденокарцином, график на Kaplan–Meier (http://www.kmplot.com/; достъпен на 11 ноември 2{ {44}}21) беше използван за сравняване на общата преживяемост (OS) на пациенти с белодробен аденокарцином (LUAD) с висока/средна спрямо ниска експресия на кандидат гени (Фигура 3). Високи нива на експресия на mRNA на NOX1 (коефициент на риск (HR), 1,45; 95% доверителен интервал (CI), 1,11–1,9; p=0.0058), GDA (HR , 1,74; 95% CI, 1,33–2,26; p=3.2e-05), TCN1 (HR, 1,62; 95% CI, 1,26–2,08; p=0.00014), и BPIFA1 (HR, 1,44; 95% CI, 1,12–1,84; p=0.0026) са наблюдавани като значително свързани с лоша прогноза (Фигура 3A–D). От друга страна, високите нива на експресия на mRNA на FCGBP (HR, 0,63; 95% CI, 0,46–0,85; p=0.0026) са свързани с по-добра прогноза и по-висока обща преживяемост при пациенти с LUAD (Фигура 3E). Няма значима корелация между иРНК
Фигура 3. FCGBP, CST1, F5, CFB и BPIFB1, свързани с клиничната прогноза на пациенти с белодробен аденокарцином. Криви на оцеляване на Kaplan-Meier на нивата на експресия на mRNA на кандидат-гени: (A)NOX1; (B) GDA; (C) TCN1; (D) PLUNC; (E) FCGBP; (F) AZGP1; (G) H2Bf; (H) B7X; (I) AGR3; (J) CEACAM6; (K) F5; (L) BPIFB1; и (M) CST1 при пациенти с белодробен аденокарцином. HR: коефициент на опасност.
Ползи от добавка Cistanche-Антитумор
Щракнете тук, за да видите продуктите на Cistanche
【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2.3. Експресия на FCGBP, BPIFB1, F5, CFB и CST1 в A549 клетки след симулирана микрогравитация
За валидиране на експресията на идентифицираните in silico гени (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP и BPIFA1), беше извършено приложение in vitro с помощта на qRT-PCR. Интересно е, че използвайки qRT-PCR, нашите данни показват значително повишаване на експресията на FCGBP mRNA, по-специално на 48 и 72 h в A549 клетки, след SMG в сравнение с GG (Фигура 4А). В допълнение, експресиите на mRNA на CFB, F5 и BPIFB1 бяха значително повишени на 72 часа след SMG и в сравнение с GG в A549 клетки (Фигура 4B, C, E). Леко увеличение, макар и незначително, в експресията на mRNA беше открито за CTS1 при SMG условия в сравнение с GG (Фигура 4D). Експресиите на AZGP1, AGR3, GDA, VTCN1, BPIFA1, NOX1, CEACAM5 и TCN1 бяха неопределени както за SMG, така и за GG (данните не са показани).
Фигура 4. Регулиране нагоре на FCGBP, CST1, F5, CFB и BPIFB1 при SMG условия in vitro. Нива на експресия на mRNA на (A) FCGBP, (B) CFB, (C) F5, (D) CTS1 и (E) BPIFB1, количествено определени чрез qRT-PCR и нормализирани към GAPDH в A549 клетки, подложени на GG и SMG условия за 24 , 48 и 72 часа. Стълбовидните графики показват резултатите от 3 независими експеримента (n=3). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 и **** p < 0,0001.
Като цяло, тези данни предполагат, че диференциално експресираните FCGBP, F5, CFB и BPIFB1 при рак на белия дроб могат да играят важна роля в прогресията на рака на белия дроб.
2.4. Симулираната микрогравитация намалява жизнеспособността на клетките и обръща прехода от епител към мезенхим в A549 клетъчна линия на рак на белия дроб
За да се изследва дали SMG влияе върху потенциала на пролиферация на A549 клетки, беше извършен анализ на клетъчната жизнеспособност, като се използва тест за изключване на трипаново синьо. Нашите данни разкриха, че SMG значително индуцира зависимо от времето намаляване на клетъчната пролиферация (Фигура 5B). Намаляването на клетъчната пролиферация е значително главно след 48 и 72 часа след SMG в сравнение с GG, което показва увеличение на клетъчната пролиферация на A549 клетки. Успоредно с това, промяна в клетъчната морфология беше открита в A549 клетки под SMG. За да се оценят тези промени, клетките се отстраняват от състоянието на SMG, посяват се върху 24-плаки с ямки и се наблюдават под светлинен микроскоп след 1 час от прилагането на SMG. Интересното е, че клетките, изложени на SMG, разкриват гранулирана, натрупана морфология след SMG. (Фигура 5А).
Фигура 5. Симулираната микрогравитация намалява жизнеспособността на клетките и предизвиква морфологични промени в клетките A549 по начин, зависим от времето. (A) Представителни микрографии на родителски A549 клетки (GG) и A549 клетки, подложени на SMG за 24, 48 и 72 часа преди засяването им обратно за 1 час под GG. Изображенията са направени при увеличение 10X. (B) Клетъчната жизнеспособност на A549 клетки се оценява с помощта на тест за изключване на трипаново синьо багрило. Средната клетъчна жизнеспособност на 3 независими експеримента се показва като процентна контрола. **** p < 0.0001. Фигура 5. Симулираната микрогравитация намалява жизнеспособността на клетките и предизвиква морфологични промени в клетките A549 по начин, зависим от времето. (A) Представителни микрографии на родителски A549 клетки (GG) и A549 клетки, подложени на SMG за 24, 48 и 72 часа преди засяването им обратно за 1 час под GG. Изображенията са направени при 10-кратно увеличение. (B) Клетъчната жизнеспособност на A549 клетки се оценява с помощта на тест за изключване на трипаново синьо багрило. Средната клетъчна жизнеспособност на 3 независими експеримента се показва като процентна контрола. **** p < 0,0001.
Китайска билка растение цистанче-Противотуморно
За да разберем получените данни за намалена клетъчна пролиферация в A549, ние оценихме приноса на SMG към механизма на преход от епител към мезенхим (EMT). ЕМТ е отличителен белег и важен механизъм, който задвижва прогресията на рака и метастазите, като по този начин подобрява неговата клетъчна подвижност и инвазивни свойства [19]. Ключови EMT маркери (E-cadherin, N-cadherin, ZO-1 и Snail) и нивата на експресия на мРНК на металопротеинази MMP{-2 и MMP-9 бяха измерени чрез qRT-PCR в A549, под както GG, така и SMG (Фигура 6). При прилагане на SMG се наблюдава значително увеличение на експресията на mRNA на E-cadherin, успоредно със значително намаляване на експресията на mRNA на N-cadherin, на 48 и 72 h след SMG (Фигура 6A, B). Незначително увеличение на ZO-1 и MMP-9 и намаление на транскрипционния фактор на охлюв бяха открити при SMG (Фигура 6C–E). MMP-2 е значително намален в A549 на 48 часа след SMG (Фигура 6F), което показва по-малко инвазивна форма. Взети заедно, тези данни подкрепят фенотип на мезенхимно-епителен преход (MET), индуциран от SMG в A549.
Фигура 6
2.5. Пътят на преход от епител към мезенхим корелира с експресията на FCGBP, BPIFB1, F5, CFB и CST1
За да се получи по-нататъшна механистична представа за потенциалната роля на идентифицираните гени в A549 и тяхната възможна корелация с EMT при условия на SMG, беше проведен анализ на взаимодействието между гени с помощта на GeneMANIA срещу EMT генни маркери. Фигура 7 показва генните взаимодействия, начертани между EMT гените E-cadherin (CDH1), N-cadherin (CDH2), TJP1, CTNNB1, SNAI1 (Snail), ZO-1 и -catenin, съответно. Знаейки тяхната значителна роля в инвазията и миграцията на рака, металопротеиназите MMP-2 и MMP-9 също бяха включени в анализа. Възлите идентифицират модели на ко-експресия между гените с различна сила на базата на дебелината на възела. Кандидат-гените показват известна степен на ко-експресия помежду си; BPIFB1 се експресира съвместно с CFB и CST1; FCGBP се експресира съвместно с F5, CST1 и CFB; CST1 е ко-експресиран с CFB, а F5 е ко-експресиран с CFB, CST1 и BPIFB1. Ко-експресионните възли също бяха идентифицирани между EMT гените и кандидат гените; CDH1 се експресира съвместно с FCGBP и F5; CDH2 се експресира съвместно с F5, CST1, BPIFB1 и FCGBP; CTNNB1 се експресира съвместно с CST1 и FCGBP; SNAI1 се експресира съвместно с CST1, F5 и BPIFB1; TPJ1 се експресира съвместно с CST1, FCGBP и F5; CTNNB1 се експресира съвместно с CST1 и FCGBP; MMP2 се експресира съвместно с BPIFB1 и CST1; и MMP9 се коекспресира с F5, CST1, FCGBP и CFB. Тези констатации предполагат значителна корелация между новите идентифицирани гени и EMT маркери при SMG условия, вероятно свързани с EMT пътища.
Фигура 7. FCGBP, CST1, F5, CFB и BPIFB1 корелират с пътя на ЕМТ. Мрежа за взаимодействие ген-ген на избрани кандидат-гени; FCGBP, CST1, F5, CFB и BPIFB1 с EMT гени; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 и SNAI1, както и свързаните с клетъчната миграция гени MMP2 и MMP9, генерирани от GeneMANIA (http://genemania.org/; достъп на 11 ноември 2021 г.) за идентифициране на взаимодействията между кандидат-гените с EMT и маркери за клетъчна миграция. Различните цветове на ръба на мрежата показват приложените биоинформатични методи: прогнозиране на уебсайт (оранжево), физически взаимодействия (червено), ко-експресия (лилаво), споделени протеинови домейни (кафяво), път (светло синьо), съвместна локализация (тъмно синьо) и генетични взаимодействия (зелено)
3. Дискусия
Чай от цистанче
Дискусия Ракът на белия дроб, едно от значимите и застрашаващи света заболявания, напоследък привлече много внимание в "Космическите изследвания". Въпреки напредъка в тази област обаче, прогресията на рака на белия дроб и отговорът му към лечението остават противоречиви поради липсата на окончателни стратегии за оценка, които помагат при превенцията или лечението на рак [21]. Доколкото ни е известно, това е първият доклад, който идентифицира набор от гени като подпис към прогресията на рак на белия дроб при механична среда, предизвикана от симулирана микрогравитация (SMG). Ние подчертаваме повишената експресия на свързаните с имунния отговор гени FCGBP, BPIFB, F5, CST1 и CFB и тяхната корелация с епителен към мезенхимален преход (EMT) при SMG, което ги прави потенциални биомаркери за прогресия на рак на белия дроб. Тук ние също така подчертаваме ефекта на индуцираната SMG върху регулирането на EMT, отличителен белег на прогресията на рака [18,22], в подкрепа на фенотип на мезенхимален към епителен преход (MET). Като цяло, това проучване предлага основата за свързване на идентифицираните гени с EMT; въпреки това са необходими допълнителни изследвания, за да се разкрият точните механизми, които помагат при разработването на нова таргетна терапия за рак на белия дроб. В това проучване ние показахме тринадесет гена (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP и BPIFA1), които да бъдат значително експресирани в рак на белия дроб при симулирана микрогравитация (SMG) като в сравнение със земната гравитация в silico. Нашите данни показват, че тези диференциално експресирани гени са обогатени в пътища, свързани главно с хуморален имунитет и регулирана екзоцитоза. Интерес паралелно с нашите открития, въпреки че основната функция на FCGBP все още е неясна [23]. Това може да се дължи отчасти на противоречивите роли, които проявява в различни тумори [25]. Например, доказано е, че FCGBP е значително свързан с по-добра цялостна прогноза и специфична за заболяването преживяемост при пациенти с рак на главата и шията, рак на дебелото черво и остеосарком [25–27], докато при рак на яйчниците и простатата високата експресия на FCGBP се свързва с по-лоша обща преживяемост [28]. Трябва да се отбележи, че ролята на ролята на FCGBP се приписва на имунните защитни механизми, противовъзпалителните реакции, както и клетъчната защита [29, 30], което го прави важен прогностичен маркер [31]. Използвайки in vitro приложения, ние оценихме експресията на идентифицираните гени при рак на белия дроб и при условия на SMG чрез 2D клиностат. Има широк избор от видове клиностат и други микрогравитационни платформи, които са разработени. Те включват 1/2/3 D системи за клиностат, машини за произволно позициониране, оборудвани с стъклени колби (главно за ракови клетки на щитовидната жлеза) и разработени от НАСА съдове с въртяща се стена. Всеки от тях е проектиран да служи на определена изследователска цел, като някои са предназначени за култивиране на прилепнали или суспензионни клетки, а други се използват за онлайн измерване на кинетични реакции. Трябва да се отбележи, че клиностатът е една от най-простите и адаптивни платформи, използвани от различни експериментални приложения. По принцип 2D клиностатът се характеризира с ос на въртене, която се върти непрекъснато с регулирана постоянна скорост и в посока, която е перпендикулярна на посоката на вектора на гравитацията на Земята, като по този начин създава центробежни сили, които имитират истинската микрогравитация [14,32,33]. ]. Интересното е, че от тринадесетте гена, FCGBP, BPIFB, F5, CST1 и CFB експресиите значително се увеличават в отговор на 2D клиностат-индуциран SMG в A549 клетки. Експресиите на FCGBP и BPIFB бяха най-засегнати, показвайки значително увеличение във всички оценени времеви точки: 24, 48 и 72 часа след SMG. Подобно на FCGBP, известно е, че BPIFB1 допринася за отговорите на вродения имунитет [34]. BPI гънката, съдържаща протеин от член 1 на семейство B (BPIFB1), който се произвежда основно от епитела на дихателните пътища, е доказано, че участва в защитните механизми на гостоприемника, заедно с бактерицидни и противовъзпалителни ефекти [35]. При респираторни заболявания е показано, че BPIFB1 проявява антитуморни и антиметастатични ефекти; точните механизми обаче остават неясни, което налага допълнително изследване [34,36]. Едно проучване на Wei et al. установи, че BPIFB1 инхибира миграцията и инвазията на назофарингеален карцином [37]. Като се има предвид това, беше установено, че мутациите, възникващи в BPIFB1, повишават риска от рак на белия дроб и неговото понижено регулиране води до лоша прогноза при пациенти с рак на белия дроб [38,39]. В допълнение към ролята на FCGBP и BPIFB, факторът B на комплемента (CFB) и химерният туморен супресор 1 (CST1) показват, че упражняват защитни роли при рак. Например, съобщава се, че високата експресия на CFB е свързана с повишена обща преживяемост на пациентите и преживяемост без заболяване при пациенти с рак на белия дроб [40]. Освен това системата на комплемента служи като първа линия на защита срещу патогени, служейки като основен компонент както на вродената, така и на придобитата имунна система [41]. Що се отнася до CST1, различни проучвания подчертават неговите интересни свойства, като способността му да потиска клетъчния растеж, да индуцира апоптоза и неговата устойчивост на инактивиране от онкогенни форми на p53, което го прави привлекателна, но алтернативна терапевтична цел на дивия тип p{ {74}}резистентни човешки тумори [42]. В допълнение към повишената експресия на FCGBP, BPIFB1, F5, CFB и CST1, нашите данни интересно показват два клетъчно свързани фенотипа на A549 клетки под SMG - морфологична промяна в агрегати и клетки с форма на бучки и значително намаляване на пролиферацията процент след SMG. Това е паралелно с някои други проучвания, при които клетки, които са били изложени на SMG, показват малки бучки или многослойни клетъчни агрегати [43,44]. Тези морфологични разлики се отразяват от съпътстващите драматични функционални промени в клетъчните процеси, част от които е ЕМТ. ЕМТ е отличителен белег на метастатичния процес, свързан с избягването на имунното наблюдение и инвазията на васкулатурата, което позволява на клетките да се разпространят във вторични органи [19,22]. По принцип злокачествените епителни клетки се подлагат на ЕМТ механизъм в първичните етапи на развитие на тумора, където тези клетки са склонни да изразяват мезенхимни свойства, проявявайки повишена подвижност, която улеснява тяхното бягство от първичната ниша, докато метастатичните клетки, образувани на вторичния страничен дисплей по-малко дедиференцирани свойства в сравнение със съответните им първични тумори. Тук MET (мезенхимален към епителен) процес е част от такава прогресия на образуване на метастатичен тумор. Това обаче не пренебрегва участието на ЕМТ на различни етапи от прогресията на рака, тъй като раковите клетки на вторичните места или ще продължат да растат и пролиферират, или ще претърпят латентност [45,46]. Такава множествена генна координация и появата на специфични миграционни маркери, които регулират метастатичната прогресия на раковите клетки, може да доведе до различни резултати при експозиция на SMG [47]. Например, при условия на микрогравитация, различни клетки от рак на гърдата показват различни морфологии, клетъчна адхезия и миграционни свойства при излагане на микрогравитация [5]. Трябва да се отбележи, че основната характеристика на ЕМТ е загубата на молекулата на клетъчната адхезия, Е-кадхерин, като по този начин се засяга неподвижността на целостта на клетките. От друга страна, увеличаването на невралния кадхерин, N-кадхерин, води до промени в клетъчната адхезия. Това се индуцира главно от трансформиращ растежен фактор (TGF-), който активира плейотропно експресирани транскрипционни фактори, като Snail, Twist и Zeb протеини и други сигнални пътища, внедрени в метастатични пътища [18,48,49]. Тук съобщаваме за усилването на епителния маркер Е-кадхерин (CDH1) и понижаването на нивата на мРНК на мезенхимния N-кадхерин (CDH2), ключови маркери на ЕМТ [49]. Това означава, че в комбинация с нашите данни за намалената скорост на пролиферация на A549, клетките показват по-малко метастатично състояние. Интересното е, че променената експресия на ключови маркери за ЕМТ също беше придружена от значително понижено регулиране на матриксната металопротеиназа MMP-2, която е основен компонент на базалната мембрана, която обикновено отделя епителния слой от околния мезенхим, като по този начин води до загубата на базалната мембрана [50]. Това е успоредно с проучване на Chang et al., където те съобщават за своите открития за намаляване на метастатичния потенциал на човешки белодробни аденокарциномни клетки чрез промяна на експресията на MMP2 [17]. Като цяло, ролята на ММР е добре замесена в прогресирането на злокачествени заболявания, включително метастази, където намалената експресия на ММР (ММР-2 и ММР-9) експресия и ензимна активност е характеристика на по-малко метастатичен фенотип [ 50–52]. Имайки значителната роля на EMT в метастазите, нашите данни подчертават значителна корелация на FCGBP, BPIFB, F5, CST1 и CFB с EMT генни маркери, както и гени, свързани с клетъчна миграция MMP2 и MMP9. Интересното е, че Xiong et al. показват, че FCGBP е основен регулатор на ЕМТ в жлъчния мехур [53]. Това означава, че идентифицираните гени могат да служат като потенциални биомаркери за бъдещи изследвания, които могат да предвидят и по-нататък да разберат прогресията на рака на белия дроб. Взети заедно, нашите открития класифицират идентифицираните гени като ключови регулатори на ЕМТ, насърчавайки потенциално усилване на по-малко метастатичен фенотип чрез мезенхимален към епителен преход (MET) на ракови клетки на белия дроб.
4. Материали и методи
4.1. Набори от данни за идентифициране на общи диференциално експресирани гени (DEG) в клетъчни линии на рак на белия дроб, изложени на симулирана микрогравитация
Съответните набори от данни от публично достъпната база данни Gene Expression Omnibus (GEO) бяха извлечени за първоначален анализ. Тази база данни се използва като публично достъпен функционален геномичен анализ на високопроизводителни данни за генна експресия и микрочипове. Избраните набори от данни отговарят на следните критерии: набори от данни, използващи само клетъчни линии от човешки рак на белия дроб, проучвания, които включват съвпадащи контроли при условия на земна гравитация (GG), набори от данни с дефинирана класификация на клетъчни линии от рак на белия дроб и набори от данни с генна експресия на клетки от човешки рак на белия дроб с помощта на микрочипове. Два набора от данни отговарят на този критерий, GSE78210 и GSE36931. Общо 25 проби бяха включени в проучванията и 14 проби от клетъчни линии на рак на белия дроб в симулирана микрогравитация (SMG) бяха сравнени с 11 GG контроли, както е показано в Таблица 2 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/; достъп на 11 ноември 2021 г.).
Таблица 2. Подробности за набори от данни, извлечени от Gene Expression Omnibus (GEO), използвани за първоначална идентификация на DEG между симулирани микрогравитационни (SMG) и земни гравитационни (GG) ракови клетки на белия дроб.
4.2. Анализ на обогатяване на набор от гени GEO2R за генериране на DEG във всяка база данни
GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r; достъпен на 11 ноември 2021), интерактивен онлайн инструмент, използван за сравняване на GEO серии, беше използван във всеки набор от данни за групиране и идентифициране на регулирани нагоре и надолу гени в SMG състояния в сравнение с GG състояния. Гените с p-стойности по-малки от 0, 05 и кратна промяна по-голяма от 2 бяха избрани като диференциално експресирани гени DEG в условия на SMG. Следователно, DEG на всеки набор от данни се пресичат един с друг и са идентифицирани общи гени
4.3. Количествено определяне на клинико-патологичното участие на идентифицираните гени
След това получените в краткия списък гени бяха валидирани с помощта на Kaplan–Meier Plotter (http://www.kmplot.com/; достъп на 11 ноември 2021 г.), онлайн публична база данни, оценяваща ефекта на избрани гени върху клиничните резултати на пациентите. Общата преживяемост (OS) се определя като продължителността от момента на поставяне на диагнозата (в месеци) до смъртта. Данните за генната експресия и информацията за оцеляването са извлечени от Gene Expression Omnibus (GEO), The Cancer Genome Atlas (TCGA) и European Genome-phenome Atlas (EGA). Пациентите бяха категоризирани в две групи: (1) висока експресия (със стойности на TPM над горния квартил) и (2) ниска/средна експресия (със стойности на TPM под горния квартил). Графиките на Kaplan-Meier бяха използвани за сравняване на OS на пациенти с белодробен аденокарцином (LUAD) с висока/междинна спрямо ниска експресия на кандидат-гени.
4.4. Обогатено онтологично групиране за идентифицираните гени
За да се проучи дали идентифицираните гени споделят общи пътища, беше извършен анализ на обогатяване на пътя на генната онтология (GO) за идентифицираните гени с помощта на уеб инструмента Metascape (https://metascape.org/; достъпен на 11 ноември 2021 г.) за изчерпателна анотация на списъка с гени и ресурс за анализ заедно с GEO2R
4.5. Клетъчна линия и клетъчна култура
Базалната епителна клетъчна линия на човешки аденокарцином (A549), широко използвана като модел за белодробен аденокарцином, се отглежда в среда на Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, допълнена с 10% фетален говежди серум (FBS; Sigma, St. Louis, MO, USA) и 100 единици/mL пеницилин/стрептомицин (P/S; Sigma, St. Louis, MO, USA). Клетъчната линия се култивира в овлажнен инкубатор при 37 °C в атмосфера от 5% CO2. Когато клетките достигнат сливане, те се събират с помощта на 0, 5% трипсин, центрофугират се при 100 × g за 5 минути и се използват, когато е необходимо.
4.6. Микрогравитация
Раковите клетки на белия дроб (A549) се култивират в 2D система с клиностат, имитираща среда с почти нулева гравитация (микрогравитация). Този Rotary Culture Max (RCMW™; Synthecon® Inc—Хюстън, Тексас, САЩ) е биореактор, оборудван със съд за клетъчна култура, включващ микропоресто перфузионно ядро и вградена оксигенаторна система, която осигурява хранително и външно обгазяване на средата, по този начин се осигурява правилен газообмен и среда за клетъчна култура с ниско срязване. Камерата беше опакована с културалната среда, съдържаща клетките. Тази камера се върти хоризонтално около една ос, перпендикулярна на силата на гравитацията, със скорост 10 rpm. 2D клиностатът беше поставен вътре в овлажнения инкубатор при 37 °C в атмосфера от 5% CO2. A549 клетки бяха събрани след симулирана микрогравитация (SMG) на 24, 48 и 72 часа. За да се създаде сравнима среда за рак на белия дроб, A549 клетки се култивират в културни плочи при GG, в невъртено или статично състояние, и се държат в близост до устройството вътре в овлажнения инкубатор (37 ◦C). Тези клетки се наричат контролна група и също са събрани на 24, 48 и 72 часа.
4.7. Анализ на клетъчната жизнеспособност
За условията на GG, A549 клетки бяха посяти в 24-плаки с клетъчни култури с плътност 3.0 × 104 клетки на 500 µL. Клетките се събират чрез трипсинизация на 24, 48 и 72 часа след засяване, след което се центрофугират при 200 × g за 5 минути. Получените клетъчни пелети се възстановяват в културална среда. За условията на SMG, A549 клетки бяха посяти в 2D клиностат въртяща се система при плътност от 6.0 × 104 клетки на 1 mL. Клетките се събират на 24, 48 и 72 часа след излагане на SMG, след което се центрофугират при 200 × g за 5 минути. Получените клетъчни пелети се възстановяват в културална среда. Проведен е тест за изключване на багрилото трипаново синьо (Sigma, САЩ). Броят на клетките се определя с помощта на автоматичния брояч CellDrop™.
4.8. Количествена полимеразна верижна реакция в реално време (qRT-PCR)
Нива на генна експресия (нива на иРНК) на идентифицираните in silico гени (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP и BPIFA1) заедно с EMT генни маркери (Таблица 3) също бяха определени в A549 клетки чрез qRT-PCR. Накратко, екстракцията на обща РНК от клетки се извършва с помощта на RNEasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Германия) на 24, 48 и 72 часа при GG и след излагане на SMG, като се следват протоколите на производителя. Един µg от общата РНК се транскрибира обратно към едноверижна комплементарна ДНК (cDNA) в 20 µL реакционен обем, използвайки iScript™ комплект за синтез на cDNA (Thermo, Waltham, MA, USA). qRT-PCR се извършва с помощта на PowerUp™ Sybr™ Green master mix (Thermo, САЩ) в машина Quant Studio 5 pcr (Thermo, САЩ). Стъпките на PCR амплификация бяха както следва: първоначална стъпка на денатурация при 95 ◦C за 3 минути, температура на отгряване на целевия ген за 30 s и след това 72 ◦C за 30 s. Стойността на праговия цикъл на флуоресценция беше получена за всеки ген. ∆∆Методът Cq беше използван за изчисляване на относителната кратна промяна в генната експресия след нормализиране към домакинския ген, глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH).
Таблица 3. Списък на човешки праймери. NOX1, NADPH оксидаза 1; GDA, гуанин деаминаза; TCN1, транскобаламин 1; FCGBP, Fc гама свързващ протеин; BPIFA1, BPI сгъване, съдържащо член на семейство A 1; AZGP1, алфа-2-гликопротеин 1; CFB, фактор B на комплемента; VTCN1, V-Set домейн, съдържащ Т-клетъчен активиращ инхибитор 1; AGR3, преден градиент 3; CTS1, химерен туморен супресор 1; F5, коагулационен фактор V; CEACAM6, CEA клетъчна адхезионна молекула 6; BPIFB1, BPI сгъване, съдържащо член 1 на семейство B; ZO-1, Zonula occludens протеин 1; MMP-9, матрична металопротеиназа 9; MMP-2, матрична металопротеиназа 2; и GAPDH, глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа
4.9. Анализ на взаимодействието ген-ген
Данните от in vitro qRT-PCR бяха внедрени в анализ на взаимодействието ген-ген с помощта на уеб инструмента in silico GeneMANIA (http://genemania.org/; достъпен на 11 ноември 2021 г.), мрежов алгоритъм за прогнозиране на генни функции, използвайки голям набор от данни за функционална асоциация. Това беше проведено, за да се оценят допълнително взаимодействията между/между избраните кандидат-гени; FCGBP, CST1, F5, CFB и BPIFB1 с EMT гени; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 и SNAI1, както и гени, свързани с клетъчна миграция, MMP2 и MMP9.
4.10. Статистически анализ
Софтуерът GraphPad Prism беше използван за извършване на статистически анализ. Резултатите се изразяват като индивидуални данни или като средна стойност ± стандартно отклонение (SD). T-тестът на Стюдънт беше използван за сравняване на различни групи. Разликите между групите бяха оценени чрез еднопосочен ANOVA на дисперсията (ANOVA). p-стойностите бяха определени и стойностите на p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001 (*, ** и ***, съответно) бяха считани за значими. Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра (n=3).
Препратки
1. Уайт, RJ; Averner, MJN Хората в космоса. Nature 2001, 409, 1115–6828. [CrossRef]
2. Бредбъри, П.; Wu, H.; Чой, JU; Роуан, AE; Джан, Х.; Poole, K.; Lauko, J.; Chou, J. Моделиране на въздействието на микрогравитацията на клетъчно ниво: Последици за човешкото заболяване. Преден. Cell Dev. Biol. 2020, 8, 96. [CrossRef] [PubMed]
3. Юан, М.; Liu, H.; Джоу, С.; Джоу, X.; Huang, Y.-E.; Hou, F.; Jiang, W. Интегративен анализ на регулаторния модул разкрива асоциации на микрогравитацията с дисфункции на многотелесни системи и туморогенеза. Вътр. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7585. [CrossRef] [PubMed]
4. Crucian, BE; Chouker, A.; Симпсън, RJ; Мехта, С.; Маршал, Г.; Smith, SM; Zwart, SR; Хеър, М.; Пономарев, С.; Whitmire, A.; et al. Дисрегулация на имунната система по време на космически полет: Потенциални контрамерки за мисии за изследване на дълбокия космос. Преден. Immunol. 2018, 9, 1437. [CrossRef] [PubMed]
5. Насеф, MZ; Мелник, Д.; Kopp, S.; Sahana, J.; Инфангер, М.; Lützenberg, R.; Реля, Б.; Wehland, М.; Грим, Д.; Krüger, M. Клетки от рак на гърдата в микрогравитация: Нови аспекти за изследване на рака. Вътр. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7345. [CrossRef]
6. Такамацу, Й.; Koike, W.; Takenouchi, T.; Сугама, С.; Wei, J.; Варагай, М.; Секияма, К.; Хашимото, М. Защита срещу невродегенеративни заболявания на Земята и в космоса. NPJ Microgravity 2016, 2, 16013. [CrossRef]
7. Насеф, MZ; Kopp, S.; Wehland, М.; Мелник, Д.; Sahana, J.; Крюгер, М.; Corydon, TJ; Oltmann, H.; Schmitz, B.; Schütte, A. Истинската микрогравитация влияе върху цитоскелета и фокалните адхезии в клетките на човешки рак на гърдата. Вътр. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3156. [CrossRef]
8. Dietz, C.; Инфангер, М.; Romswinkel, A.; Strube, F.; Kraus, A. Индукция на апоптоза и промяна на клетъчната адхезия в човешки белодробни ракови клетки при симулирана микрогравитация. Вътр. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3601. [CrossRef]
9. Ричи, Г.; Cucina, A.; Proietti, S.; Диникола, С.; Феранти, Ф.; Камарота, М.; Филипини, А.; Bizzarri, М.; Катизон, А. Микрогравитацията индуцира преходен ЕМТ в човешки кератиноцити чрез ранна регулация надолу на Е-кадхерин и ремоделиране на клетъчната адхезия. J. Appl. Sci. 2020, 11, 110. [CrossRef]
10. Ahn, CB; Lee, J.-H.; Хан, DG; Kang, H.-W.; Lee, S.-H.; Лий, Дж.-И.; Син, KH; Lee, JW Симулирана микрогравитация с плаваща среда насърчава миграцията на недребноклетъчен рак на белия дроб. Sci. Rep. 2019, 9, 14553. [CrossRef] [PubMed]
11. Пизану, ME; Ното, А.; De Vitis, C.; Масиело, MG; Coluccia, P.; Proietti, S.; Giovagnoli, MR; Ричи, А.; Giarnieri, Е.; Cucina, A. Стволовите клетки от рак на белия дроб губят състоянието си по подразбиране на стволовост след излагане на микрогравитация. BioMed Res. Вътр. 2014, 2014, 470253. [CrossRef] [PubMed]
12. Инфангер, М.; Kossmehl, P.; Shakibaei, М.; Bauer, J.; Kossmehl-Zorn, S.; Cogoli, A.; Curcio, F.; Oksche, A.; Wehland, М.; Кройц, RJC; et al. Симулираната безтегловност променя цитоскелета и извънклетъчните матрични протеини в клетките на папиларния тиреоиден карцином. Cell Tissue Res. 2006, 324, 267–277. [CrossRef] [PubMed]
13. Чен, Дж.; Микрогравитация, L. Туморни клетки в микрогравитация. В Космоса: Пътешествие за това как хората се адаптират и живеят в микрогравитация; IntechOpen: Лондон, Великобритания, 2018 г.; Том 139, стр. 259–268.
14. Грим, Д.; Шулц, Х.; Крюгер, М.; Кортес-Санчес, JL; Егли, М.; Краус, А.; Sahana, J.; Corydon, TJ; Hemmersbach, R.; Wise, PM Борбата срещу рака чрез микрогравитация: Многоклетъчният сфероид като модел на метастази. Вътр. J. Mol. Sci. 2022, 23, 3073. [CrossRef]
15. Шабат, MB; Cote, ML Напредък на рака и приоритети: Рак на белия дроб. Раков епидемиол. Биомаркировка. предишна 2019, 28, 1563–1579. [CrossRef] [PubMed]
16. Chung, JH; Ahn, CB; Син, KH; Yi, E.; Син, HS; Kim, H.-S.; Lee, SH Симулирани микрогравитационни ефекти върху клетъчната пролиферация и миграция на недребноклетъчен рак на белия дроб. Aerosp. Med. тананикам Изпълнение. 2017, 88, 82–89. [CrossRef]
17. Чанг, Д.; Xu, H.; Guo, Y.; Jiang, X.; Liu, Y.; Ли, К.; Пан, С.; Юан, М.; Wang, J.; Ли, Т.; et al. Симулираната микрогравитация променя метастатичния потенциал на клетъчна линия на човешки белодробен аденокарцином. Витр. клетка. Dev. Biol. Anim. 2013, 49, 170–177. [CrossRef]
18. Ханахан, Д.; Weinberg, R. Отличителни белези на рака: следващото поколение. Cell 2011, 144, 646–674. [CrossRef]
19. Рибати, Д.; Тама, Р.; Annese, T. Епителен-мезенхимен преход при рак: исторически преглед. Превод Oncol. 2020, 13, 100773. [CrossRef]
20. Ши, С.; Li, Q.; Cao, Q.; Diao, Y.; Джан, Й.; Юе, Л.; Wei, L. EMT транскрипционните фактори участват в променената клетъчна адхезия при симулиран микрогравитационен ефект или претоварване чрез регулиране на Е-кадхерин. Вътр. J. Mol. Sci. 2020, 21, 1349. [CrossRef]
21. Топал, У.; Zamur, C. Микрогравитация, стволови клетки и рак: Нова надежда за лечение на рак. Стволови клетки Int. 2021, 2021, 5566872. [CrossRef]
22. Ксязкевич, М.; Markiewicz, A.; Zaczek, AJ Епителен-мезенхимален преход: отличителен белег при образуването на метастази, свързващ циркулиращите туморни клетки и раковите стволови клетки. Патобиология 2012, 79, 195–208. [CrossRef] [PubMed]
23. Ян, Т.; Тиан, Д.; Чен, Дж.; Тан, Й.; Cheng, Y.; Йе, Л.; Deng, G.; Лиу, Б.; Юан, Ф.; Zhang, S. FCGBP е прогностичен биомаркер и е свързан с имунна инфилтрация в глиома. Преден. Oncol. 2021, 11, 769033. [CrossRef] [PubMed]
