Насочване към напреднал рак на простатата със STEAP1 химерен антигенен рецепторен Т-клетъчен и локализиран в тумор IL{2}} имунотерапия
Sep 18, 2023
Шест трансмембранен епителен антиген на простатата 1 (STEAP1) е антиген на клетъчната повърхност за терапевтично насочване при рак на простатата. Тук докладваме широката експресия на STEAP1 по отношение на простатно-специфичния мембранен антиген (PSMA) при смъртоносни метастатични ракови заболявания на простатата и развитието на Т-клетъчна терапия с STEAP1-насочен химерен антигенен рецептор (CAR). STEAP1 CAR Т-клетките демонстрират реактивност при ниска плътност на антигена, антитуморна активност при модели на метастатичен рак на простатата и безопасност в човешки STEAP1 модел на мишка. Бягството от STEAP1 антиген е повтарящ се механизъм на резистентност към лечението и е свързано с намалена обработка и представяне на туморен антиген. Прилагането на терапия с локализиран в тумори интерлевкин-12 (IL-12) под формата на слят протеин на колаген-свързващ домен (CBD)-IL-12, комбиниран с терапия с Т клетки STEAP1 CAR подобрява антитуморна ефикасност чрез ремоделиране на имунологично студената туморна микросреда на рак на простатата и борба с изтичането на STEAP1 антиген чрез ангажиране на имунитета на гостоприемника и разпространението на епитоп.
Китайска билка растение цистанче-Противотуморно
Metastatic prostate cancer represents an incurable disease responsible for over 33,000 deaths per year in the United States1. Prostate cancer is critically reliant on androgen receptor (AR) signaling and thus the suppression of gonadal androgen production through surgical or chemical castration (androgen deprivation therapy) has been a mainstay of treatment for advanced disease. However, metastatic prostate cancer inevitably develops resistance to androgen deprivation therapy and enters a stage called metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). mCRPC is currently incurable and is considered the end stage of the disease and is associated with a median overall survival of three years2. In the past decade, multiple therapies including an inhibitor of extragonadal androgen synthesis (abiraterone acetate)3, second-generation AR antagonists (enzalutamide)4, radioactive isotope (radium-223)5, and a prostate-specific membrane antigen (PSMA)-specific radioligand therapy (lutetium Lu 177 via votide tetraxetan)6 have been approved for mCRPC. Each of these agents extends survival on average by several months but long-term remissions are rare. Strategies to reprogram the immune system to combat prostate cancer first gained traction with the clinical approval of the dendritic cell vaccine sipuleucel-T for asymptomatic mCRPC7. More recently, several types of immunotherapies including immune checkpoint inhibitors, a DNA cancer vaccine, antibody-drug conjugates (ADC), T cell engaging bispecific antibodies (T-BsAb), and chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies have been under active clinical investigation8,9. CARs are synthetic receptors that leverage the potency, expansion, and memory of T cells and can be engineered against virtually any tumor-associated cell surface antigen. The adoptive transfer of CAR T cells has rapidly become an established treatment for hematologic malignancies with exceptional response rates leading to six clinical approvals in the last five years10. In contrast, CAR T cell therapies targeting solid tumors have lagged due to additional challenges related to the lack of bona fide tumor-specific antigens, inhospitable tumor microenvironments, and poor trafficking, persistence, and expansion of CAR T cells11. Despite the challenges observed in driving effective immune responses toward solid tumors, recent early-phase clinical trials investigating CAR T cell therapies targeting PSMA in mCRPC have reported safety and evidence of significant biochemical and radiographic responses12,13. These preliminary results serve to embolden efforts to develop and optimize new CAR T cell therapies for prostate cancer. While PSMA is the preeminent target for therapeutic and diagnostic development in prostate cancer, recent work indicates that PSMA expression may be quite heterogeneous in mCRPC14. Tumor antigen heterogeneity, especially in the context of single antigen-targeted CAR T cell therapies for solid tumors like prostate cancer, is an important barrier to therapeutic efficacy15. Thus, identifying cell surface antigens with broad and relatively homogeneous expression in prostate cancer is imperative. In addition, very few if any tumor-associated antigens demonstrate tumor-restricted expression—most also exhibit low-level expression in normal tissues that could represent liabilities for CAR T cell therapies due to on-target off-tumor toxicities which can lead to devastating consequences including death16. We previously performed integrated transcriptomic and cell surface proteomic profiling of human prostate adenocarcinoma cell lines and identified six transmembrane epithelial antigens of the prostate 1 (STEAP1) as one of the most highly enriched cell surface antigens17. STEAP1 was first described over two decades ago18 and was recognized as being highly expressed in prostate cancer. STEAP1 is strongly expressed in >80% от mCRPC със засягане на кости или лимфни възли19, 62% от сарком на Юинг20 и множество други видове рак21. STEAP1 принадлежи към семейството STEAP на Metallo редуктази, които могат да образуват хомотримери или хетеротримери с други STEAP протеини22. STEAP1 има установена функционална роля в насърчаването на пролиферацията на ракови клетки, инвазията и прехода от епител към мезенхим -26.
Ползи от cistanche tubulosa-антитуморен
Освен това, STEAP1 демонстрира ограничена експресия в нормалната тъкан 27, което го прави изключително привлекателна цел за терапия на рак. Множество имунотерапевтични агенти са разработени за насочване към STEAP1, но никой не е клинично одобрен. Установено е, че ADC vandor tuzumab ved otin (DSTP3086S), състоящ се от хуманизирано анти-STEAP1 IgG1 антитяло, свързано с монометил ауристатин Е, има приемлив профил на безопасност във фаза I клинично изпитване при mCRPC, но са наблюдавани малко обективни туморни отговори28. В момента се оценява T-BsAb, включващ два анти-STEAP1 фрагмент-антиген свързващи домена (Fab), анти-CD3 едноверижен вариабилен фрагмент (scFv) и кристализиращ фрагмент (Fc) домейн, конструиран да няма ефекторна функция, наречен AMG 509 във фаза I клинично изпитване (NCT04221542) в mCRPC29. Наскоро беше съобщено също, че асиметрично двойно двувалентно T-BsAb, наречено BC261, демонстрира мощна антитуморна активност в множество предклинични модели на рак на простатата и сарком на Ewing30. Освен това е показано, че човешки левкоцитен антиген (HLA) клас I-ограничен Т клетъчен рецептор (TCR), специфичен за STEAP1 пептид, инхибира локалния и метастатичен растеж на саркома на Юинг в предклиничен модел на ксенотрансплантация след адаптивен трансфер на трансгенни Т клетки31. В това проучване ние извършваме сравнителен анализ на относителната експресия на STEAP1 и PSMA в летален mCRPC, за да проучим полезността на насочването към STEAP1 в настоящата ера на PSMA тераностиката. Ние проектираме и скринираме второ поколение STEAP1 CARs за антиген-специфична Т-клетъчна активация и цитолиза на целеви клетки, за да получим водещ кандидат за по-нататъшно характеризиране. Ние определяме функционалната епитопна специфичност на STEAP1 CAR Т клетки и профилираме експанзията и имунофенотипа на STEAP1 CAR Т клетъчни продукти от множество донори. След това установяваме ефикасността и предварителната безопасност на STEAP1 CAR Т клетъчната терапия в съответните предклинични модели на рак на простатата, но наблюдаваме повтарящата се загуба на експресия на STEAP1 антиген като механизъм на резистентност към лечението. За да преодолеем този проблем, ние оценяваме едновременното приложение на CBD-IL-12, което премоделира имуносупресивната туморна микросреда на рак на простатата и ангажира ендогенния имунитет за разширяване на антитуморните отговори. Взети заедно, тези проучвания предоставят силна обосновка за клиничния превод на STEAP1 CAR T клетъчна терапия при мъже с mCRPC и насочват стратегии за преодоляване на потенциални механизми на терапевтична резистентност.
Ползи от cistanche tubulosa-антитуморен
Резултати
STEAP1 е широко експресиран в рефрактерни на лечение mCRPC тъкани
We first set out to determine the pattern and extent of STEAP1 expression relative to PSMA in advanced metastatic prostate cancer. We performed immunohistochemical (IHC) staining on a duplicate set of tissue microarrays consisting of 121 metastatic tumors (each with up to three cores represented) collected from 44 men with lethal mCRPC patients collected by rapid autopsy between the years 2010 and 2017 through the University of Washington Tumor Acquisition Necropsy Program32 (Fig. 1a). Plasma membrane staining for STEAP1 and PSMA in each tissue was scored by a research pathologist and semiquantitative H-scores were determined based on the staining intensity (Supple mentary Fig. 1a) multiplied by the percentage of cancer cells staining at each intensity (Supplementary Fig. 1b). By implementing a minimal staining threshold with an H-score cut-off of 30, we found that 87.7% of evaluable matched mCRPC tissues (100 of 114) demonstrated staining for STEAP1 compared to only 60.5% (69 of 114) for PSMA (Fig. 1b). In addition, 28.1% of mCRPC tissues (32 of 114) showed STEAP1 but not PSMA staining (Fig. 1b, c) whereas only 0.9% (one of 114) exhibited PSMA but not STEAP1 staining. Based on these results, we used a linear mixed statistical model to determine that the odds of non-zero (H-score >{{0}}) оцветяването е 22-кратно (95% CI 6-173) по-високо за STEAP1 отколкото за PSMA и шансовете за H-резултат са по-големи или равни на 3{{ 27}} са 84-кратно (95% CI 30-317) по-високи за STEAP1, отколкото за PSMA. Средният STEAP1 H-скор в кост (193; 95% CI 171 до 215) е значително по-висок, отколкото при метастази в лимфни възли (разлика -48; 95% CI -21 до -76; p < 0.001) и значително по-високи, отколкото при висцерални метастази (разлика -59; 95% CI -42 до -77; p <0,001). Няма значима разлика между средния STEAP1 H-резултат при метастази в лимфни възли в сравнение с висцерални метастази (разлика 11; 95% CI -16 до 39; p=0.4) (допълнителна фигура 1c). Ние също така наблюдавахме няколко случая с хетерогенна експресия на PSMA в ядрата (фиг. 1d), което е в съответствие с скорошен доклад за интратуморна хетерогенност на PSMA в биопсии на mCRPC14. Анализ на ниво пациент, използващ среден праг на H-резултат от По-голям или равен на 30 и тест на McNemar разкри, че 95% от оценяваните пациенти (42 от 44) са имали тумори с експресия на STEAP1, докато 68% (30 от 44) са положителни за PSMA (Допълнителна фигура 1d). За да проучим моделите на хетерогенност между пациенти и вътре в тях, свързани с експресията на STEAP1 и PSMA, ние използвахме STEAP1 и PSMA H-резултати, за да оценим хипергеометричните, оценките за разнообразие на Simpson и Shannon. Наблюдавахме два модела на експресия на STEAP1 (фиг. 1e) с 68% (30/44) от пациентите, показващи експресия на STEAP1 във всички метастатични места (висок STEAP1) и 32% (14/44) пациенти, показващи метастатични места със и без експресия на STEAP1 (хетерогенен STEAP1). Не са идентифицирани пациенти, при които всички метастатични тъкани нямат експресия на STEAP1. Подобен анализ за експресия на PSMA в същата кохорта разкрива 45% (20/44) пациенти с висока експресия на PSMA, 32% (14/44) с хетерогенна експресия на PSMA и 23% (10/44) без експресия на PSMA. Въз основа на молекулярна подкласификация на тъканите на mCRPC с помощта на AR и експресията на невроендокринния маркер синаптофизин (SYP), оценена чрез IHC, повечето пациенти с висока или хетерогенна експресия на STEAP1 и PSMA са имали AR-положителен рак на простатата (AR+/SYP- или AR+/SYP+), докато тези без експресия на PSMA са имали AR-нулев рак на простатата (AR-/SYP+ или AR-/SYP-). Ние идентифицирахме положителна корелация между експресията на STEAP1 и AR (p <0.001) чрез монтиран линеен смесен модел със случаен ефект в случаите, представени на тъканния микрочип (допълнителна фигура 2a, b), което се очакваше, като се има предвид, че STEAP1 е андроген -регулиран ген33,34. За разлика от това, беше оценена отрицателна тенденция между експресията на STEAP1 и SYP (допълнителна фигура 2с). Тези открития предполагат, че подобно на PSMA35, експресията на STEAP1 може да бъде загубена с невроендокринна трансдиференциация на рак на простатата.
Fig. 1 | Comparative analysis of STEAP1 and PSMA in lethal, metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). a Characteristics of the mCRPC tissues represented on University of Washington Tissue Acquisition Necropsy Tissue Microarray 92 (UW TAN TMA92). b Contingency table showing the frequency of mCRPC tissues with STEAP1 or PSMA IHC staining above or below an H-score threshold of 30. Micrographs of select mCRPC tissues after STEAP1 and PSMA IHC staining to highlight the (c) absence of PSMA but the presence of STEAP1 expression and (d) intratumoral heterogeneity of PSMA expression but not STEAP1. Scale bars = 50 µm. For panels (c, d) n = 332 mCRPC cores were immunostained for STEAP1 and PSMA. e Dot and box plot showing the distribution of STEAP1 (top) and PSMA (bottom) H-scores in 44 patients from the UW TAN TMA92 cohort. Each dot represents a tumor specimen/core (n = 319 cores for PSMA and 333 cores for STEAP1) and the color indicates the molecular subtype: AR+/SYP+ (red), AR+/SYP− (green), AR−/SYP+ (yellow) and AR−/SYP− (purple). Gray rectangles show interquartile ranges spanning the 25th to the 75th percentiles of PSMA H-scores from each patient. Bar plots (on the right) summarize the frequencies of patients classified based on STEAP1 and PSMA expression as no expression (all cores with H-score ≤30, light grey), heterogeneous expression (at least one core with H-score ≤30 and H-score >30, mid grey) and high expression (all cores with H-scores >30, тъмно сиво). Изходните данни се предоставят във файла с изходни данни.
Разввариант на мощен, антиген-специфичен STEAP1 CAR
Като се има предвид широко разпространената експресия на STEAP1 в mCRPC в късен стадий и докладваната му функционална роля в прогресията на рака27,36,37, ние след това започнахме да конструираме лентивирусен STEAP1-специфичен CAR от второ поколение. Използвахме pCCL-c-MNDU3-X лентивирусен гръбнак38, който е бил широко използван за генна терапия на хемопоетични стволови клетки39 и е доказано, че експресията на CAR в Т клетките, управлявана от вътрешния MNDU3 промотор, е по-висока от тази, постигната с EFS промоутър40. 4-1BB костимулаторен домейн беше предпочитан поради връзката му с образуването на Т-клетъчна памет и удължената персистенция41 и беше въведен CD28 трансмембранен домейн, тъй като е доказано, че намалява антигенния праг за второ поколение 4-1BB CAR Т клетъчно активиране42. Ние включихме напълно хуманизирания scFv, получен от vandor tuzumab vedotin, ADC, насочен към STEAP1, чието развитие беше прекратено след фаза I клинично изпитване28. Този scFv е хуманизиран вариант на мишето моноклонално антитяло (mAb 120.545), първоначално разработено от Agensys, Inc., което демонстрира 1 nM афинитет в клетъчно базирани анализи на свързване43. За да настроим потенциално активността на CAR, внедрихме три различни дължини на шарнир/спейсър, включително къса (панта IgG4), средна (панта IgG4-CH3) и дълга (панта IgG4-CH2- CH3). Дългият спейсър е проектиран с по-рано описани 4/2- NQ мутации 44 в CH2 домейна, за да се предотврати свързването на Fc-гама рецептора и индуцираната от активирането клетъчна смърт, която настъпва с адоптивния трансфер на дълъг спейсър CAR Т клетки в имунодефицитни мишки. Трите кандидат CAR бяха клонирани в лентивирусен вектор (фиг. 2а), който също ко-експресира пресечен рецептор на епидермален растежен фактор (EGFRt) като маркер за трансдукция. Лентивирусите бяха генерирани и използвани за трансдукция на човешки CD4 и CD8 Т клетки, обогатени от мононуклеарни клетки от периферна кръв на човешки донор (PBMCs), събрани от фереза. Разширените CD4 и CD8 CAR Т клетки бяха имунофенотипирани (допълнителна фигура 3а) и възстановени в клетъчни продукти с определен състав с нормално съотношение CD4/CD8, за да се оцени тяхната функционална активност. За да контролираме експресията на STEAP1 по изогенен начин, ние се съсредоточихме върху 22Rv1 клетъчна линия на човешки рак на простатата, която демонстрира нативна експресия на STEAP1 и извършихме STEAP1 нокаут (ko) чрез редактиране на генома CRISPR/Cas9. След това генерирахме STEAP1 спасителна линия от 22Rv1 STEAP1 ko чрез трансдукция с STEAP1 експресиращ лентивирус (фиг. 2b). След това тези линии бяха използвани за скрининг на трите къси, средни и дълги спейсерни STEAP1 CAR Т клетки в анализи за съвместно култивиране с отчитане на освобождаването на интерферон-гама (IFN-) като индикатор за Т клетъчно активиране. Само дългите спейсърни STEAP1 CAR Т клетки (наричани по-нататък STEAP1-BBζ CAR Т клетки) демонстрираха очаквания антиген-специфичен модел на освобождаване на IFN, докато късите и средни спейсърни STEAP1 CAR Т клетки не го направиха (фиг. 2c). , Допълнителна фигура 3b, c). Освен това, STEAP1-BBζ CAR Т клетки показват значителна дозозависима цитолиза на 22Rv1 клетки в сравнение с нетрансдуцирани Т клетки (Фиг. 2d) и демонстрират относително пестене на 22Rv1 STEAP1 ko клетки (Фиг. 2e). След това бяха проведени подобни проучвания в DU145 клетъчна линия на човешки рак на простатата, която няма нативна експресия на STEAP1, но е проектирана да експресира STEAP1 (DU145 STEAP1) чрез лентивирусна трансдукция (допълнителна фигура 4а). При тази настройка STEAP1-BBζ CAR Т клетъчно активиране се наблюдава само в съвместни култури с DU145 STEAP1 клетки, а не родителските DU145 клетки (допълнителна фигура 4b). Цитолитичната активност се оценява само с STEAP1-BBζ CAR Т клетки, а не с нетрансдуцирани Т клетки в съвместни култури с DU145 STEAP1 клетки (допълнителна фигура 4с). Впоследствие анализирахме по-голям панел от човешки клетъчни линии на рак на простатата, за да характеризираме тяхната естествена STEAP1 експресия чрез имуноблот анализ. Клетъчните линии с известна експресия/активност на AR (LNCaP, 22Rv1, VCaP и LNCaP95) показват различни нива на експресия на STEAP1, докато AR-нулевите клетъчни линии (PC3, DU145, MSKCC EF1 и NCI-H660) изглежда не експресират откриваеми нива на STEAP1 (фиг. 2f). Продължихме да извършваме съвместни култури на STEAP1-BBζ CAR T с тези линии, за да потвърдим допълнително тяхното антиген-специфично активиране въз основа на освобождаване на IFN (фиг. 2g). Въпреки това, ние наблюдавахме противоречива находка в това, че PC3 линията, която не показва видима експресия на STEAP1 протеин (фиг. 2f), индуцира значително активиране на STEAP1-BBζ CAR Т клетки. Предишна литература предполага, че STEAP1 се експресира в клетъчната линия PC3 на ниски нива45. Наистина, продължителното излагане на имуноблот разкрива лента, предполагаща наличието на много ниска експресия на STEAP1 (фиг. 2h). За да потвърдим дали STEAP1-BBζ CAR Т клетъчното активиране се дължи на тази незначителна STEAP1 експресия в PC3 клетки, ние генерирахме три PC3 STEAP1 ko подлинии (Фиг. 2h) и отново извършихме ко-култивиране със STEAP{{133} }BBζ CAR Т клетки. STEAP1 ko в линията PC3 доведе до отмяната на STEAP1-BBζ CAR Т клетъчно активиране (фиг. 2i), като допълнително потвърди специфичността и предостави доказателство за чувствителността на STEAP1-BBζ CAR Т клетките към ниски условия на плътност на антигена.
Липса на кръстосана реактивност на STEAP1-BBζ CAR с миши Steap1 и човешки STEAP1B
ползи от добавката Cistanche-увеличаване на имунитета
В съответствие с античовешката специфичност на vandor tuzumab vedotin, STEAP1-BBζ CAR Т клетките не демонстрират кръстосана реактивност с миши Steap1 (допълнителна фигура 4a, d, e). Въпреки това, ние използвахме това като възможност да възстановим индивидуално трите човешки STEAP1 извънклетъчни домена (ECDs) върху миши Steap1 (допълнителна фигура 4f), за да определим кои ECDs са критични за разпознаването на епитоп от STEAP1-BBζ CAR Т клетки. Бяха проведени експерименти за съвместно култивиране със STEAP1-BBζ CAR Т клетки и DU145 клетки, проектирани да експресират миши Steap1 с индивидуална замяна на миши ECD с човешки ECD. Открихме, че човешки STEAP1 ECD2, но не ECD1 или ECD3, е свързан с STEAP1-BBζ CAR Т клетъчно активиране (допълнителна фигура 4g). Интересно е, че човешкият STEAP1 и мишият Steap1 ECD2 демонстрират 93,9% (31/33 аминокиселини) хомология (допълнителна фигура 4h), което показва, че Q198 и/или I209 на човешки STEAP1 са критични за продуктивното разпознаване от STEAP1-BBζ CAR Т клетки. Доказано е, че Q198 взаимодейства с Fab от 120.545 като част от гореща точка на взаимодействие, базирана на скорошна структура, разрешена чрез криогенна електронна микроскопия22. От човешкото STEAP семейство протеини, STEAP1B има най-голяма хомология със STEAP145. Идентифицирани са три STEAP1B транскрипта, всички от които демонстрират пълно запазване на аминокиселинната последователност на човешки STEAP1 ECD2 (допълнителна фигура 5а). Алгоритъмът за прогнозиране на топологията на консенсусната мембрана TOPCONS46 прогнозира последователностите на ECD2 домейн като извънклетъчни в трите протеинови изоформи STEAP1B (допълнителна фигура 5b), макар и с резултати с ниска надеждност за STEAP1B в сравнение с hSTEAP1 поради липса на консенсус между петте модела за прогнозиране на топологията (OCTOPUS, Philius, PolyPhobius, SCAMPI и SPOCTOPUS), използвани от TOPCONS (допълнителна фигура 5c). Предишен анализ, използващ друг in silico скрит базиран на модел на Марков инструмент за прогнозиране на топология TMHMM47 също предполага, че тази последователност може да бъде вътреклетъчна, а не извънклетъчна в STEAP1B протеинови изоформи 1 и 245. Въпреки това, кристалната структура на STEAP1B все още не е определена, за да потвърди директно тези прогнози. За да оценим функционално дали STEAP1- BBζ CAR Т клетките също могат да бъдат реактивни срещу STEAP1B, ние извършихме съвместни култури, използвайки DU145 линии, проектирани да експресират всяка от трите изоформи на STEAP1B. Ние не идентифицирахме доказателства за STEAP1-BBζ CAR Т клетъчно активиране (допълнителна фигура 5d), което предполага, че епитопът STEAP1, разпознат от STEAP1-BBζ CAR Т клетки, може да не е представен като част от ектодомейн от STEAP1B въпреки очевидната хомология на последователността.
Фиг. 2|Скрининг на 4-1ВВ химерни антигенни рецептори (CARs) от второ поколение за идентифициране на водещ за терапия с Т клетки STEAP1 CAR. Схема на лентивирусната STEAP1 CAR конструкция и вариация, базирана на къси, средни и дълги разделители. LTR дълго терминално повторение, MNDU3 Moloney миши левкемичен вирус U3 регион, scFv едноверижен променлив фрагмент, VL променлива лека верига, VH променлива тежка верига, tm трансмембрана, EGFRt скъсен рецептор на епидермален растежен фактор, 4/2 NQ {{1{{28 }}}} Мутации на CH2 домейн за предотвратяване на свързването с Fc-гама рецептори. b Имуноблоти на STEAP1 в 22Rv1 родителски клетки, STEAP1 нокаутирани (ko) клетки и STEAP1 ko клетки със спасяване на STEAP1. c IFN-ензимно-свързаният имуносорбентен анализ (ELISA) е резултат от съвместни култури на нетрансдуцирани Т клетки или STEAP1-BBζ CAR Т клетки с всяка от 22Rv1 подлинии в съотношение 1:1 на 24 часа (p < 0.001). Относителна клетъчна жизнеспособност на (d) 22Rv1 и (e) 22Rv1 STEAP1 ko целеви клетки с течение на времето, измерена чрез флуоресцентно изобразяване на живи клетки при съвместно култивиране с (вляво) STEAP1-BBζ CAR Т клетки (p <0,001) или ( дясно) нетрансдуцирани Т клетки при променливи съотношения ефектор към мишена (E: T) клетки. f Имуноблоти, демонстриращи експресия на STEAP1 в клетъчни линии на човешки рак на простатата с положителен андрогенен рецептор (AR), но не и AR-отрицателни клетъчни линии на рак на простатата. g IFN-количествено определяне чрез ELISA от съвместни култури на нетрансдуцирани Т клетки или STEAP1- BBζ CAR Т клетки с всяка от човешките клетъчни линии на рак на простатата в (f) в съотношение 1:1 за 24 часа. h Имуноблоти за STEAP1 в 22Rv1, PC3 и PC3 STEAP1 ko подлинии. I IFN-количествено определяне чрез ELISA от съвместни култури на нетрансдуцирани Т клетки или STEAP1- BBζ CAR Т клетки с всяка клетъчна линия в (h) при съотношение 1:1 на 24 h (p <0,001). За панели (c–e, g и i) са използвани n=4 биологични реплики за условие и лентите за грешки представляват средната стойност със SEM. Панел (b, f, h) показва резултати, представителни за n=3 биологични реплики. GAPDH беше използван като контрола за натоварване на протеин. За панели (c) и (i) беше използвана двупосочна ANOVA с многократни сравнителни тестове на Sidak. За панели (d) и (e) беше използвана двупосочна ANOVA с тест за множество сравнения на Tukey. Изходните данни се предоставят във файла с изходни данни.
Характеризиране на STEAP1-BBζ CAR Т-клетъчни продукти в поредица от донори
След това профилирахме експанзията, ефективността на трансдукция и имунофенотипа на STEAP1-BBζ CAR Т клетъчни продукти, използвайки три независими комплекта мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMCs), събрани от здрави донори. Като цяло наблюдавахме 20- до 40-кратно разширяване на STEAP1-BBζ CAR Т клетки в рамките на 11 дни от култивирането (допълнителна фигура 6а). Процентът на EGFRt+ CD8 Т клетки варира от 24,3 до 54,2%, докато процентът на EGFRt+ CD4 Т клетки е по-висок и варира от 60,1 до 74,9% в нашите STEAP1-BBζ CAR Т клетъчни продукти (допълнителна фигура 6b). Изследвахме експресията на маркерите за изчерпване на Т клетки PD-1 и LAG-3 в нетрансдуцираните и STEAP1- BBζ CAR Т клетъчни подгрупи и не наблюдавахме значително увеличение на експресията (допълнителна фигура 6c ). Това откритие предполага ниско или липсващо тонизиращо сигнализиране от STEAP1-BBζ CAR, което е окуражаващо, тъй като конститутивното CAR сигнализиране може да повлияе отрицателно върху ефекторната функция на CAR Т клетките48. И двата фенотипа Т клетки на паметта на стволови клетки (Tscm) и Т клетки на централната памет (TCM) са свързани с терапевтичната ефикасност на терапията с CAR Т клетки, тъй като те насърчават продължителна пролиферация и персистиране in vivo 49–51. Имунофенотипизирането на нетрансдуцирани и STEAP1-BBζ CAR Т клетъчни подгрупи демонстрира по-високи честоти на Tscm клетки в сравнение с Т клетъчните подгрупи в донорни РВМС, от които са получени клетъчните продукти (допълнителна фигура 6d). Този ефект вероятно се дължи на добавянето на IL-7 и/или IL-15 към средата за експанзия на Т клетки, тъй като е доказано, че тези цитокини запазват и подобряват диференциацията на Tscm51,52. Нашият анализ също разкри обогатяване на Tcm популациите, особено в CD8 STEAP1-BBζ CAR Т клетките (допълнителна фигура 6е).
STEAP1-BBζ CAR Т клетки демонстрират значителни антитуморни ефекти в модели на дисеминиран рак на простатата с нативна експресия на STEAP1, установена в имунодефицитни мишки
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
Като първоначален скрининг за in vivo антитуморна активност, ние установихме 22Rv1 подкожни ксенотрансплантирани тумори в мъжки NOD scid gamma (NSG) мишки. Когато туморите нараснат до приблизително 100 mm3, мишките бяха третирани с единична интратуморна инжекция от 5 × 106 нетрансдуцирани Т клетки или STEAP1-BBζ CAR Т клетки. Интратуморното лечение със STEAP1- BBζ CAR Т клетки се свързва със значително инхибиране на туморния растеж, което е статистически значимо до 18-ия ден от лечението (Фиг. 3а). Мишките бяха умъртвени на 25-ия ден и остатъчните тумори от мишки, третирани със STEAP1-BBζ CAR Т клетки, показаха големи участъци от некротични остатъци и области от жизнеспособен тумор бяха инфилтрирани с CD3+ STEAP1-BBζ CAR Т клетки (допълнителна фигура 7а). Експресията на STEAP1 се запазва в туморите в групите на лечение (допълнителна фигура 7b). Ние трансдуцирахме 22Rv1 клетки с лентивирус, за да подсилим експресията на луцифераза (Luc) на светулка и 106 22Rv1-fLuc клетки бяха инжектирани във вените на опашката на мъжки NSG мишки. Метастатичната колонизация се визуализира чрез биолуминесцентно изобразяване на живо (BLI) след две седмици, в който момент мишките бяха третирани с единична интравенозна инжекция от 5 × 106 нетрансдуцирани Т клетки или STEAP1-BBζ CAR Т клетки (Фиг. 3b) . Сериен BLI разкрива бърза прогресия на заболяването при мишки, третирани с нетрансдуцирани Т клетки, докато тези, получаващи STEAP1-BBζ CAR Т клетки, демонстрират значително забавяне в прогресията на тумора (фиг. 3c, d) и удължаване на преживяемостта (97 дни срещу 31 дни , p=0.0018 чрез log-rank тест, фиг. 3e). Няма значителна разлика в теглата на мишките между рамената на лечение (допълнителна фигура 7с). IHC оцветяването на тумори в края на изследването показва значително намаляване на експресията на STEAP1 (допълнителна фигура 7d), което показва, че избягването на антиген е механизъм на резистентност. Въпреки това, това е малко вероятно в резултат на трансдиференциация към вариантно състояние на рак на простатата, тъй като не оценихме морфологичните промени, загубата на експресия на AR и PSMA53 или увеличаване на експресията на SYP (допълнителна фигура 7d). За да изследваме глобалното въздействие на загубата на STEAP1 при рак на простатата, извършихме профилиране на транскриптоми на изогенните 22Rv1 див тип (wt), 22Rv1 STEAP1 ko и 22Rv1 STEAP1 ko + спасителни клетъчни линии, които бяхме подготвили преди това (Фиг. 2b). Диференциален анализ на генната експресия, сравняващ 22Rv1 STEAP1 ko клетки с 22Rv1 wt клетки, идентифицира ~1700 гени, значително понижени (FDR По-малко или равно на 0,05, кратно изменение<2) with STEAP1 knockout. Rescue of STEAP1 expression in the 22Rv1 STEAP1 ko cells revealed that ~600 genes were significantly upregulated (FDR ≤ 0.05, fold-change>2) чрез добавка STEAP1 (допълнителна фигура 8а). Анализът на обогатяване на генния набор (GSEA) номинира няколко биологични пътя, които могат да бъдат нерегулирани чрез модулиране на експресията на STEAP1. Видни сред тях бяха прогресията на клетъчния цикъл и множество метаболитни процеси, включително цикъла на Креб и гликолизата, които бяха отрицателно обогатени от нокаут на STEAP1 и спасени при добавянето на STEAP1 (допълнителна фигура 8b). Ние приложихме валидирания 31-сигнатур на прогресия на генния клетъчен цикъл (CCP)54 към нашите данни, който показа значително понижено регулиране на сигнатурата на CCP, свързано с нокаут STEAP1 с резултат от −0.8, който се увеличи значително до {{ 14}}.5 със спасяването на STEAP1 израз (допълнителна фигура 8c). Тези данни са в съответствие с предишна публикация, показваща, че нокдаунът на STEAP1 в клетъчната линия на рак на простатата LNCaP уврежда клетъчната жизнеспособност и пролиферация, като същевременно индуцира апоптоза37. Ние също така отбелязахме, че обработката и представянето на антиген е един от най-значително де-обогатените KEGG пътища с нокаут STEAP1 (допълнителна фигура 8b). Наблюдавахме значително понижаване на регулацията на гени, включително PSME1 (подединица 1 на протеазомния активатор), който е член на имунопротеазомния комплекс, TAP1 (транспортер 1, член на подсемейството на ATP свързваща касета), който е от решаващо значение за основния хистосъвместим комплекс (MHC) клас I пептид- зареждащ комплекс и няколко MHC клас I и II гени като MR1 (основен комплекс за хистосъвместимост, свързан с клас I), HLA-DQ-B1 и HLA-DQB2 (допълнителна фигура 8d). Допълнително изследвахме туморите, събрани от 22Rv1 дисеминирани модели, третирани със STEAP1- BBζ CAR Т клетъчна терапия, която демонстрира загуба на антиген (Фиг. 3c, Допълнителна Фигура 7d) чрез анализ на транскриптоми. Диференциален анализ на генната експресия и последващ GSEA, сравняващ 22Rv1 метастатични тумори от мишки, третирани с STEAP1-BBζ CAR Т клетъчна терапия, с тези, третирани с нетрансдуцирани Т клетки, показаха отрицателно обогатяване на пътищата, участващи в МНС, цитотоксични лимфоцити и Т клетъчно активиране ( Допълнителна фигура 9a, b). Ние също така специално оценихме експресията на MHC клас I и II гени и наблюдавахме тяхната подчертана регулация надолу в 22Rv1 тумори, лекувани със STEAP1-BBζ CAR Т клетъчна терапия (допълнителна фигура 9c). Този резултат беше допълнително обоснован от значително намаляване на HLA-A, B, C оцветяване от IHC в тези тумори (допълнителна фигура 9d). Потенциалното значение на тези данни е, че лечението със STEAP1-BBζ CAR Т клетъчна терапия и произтичащата от това загуба на експресия на STEAP1 туморен антиген при рак на простатата може да доведе до допълнителна имунотерапевтична резистентност чрез нарушена обработка и представяне на антигена. Ние също инокулирахме мъжки NSG мишки с C4-2B-fLuc клетки чрез инжектиране в опашната вена. C4-2B е резистентна на кастрация подлиния на LNCaP55 с кинетика на растеж, по-скоро в съответствие с типичния рак на простатата. Четири седмици след инжектирането, метастатичната колонизация беше потвърдена от BLI и мишките бяха третирани с единична интравенозна инжекция от 5 × 106 нетрансдуцирани Т клетки или STEAP1-BBζ CAR Т клетки (Фиг. 3b). Серийният BLI показва пълен отговор при всички мишки, които са получили STEAP1-BBζ CAR Т клетки в рамките на пет седмици от лечението (Фиг. 3f, g). Ние идентифицирахме тенденция на повишена загуба на тегло в групата за лечение с нетрансдуцирани Т-клетки (допълнителна фигура 10а), но това не беше статистически значимо. Аутопсията на мишки, третирани със STEAP1-BBζ CAR Т клетки не показва макроскопско заболяване и ex vivo BLI на органи не разкрива никакъв сигнал (допълнителна фигура 10b), което предполага, че тези мишки вероятно са били излекувани. Ние идентифицирахме периферната персистенция на STEAP1-BBζ CAR Т клетки в края на експеримента въз основа на наличието на откриваеми CD3+ EGFRt+ спленоцити (фиг. 3h).
Фиг. 3|In vivo антитуморна активност на STEAP1-BBζ CAR Т клетъчна терапия при модели на рак на простатата с нативна експресия на STEAP1. a Обеми на 22Rv1 подкожни тумори в NSG мишки (n=4 за нетрансдуцирана Т-клетъчна група и n=5 за STEAP1-BBζ CAR Т-клетъчна група) във времето след единична интратуморна инжекция от 5 × 106 нетрансдуцирани Т клетки или STEAP{{10}}BBζ CAR Т клетки при нормални съотношения CD4/CD8. p < 0.0001 на дни 20 и 25. Стълбчетата представляват средната стойност със SEM. b Схема на експерименти за предизвикване на тумор за 22Rv1 (отгоре) и C4-2B (отдолу) дисеминирани модели. Luc луцифераза на светулка, BLI биолуминесцентно изображение. c Серийно живо биолуминесцентно изобразяване (BLI) на NSG мишки, присадени с 22Rv1-fLuc метастази и третирани с единична интравенозна инжекция от 5 × 106 нетрансдуцирани Т клетки или STEAP1-BBζ CAR Т клетки при нормален CD4/ CD8 съотношения на ден 0. Червеното X обозначава починали мишки. Показана е скала на излъчване. d Графика, показваща количественото определяне на общия поток във времето от BLI на живо на всяка мишка в (c). e Криви на оцеляване на Kaplan–Meier на мишки в (c) със статистическа значимост, определена чрез log-rank тест (Mantel-Cox). За панели (c–e) бяха използвани n=5 мишки за условие. f Сериен жив BLI на NSG мишки, присадени с C4-2B метастази и третирани с единична интравенозна инжекция от 5 × 106 нетрансдуцирани Т клетки или STEAP1-BBζ CAR Т клетки при нормални съотношения CD4/CD8 на ден 0. Червеният X обозначава починали мишки. Показана е скала на излъчване. g Графика, показваща количественото определяне на общия поток във времето от BLI на живо на всяка мишка в (f). За панели (f, g) n=4 мишки бяха използвани в групата с нетрансдуцирани Т клетки и n=5 мишки в групата STEAP1-BBζ CAR Т клетки. h Количествено определяне на CD3+ EGFRt+ STEAP1-BBζ CAR Т клетки чрез поточна цитометрия от спленоцити на мишки, третирани със STEAP1-BBζ CAR Т клетки (n=4) в края от експеримента на ден 49. Стълбчетата представляват средната стойност. За панел (а) беше използвана двупосочна ANOVA с тест за множествено сравнение на Sidak. Изходните данни се предоставят във файла с изходни данни.
Мишка в мишка STEAP1 CAR Т клетъчни изследвания демонстрират антитуморна терапевтична ефикасност
Активирането и цитолитичната активност на STEAP1-BBζ CAR Т клетки, наблюдавани в контекста на много ниска плътност на STEAP1 антиген (~1500 молекули/клетка) на PC3 клетъчната линия (фиг. 2g–i, допълнителна фигура 11a, b ) и доказателства за in vivo антитуморна активност в модел на дисеминиран PC3-fLuc тумор (допълнителна фигура 11c–e) изразиха опасения относно потенциала за токсичност извън тумора върху целта. За да оценим потенциалната токсичност в податлив модел на организъм, ние генерирахме човешка STEAP1 knock-in (hSTEAP1-KI) мишка, в която човешкият STEAP1 ген беше избит в локуса на мишия Steap1 ген на C57Bl/6 фон ( Фиг. 4а). Установена е колония от мишки с генотипиране, извършено чрез полимеразна верижна реакция (PCR) на ДНК на опашката (Фиг. 4b). Както хомозиготните, така и хетерозиготните hSTEAP1-KI мишки не показват видими фенотипни или репродуктивни аномалии в сравнение с дивия тип котила. Изследване на тъкани за човешка STEAP1 експресия на базата на количествена PCR с обратна транскрипция (qRT-PCR) беше извършено върху мъжки и женски хетерозиготни hSTEAP1-KI (hSTEAP1-KI/ +) мишки и разкри най-голямата относителна експресия в простатата, последвана от матката и надбъбречната жлеза (фиг. 4в). Допълнителен in situ анализ чрез STEAP1 IHC на мъжка hSTEAP1-KI/ + простата и надбъбречни жлези разкри експресия на човешки STEAP1, ограничена до луминални епителни клетки на простатата (Фиг. 4d) и експресия в надбъбречната кора (Фиг. 4e) . Муринизирана версия на STEAP1 CAR, наречена STEAP1-mBBζ CAR, в която scFv и IgG4 шарнирно-CH2-CH3 спейсърът бяха запазени, но CD28 трансмембранният домен, 4-1BB костимулаторен домен и домейнът за активиране на CD3ζ бяха заменени с техните миши ортолози и бяха клонирани в гамаретровирусна конструкция (фиг. 4f). В допълнение, човешкият EGFRt трансдукционен маркер беше заменен с пресечен миши CD19 (mCD19t), за да се минимизира потенциалната имуногенност. Ние потвърдихме ефективната ретровирусна трансдукция на Т клетки, обогатени от миши спленоцити (фиг. 4g) и демонстрирахме капацитета на миши STEAP1-mBBζ CAR Т клетки да индуцират цитолиза на клетъчната линия RM9 на миши рак на простатата56, проектирана да експресира човешки STEAP1 (RM9- hSTEAP1) чрез лентивирусна трансдукция (фиг. 4h). In vivo ефикасността на миши STEAP1-mBBζ CAR Т клетки беше валидирана в дисеминиран RM9-STEAP1-fLuc туморен модел в NSG мишки (допълнителна фигура 12а). Една седмица след инжектиране на RM9-STEAP1-fLuc клетки в опашната вена, мишките бяха третирани с 5 × 106 нетрансдуцирани миши Т клетки или миши STEAP1-mBBζ CAR Т клетки чрез инжектиране в опашна вена . Мишки, които са получили нетрансдуцирани миши Т-клетки, демонстрират неконтролирана прогресия на заболяването, докато тези, третирани със STEAP1-mBBζ CAR Т-клетки, равномерно показват бърза регресия на заболяването, която е последвана от последващ рецидив десет дни по-късно (допълнителна фигура 12b, c). STEAP1-mBBζ CAR Т клетъчната терапия се свързва със статистически значима полза за преживяемостта (22 дни срещу 12 дни, p=0.0039 чрез log-rank тест, Допълнителна фигура 12d). Загубата на тегло беше очевидна и в двете групи на лечение, тъй като тежестта на тумора се увеличи преди смъртта (допълнителна фигура 12e, f). Анализът на миши спленоцити, събрани при аутопсия, показва периферна персистенция на STEAP1-mBBζ CAR Т клетки с откриване на mCD3+ mCD19t+ клетки до 24 дни след адоптивния трансфер (допълнителна фигура 12g). Белите дробове бяха събрани от мишки и в двете третирани групи и STEAP1 IHC показа загуба на експресия на STEAP1 в белодробни метастази от мишки, третирани със STEAP1-mBBζ CAR Т клетки (допълнителна фигура 12h). Впоследствие разширихме клонални RM9-STEAP1-fLuc линии, за да определим дали наблюдаваното изпускане на туморен антиген може да бъде резултат от съществуваща хетерогенност в експресията на STEAP1. Експериментът беше повторен с клонален, дисеминиран RM9-STEAP1- fLuc туморен модел в NSG мишки (допълнителна фигура 13а). В този контекст, мишки, третирани със STEAP1-mBBζ CAR Т клетки, демонстрират бърз и траен пълен отговор (допълнителна фигура 13b–d). Тези констатации подчертават ефикасността на STEAP1-mBBζ CAR Т клетките при ликвидирането на STEAP1+ рак на простатата и допълнително предполагат, че може да са необходими допълнителни терапевтични стратегии за преодоляване на резистентността в подгрупи пациенти с напреднал рак на простатата, където хетерогенността на STEAP1 експресията е налице (фиг. 1e).
Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система
Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity
【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
STEAP1 CAR T клетъчната терапия е безопасна в хуманизиран миши модел STEAP1
За да изследваме както предклиничната безопасност, така и ефикасността на терапията с STEAP1-mBBζ CAR Т клетки, ние инокулирахме мъжки хетерозиготни hSTEAP1-KI мишки със сингенен, неклонален RM9-STEAP{{4} }fLuc клетки чрез инжектиране на опашна вена (фиг. 5а). След потвърждаване на метастатична колонизация от BLI около седмица по-късно, мишките получават предварително кондициониращ циклофосфамид 100 mg/kg чрез интраперитонеална инжекция57. Ден по-късно мишките бяха рандомизирани за лечение с 5 × 106 нетрансдуцирани миши Т клетки или миши STEAP1-mBBζ CAR Т клетки чрез инжектиране на опашна вена. Всички мишки, които са получили миши STEAP1-mBBζ CAR Т клетки, демонстрират намаляване на туморното натоварване в рамките на първата седмица от започване на лечението въз основа на BLI (фиг. 5b, c). Наблюдаваният отговор беше краткотраен, но доведе до умерено удължаване на преживяемостта (21 дни срещу 12 дни, p=0.0138 чрез log-rank тест, Фиг. 5d) - подобно на констатациите от неклоналното RM 9-STEAP1-fLuc експерименти в NSG мишки (допълнителна фигура 12d). Няма груба токсичност или преждевременни смъртни случаи, специално свързани с мишка STEAP1-mBBζ CAR Т клетъчна терапия при това ниво на дозата, където са наблюдавани ясни доказателства за антитуморна ефикасност. Загубата на тегло е свързана с повишено натоварване на тумора, но е обща за двете рамена на лечение (фиг. 5e, f). За по-нататъшна оценка на потенциалната токсичност на терапията с STEAP1-mBBζ CAR Т клетки, подобен експеримент беше проведен успоредно с хетерозиготни hSTEAP1-KI мишки, носещи RM9-hSTEAP1 тумори и без тумори. Не-туморни мишки, третирани с нетрансдуцирани Т клетки или STEAP1- mBBζ CAR Т клетки, не демонстрират никакви разлики в преживяемостта (допълнителна фигура 14а) или груба токсичност, включително загуба на телесно тегло (допълнителна фигура 14b). Тъй като STEAP1-BBζ CAR се състои от модифициран IgG4 спейсър, който потенциално може да бъде имуногенен, ние оценихме отговора на миши анти-човешки антитела (MAHA) чрез събиране на ретроорбитални кръвоизливи от мишки в този експеримент. Не са открити античовешки IgG и IgM антитела в серумите на мишки на 8-ия ден след третиране със STEAP1-BBζ CAR Т клетки (допълнителна фигура 14с).
Важно е, че хетерозиготни hSTEAP1-KI мишки, третирани със STEAP1-mBBζ CAR Т клетки, не показват очевидно разрушаване на тъканите или повишена инфилтрация на CD3+ Т клетки в простатата (допълнителна фигура 15a, b ) или надбъбречна жлеза (допълнителна фигура 15c, d) по отношение на техните двойници, третирани с нетрансдуцирани Т клетки, което предполага липсата на целева извънтуморна токсичност. Белите дробове, събрани в края на експеримента, показват експресия на човешки STEAP1 в RM9-hSTEAP1 белодробни метастази с регионална хетерогенност при мишки, третирани с нетрансдуцирани миши Т клетки (фиг. 5g). От друга страна, тумори от мишки, третирани с миши STEAP1-mBBζ CAR Т клетки отново демонстрират липса на експресия на човешки STEAP1 (фиг. 5h). За да оценим дали терапията с миши STEAP1- mBBζ CAR Т клетки и загубата на човешки STEAP1 антиген може също да повлияе представянето на антиген в RM9-hSTEAP1 туморите, ние проведохме IHC за миши бета-2-микроглобулин (B2m ), който е ключов компонент на МНС клас I молекули. Наблюдавахме значително понижаване на експресията на B2m в прогресивни тумори след лечение с миши STEAP1-mBBζ CAR Т клетки в сравнение с нетрансдуцирани Т клетки (допълнителна фигура 15e, f), в съответствие с нашите открития в модела 22Rv1.
Фиг. 4|Създаване на система мишка в мишка с човешки STEAP1 нокаутиран (hSTEAP1-KI) модел на мишка и муринизиран STEAP1 CAR. Схема, показваща стратегията на хомоложна рекомбинация, използваща насочващ вектор за вкарване на човешки STEAP1 екзони 2–5 в мишия Steap1 локус на фона на C57Bl/6. Цел за разпознаване на FRT Flippase. b Визуализация на PCR продукти от генотипизиране на върха на опашката на див тип (+/+), хетерозиготни (KI/+) или хомозиготни (KI/KI) мишки, като се използват двойки праймери, предназначени да амплифицират части от див тип или hSTEAP1-KI алели . Контрол на NTC нулев шаблон. Представително изображение на гел от n=3 биологично независими експеримента. c qPCR за експресия на човешки STEAP1, нормализирана до експресия на 18 S в изследване на тъкани от hSTEAP1-KI/+ мишки. n=3 за специфични за пола органи и n=6 за общи органи. Стълбчетата представляват средната стойност със SEM. Фотомикрографии на STEAP1 IHC оцветяване на (d) тъкани на простатата от (вляво) +/+ и (вдясно) KI/+ мишки и (e) надбъбречна жлеза от KI/+ мишка. Скалови ленти=50 µm. За панел (d, e) STEAP1 имунооцветяването беше извършено върху n=3 биологично независими проби. f Схема на ретровирусна муринизирана STEAP1 CAR конструкция. MuLV вирус на миша левкемия, mCD19t миши съкратен CD19. g Количествено определяне на ефективността на ретровирусна трансдукция на активирани миши Т-клетки от три независими експеримента въз основа на честотата на миши CD3+ CD19t+ клетки чрез поточна цитометрия (p {{40}}.0003). h Относителна клетъчна жизнеспособност на RM9 или RM9-hSTEAP1 прицелни клетки с течение на времето, измерена чрез флуоресцентно изобразяване на живи клетки при съвместно култивиране в съотношение 1:1 с миши STEAP1-mBBζ CAR Т клетки или нетрансдуцирани Т клетки (р <0,0001). n=4 биологични реплики за условие. Лентите за грешки представляват средната стойност със SEM. За панел (g) беше използван несдвоен двустранен t-тест на Student с корекция на Welch. В панел (h) беше използвана двупосочна ANOVA с тест за множествено сравнение на Sidak. Изходните данни се предоставят във файла с изходни данни.
Фиг. 5|Определяне на ефикасността и безопасността на миши STEAP1-mBBζ CAR Т клетки в hSTEAP1-KI мишки, носещи сингенен, дисеминиран рак на простатата.
Слетият цитокин на колаген-свързващ домен-IL-12 предизвиква антитуморни отговори чрез усилено Т-клетъчно рецепторно сигнализиране и представяне на антиген
IL{{0}} е хетеродимерен цитокин, състоящ се от p40 и p35 субединици, който регулира отговорите на Т клетките и води до производството на IFN-. Поразителни противотуморни реакции, свързани със системно приложение на IL-12, са демонстрирани в няколко предклинични модела58,59, но преводът на този терапевтичен подход в клиниката е в застой поради ограничаваща дозата токсичност и неефикасност60–63. Алтернативни стратегии за заобикаляне на тези проблеми са насочени към локализиране на IL{{10}} към тумори, или чрез интратуморно доставяне, или чрез инженерни IL-12 слети протеини, за да се използват уникалните свойства на туморната микросреда. Един наскоро описан подход е сливане с домейна на фактор А3 на von Willebrand, който служи като колаген-свързващ домен (CBD, Фиг. 6а) и позволява свързването на слети протеини към открития колаген в нарушена туморна васкулатура64. Показано е, че системната CBD-IL-12 терапия ремоделира туморната микросреда на имунологично "студен" миши рак на гърдата и модели на меланома чрез усилено IFN-сигнализиране и си сътрудничи с анти-PD{{20}} инхибиране на имунната контролна точка за предизвикване на ерадикация на тумора65. Попитахме дали CBD-IL-12 може да бъде ефективен при превръщането на рака на простатата от „студен“ в „горещ“ и предизвикване на антитуморни реакции. Подкожни, сингенни RM9 и Myc-CaP тумори бяха установени съответно при мъжки C57Bl/6 и FVB мишки и мишките бяха рандомизирани за лечение с носител, анти-PD-1 или CBD-IL-12 . Системното приложение на CBD-IL-12 индуцира значително инхибиране на туморния растеж както в сингенни RM9, така и в Myc-CaP туморни модели, които иначе реагират слабо на анти-PD{37}} терапия (Фиг. 6b, Допълнителна Фигура 16a) . За да придобием допълнителна представа за механизмите на действие на CBD-IL-12, извършихме едноклетъчен RNA-seq (scRNA-seq) анализ на RM9 тумори от мишки, третирани или с носител, или с CBDIL-12. Графиките на еднаквото приближаване на колектора и проекцията разкриват значително намаляване на туморните епителни, фибробластни и ендотелни клетъчни отделения (допълнителна фигура 16b), съответстващи на антитуморната активност. Базираното на маркери профилиране на вродени и адаптивни имунни клетъчни подгрупи (фиг. 6c, d) в данните от scRNA-seq идентифицира значително увеличение на CD8+ Т клетки (7,55 срещу 0.76%) , клетки с кръстосано представяне на антиген, включително XCR1+ IRF8+ конвенционална дендритна клетка тип 1 (cDC1, 1,33 спрямо 0%), CD86+ INOS2+ M1 поляризирани макрофаги ( 2,26 срещу 0%) и CD64+ F4/ 80+ моноцити/макрофаги (29,2 срещу 4,43%) в тумори от групата на лечение с CBDIL-12 в сравнение с контролната група с носител. Намаляване на имуносупресивните CD163+ CD206+ M2 поляризирани макрофаги (0 спрямо 0,25%) и Ly6G+ неутрофили (0,52 спрямо 1,08%) също се свързва с терапията с CBD-IL-12. IHC анализът потвърди, че RM9 тумори, третирани с носител, като цяло нямат CD8+ Т клетки, докато тези, третирани с CBD-IL-12 показват видимо значителна инфилтрация на CD8+ Т клетки (допълнителна фигура 16c) . Туморните клетки демонстрират обогатена експресия на протеазомните и имунопротеазомните субединици Psmb8 и Psmb9 и главния комплекс за хистосъвместимост клас I (MHC I) гени H2-K1, H2-D1 и B2m, в съответствие с регулирането на антигенната обработка и машини за представяне (фиг. 6e, допълнителна фигура 16d). Успоредно с това, Т клетките показват повишена генна експресия, свързана с Т клетъчно рецепторно сигнализиране и имунорегулаторни взаимодействия между лимфоидна и нелимфоидна клетка (фиг. 6f, допълнителна фигура 16e). Клетките на мононуклеарната фагоцитна система (MPS) показват обогатена генна експресия, свързана с обработката на антигена и кръстосаното представяне, както и цитокинова сигнализация (допълнителна фигура 16f, g). Тези проучвания установяват антитуморната активност на CBD-IL- 12 в модели на рак на простатата чрез препрограмиране на туморната микросреда и ангажиране както на вродената, така и на адаптивната имунна система.
Подобрен контрол на тумора със съпътстваща терапия със STEAP1-mBBζ CAR T клетки и CBD-IL-12
След това предположихме, че разширяването на антитуморния имунен отговор с терапия с CBD-IL-12 може да подобри терапевтичната ефикасност на терапията с STEAP1-mBBζ CAR Т клетки при рак на простатата чрез борба с хетерогенността на туморния антиген и спасяване на антигенната обработка и представяне. Следователно ние установихме сингенни, неклонални RM9-STEAP1-fLuc метастази в мъжки хетерозиготни hSTEAP1-KI мишки и рандомизирани за лечение с 5 × 106 нетрансдуцирани миши Т клетки или миши STEAP1-mBBζ CAR Т клетки чрез инжектиране в опашната вена със или без седмична терапия с CBD-IL-12 чрез инжектиране в ретроорбитален синус. Групи, които са получили CBD-IL-12 терапия самостоятелно или в комбинация със STEAP1-mBBζ CAR T терапия, не са получили лимфоизчерпващ циклофосфамид (фиг. 7а). Сериен BLI разкрива бърза прогресия на заболяването при мишки, третирани с нетрансдуцирани Т клетки и CBD-IL-12, докато тези, получаващи STEAP1-BBζ CAR Т клетки в комбинация с CBD-IL-12 терапия, демонстрират значително забавяне на прогресията на тумора (фиг. 7b, c). Важно е, че комбинираното лечение с миши STEAP1- mBBζ CAR Т клетки и седмично CBD-IL-12 се свързва със статистически значимо удължаване на общата преживяемост в сравнение с всички други групи на лечение (фиг. 7d). Анализът на плазмени цитокини върху ретроорбитални кръвоизливи, събрани на ден 0 и ден 8 от лечението, показва значително повишаване на нивата на провъзпалителните цитокини IFN-, TNF-, IL-6 и IL-4 (фиг. 7e, допълнителна фигура 17) при мишки, третирани със STEAP1-mBBζ CAR Т клетки и CBD-IL-12. Остатъчните тумори бяха събрани при аутопсия и STEAP1 IHC показа загуба на антиген в тумори от мишки, третирани както с STEAP1- mBBζ CAR Т клетки самостоятелно, така и в комбинация с CBD-IL-12 (фиг. 8а). В допълнение, ние наблюдавахме увеличаване на експресията на тумор B2m (фиг. 8а), свързана с терапията с CBD-IL-12. CD3+ Т клетките също бяха увеличени (Фиг. 8b) при туморни състояния, подложени на терапия с IL-12, но въпреки че беше оценена тенденция, не открихме статистически значимо увеличение на интратуморните Т клетки между STEAP1-mBBζ CAR T клетки и комбинирани STEAP1-mBBζ CAR T клетки и групи за лечение с CBD-IL-12. Остатъчните тумори, включително тези от мишки, третирани с комбинирани STEAP1-mBBζ CAR Т клетки и CBD-IL-12, събрани при максимален отговор на лечението (надир) на 10-ия ден и в крайни точки на състрадание за прогресия на тумора (рецидив), бяха дисоциирани до единични клетки и подгрупи от имунни клетки се характеризират с многопараметрична поточна цитометрия (допълнителна фигура 18). В съответствие с нашите резултати от scRNA-seq, лечението с CBD-IL-12 самостоятелно или в комбинация със STEAP1-mBBζ CAR Т клетки доведе до значително увеличение на CD11b+ Ly6C-/+F4/{{68 }} MHC-II+ макрофаги (фиг. 8c, d, допълнителна фигура 19a). CD11b+ Ly6CF4/80+ MHC-II+ клетките представляват зрели антиген-представящи макрофаги66 и тази популация е преференциално обогатена и демонстрира повишена индуцирана експресия на азотен оксид синтаза (iNOS) като маркер за провъзпалителна M1 поляризация с CBD-IL{{84} } терапия. Ние също така наблюдавахме разширяване на популацията на cDC1 и намаляване на популацията на конвенционалните дендритни клетки тип 2 (cDC2) (фиг. 8e, допълнителна фигура 19b). cDC1 е замесен в активирането на антитуморни цитотоксични CD8+ Т клетки и потенциални механизми на терапевтична резистентност. Не открихме признаци на клетъчна миграция към тумора, докато cDC2 са важни за активирането на значителна разлика в съотношенията на KLRG1+ и KLRG1- естествен убиец на CD4+ Т клетки, включително Tregs67 . В съответствие с констатациите на cDC2, клетките в групите на лечение (допълнителна фигура 19d). Профилирането на честотите на CD4+ FOXP3+ Tregs разкри намаление на Tregs asso- на F40/80+ SiglecF+ еозинофилите са повишени, докато Ly6G+ е възстановен с CBD-IL-12 терапия (допълнителна Фигура 19в). Интересно е, че трофилите бяха намалени с добавянето на CBD-IL-12 към STEAP1-, наблюдавахме, че при рецидивиращи тумори след комбинирана STEAP1-mBBζ mBBζ CAR Т клетъчна терапия (фиг. 8f, g). Трябва да се отбележи, че честотата на тези терапии с CAR Т клетки и CBD-IL-12 е налице намаление на cDC1 и свързаните с тумора неутрофили са повишени с лечение с увеличение на Tregs, което предполага намалено иницииране на цитотоксичния CD8 STEAP{{120 }}mBBζ CAR Т клетки в сравнение с нетрансдуцирани Т клетки (54 спрямо Т клетки и обогатяване на имуносупресивно Treg сигнализиране като 34%), намалени при състояния с CBD-IL-12 терапия, но увеличени при рецидив на тумор след комбиниран STEAP 1-mBBζ CAR Т клетки и CBD-IL-12 терапия (19 до 42%). Тези открития предполагат, че имуносупресивните свойства на свързаните с тумора неутрофили могат да играят важна роля в медиирането на резистентността към лечението и прогресията на тумора. Като цяло, тези анализи показват, че лечението с CBD-IL-12 връща враждебната имуносупресивна туморна среда към провъзпалително състояние и разширява антитуморната активност във връзка с адоптивно прехвърлената STEAP1-mBBζ CAR Т клетъчна терапия. Освен това извършихме анализ на TCR репертоара, използвайки мултиплексно PCR-базирано TCR бета верижно секвениране68 върху белодробни тумори, събрани от всяка група на лечение при аутопсия. Наблюдавахме значително намаляване на клоналността на Симпсън в проби от мишки, третирани само с CBD-IL-12 и в комбинация със STEAP1-mBBζ CAR Т клетъчна терапия, което е показателно за повишено интратуморно Т клетъчно разнообразие (фиг. 8h). Тези констатации установяват, че добавянето на CBD-IL-12 като допълнение към терапията с Т клетки STEAP1 CAR може да бъде от полза чрез ремоделиране на микросредата на тумора на рак на простатата, подобряване на обработката и представянето на антигена и ангажиране на имунитета на гостоприемника за насърчаване на разпространението на епитоп.
Фиг. 6|Терапията със слят цитокин със системен колаген-свързващ домен IL-12 (CBD-IL-12) инхибира туморния растеж на рак на простатата и препрограмира туморната имунна микросреда. Схема на CBD-IL-12, съставена от субединиците p35 и p40, слети с CBD от домейн на фактор на von Willebrand A3. b Обеми на RM9 подкожни тумори в сингенни C57Bl/6 мишки във времето с лечение с носител, анти-PD-1 (клон 29 F.1A12) 200 Μg чрез интраперитонеално инжектиране на всеки 5 дни, или CBD-IL-12 25 Μg чрез интравенозна инжекция на всеки 5 дни, започвайки от ден 0. n=7 мишки в групи, третирани с носител и CBD-IL-12 и n=8 мишки в анти -група, лекувана с PD1. p <0.0001 на дни 9 и 12. Стълбчетата представляват средната стойност със SEM. P-стойностите са получени от двупосочен ANOVA с теста на Dunnett за множество сравнения, ns не е значим. c Графики на Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) на различни подгрупи на имунни клетки (отгоре) от едноклетъчен RNA-seq (scRNA-seq) анализ на пет RM9 тумора, всеки агрегиран от мишки, третирани с носител или CBD-IL{{41} }. UMAP графики, оцветени с генна експресия на специфични маркери за подмножество на имунни клетки за панмоноцити/макрофаги, M1 и M2 поляризирани макрофаги, конвенционални тип 1 дендритни клетки (cDC1), клетки естествени убийци (NK) и Т хелпер тип 1 (Th1) клетки. d Графики, показващи честотата на специфични имунни клетъчни популации (спрямо CD45 + имунни клетки), идентифицирани чрез scRNA-seq анализ, включително CD4+ и CD8+ Т клетки, Th1 (Infg+ Tbx{ {56}} ) и Th2 (cMAF+ Gata3+ ) клетки, Ly6C+/− моноцити/макрофаги (Ly6C+/− Adgre1+ ), M1 макрофаги (CD80+ CD{{67} } INOS2+ ), M2 макрофаги (CD163+ Mrc1+ cMAF+ ), cDC1 (XCR1+ IRF8+ ), конвенционални тип 2 дендритни клетки (cDC2 , CD1+ IRF4+ ), мигриращи CD103+ дендритни клетки (Itgae+ ), еозинофили (SiglecF+), неутрофили (Ly6G+) и NK клетки (Klrb1c+ Ncr1+ ) при тумори, лекувани с носител или CBDIL-12. Графики на вулкани, показващи диференциална генна експресия в (e) туморни клетки и (f) Т клетки от RM9 тумори на мишки, третирани с CBD-IL-12 спрямо тези, третирани с носител. Промяна на FC сгъване, процент на фалшиви открития на FDR. Изходните данни се предоставят във файла с изходни данни.
Дискусия
Ефективността на терапията с CAR Т клетки и други имуно-базирани целеви терапевтични средства е силно зависима от последователната експресия на антиген върху всички или повечето клетки, съставляващи туморната популация в рамките на отделен пациент. Въпреки това, хетерогенността на антигена е изразена при солидни тумори, включително рак на простатата, където прогресията до mCRPC и резистентността към лечението са свързани с появата на различни подтипове на заболяването, белязани от различни транскрипционни програми–71 и експресия на антиген на клетъчната повърхност. Докато PSMA се счита за един от най-важните биомаркери при рак на простатата със значителна свръхекспресия, открита в целия спектър на прогресия на заболяването, нашата работа потвърждава констатациите от скорошна публикация14, показваща, че експресията на PSMA е хетерогенна при летален mCRPC. Ние показваме, че STEAP1 е по-широко изразен от PSMA в тази настройка, но в никакъв случай не се експресира равномерно на високи нива във всички mCRPC тъкани. Никоя отделна терапия, насочена към антиген, включително терапия с CAR Т клетки, може да не е в състояние да преодолее вече съществуваща хетерогенност на туморен антиген в mCRPC. По този начин е от решаващо значение задълбочено удостоверяване на допълнителни терапевтични цели като STEAP1 в mCRPC, които могат да позволят комбинаторни терапии, които упражняват непреодолим терапевтичен натиск. Те включват двойно насочени към антиген (напр. PSMA и STEAP1) CAR T клетъчни терапии или мултимодални стратегии, комбиниращи CAR T клетъчни терапии с ADC, T-BsAbs или други лечения, които мощно насърчават антиген-независимо и зависимо убиване на тумори. Създадохме STEAP{12}}насочена CAR Т клетъчна терапия, която е силно антиген-специфична и функционално локализира епитопа, разпознат от CAR към втория ECD на STEAP1. Нашите STEAP1-BBζ CAR Т-клетки демонстрират значителна антитуморна активност срещу множество разпространени модели на рак на простатата както при проучвания при хора в мишки, така и при проучвания при мишки. Важно е, че нашият STEAP1-BBζ CAR е способен да индуцира Т клетъчно активиране и цитолиза на целеви клетки дори при условия на ниска плътност на антигена, както се вижда от реактивността срещу PC3 модела на рак на простатата. Въпреки това, тази чувствителност на STEAP1-BBζ CAR Т клетките към ниски нива на експресия на STEAP1 може да бъде изгодна от гледна точка на повишаване на антитуморната ефикасност, но може също така да акцентира върху пасивите от токсичността извън тумора върху целта. Системната експресия на STEAP1 по-рано е докладвана като практически липсваща в нормалните човешки тъкани 18, 72 с изключение на простатната жлеза, където е описана мембранна експресия в епителните клетки на простатата 27. За да се задълбочим в безопасността на STEAP1-BBζCAR Т клетъчната терапия в предклиничните условия, ние генерирахме хуманизиран модел на мишка STEAP1. Моделът на мишка hSTEAP1-KI обобщава експресията на човешки STEAP1 в простатната жлеза и показва експресия в надбъбречната кора. Успокоително, STEAP1-BBζ CAR Т клетъчна терапия в доза, достатъчна да индуцира антитуморна активност, не доведе до явна системна токсичност при hSTEAP1-KI мишки, включително таргетна извънтуморна токсичност в местата на човешки STEAP1 изразяване. Повтарящ се механизъм на рецидив и прогресия на рак на простатата след STEAP1-BBζ CAR Т клетъчна терапия в нашите проучвания е бягството на туморен антиген. От една страна, това откритие подчертава цялостната ефективност на STEAP1-BBζ CAR T клетъчната терапия. Въпреки това, не е ясно дали загубата на експресия на туморен STEAP1 се дължи единствено на присъщата хетерогенност на туморния антиген или дали има и адаптивна регулация надолу на експресията на STEAP1. Скорошна публикация показа, че промоторното метилиране на STEAP1 модулира експресията на STEAP1 и епигенетичната дерегулация чрез инхибиране на ДНК метилтрансфераза и хистон деацетилаза е достатъчно за значително повишаване на експресията на STEAP173. Лечението с епигенетични инхибитори в комбинация с STEAP1 CAR T клетъчна терапия може едновременно да подобри туморната STEAP1 експресия и да препрограмира CAR T клетките до благоприятни състояния на диференциация, устойчиви на изтощение74,75, като по този начин смекчава загубата на туморен антиген и повишава антитуморната ефикасност при рак на простатата. Нашето проучване също предполага, че STEAP1 играе функционална роля в регулирането на прогресията на клетъчния цикъл и клетъчния метаболизъм при рак на простатата. STEAP1 е уникален от другите членове на семейството STEAP (STEAP2, 3 и 4) с това, че му липсва вътреклетъчен оксидоредуктазен домен22, който е необходим за активността на металоредуктазата. В резултат на това STEAP1 хомотримерите, но не и хетеротримерите с други STEAP протеини, нямат ензимната функция да редуцират Fe3+ до Fe2+ и Cu2+ до Cu1+. Дали и как участието на STEAP1 в металните йони и клетъчния метаболизъм насърчава прогресията на рака все още не е определено и заслужава допълнително изследване. Имунологично „студената“ туморна микросреда на рака на простатата е основна пречка за ефикасността на имунотерапиите срещу рак. Например, проучвателни проучвания, свързани с фаза I клинично изпитване на PSMA CAR Т клетъчна терапия, бронирана за експресиране на доминантно-отрицателен рецептор на трансформиращ растежен фактор (TGF R-DN) в mCRPC, показаха, че експресията на имуносупресивни сигнални молекули в туморната микросреда се увеличава след инфузия на CAR T13. В нашите проучвания критично откритие беше връзката между загубата на експресия на STEAP1 и понижаване на регулацията на обработката и представянето на антигена, както в STEAP1 нокаут клетки, така и в тумори със загуба на антиген на STEAP1 след терапия с STEAP1-BBζ CAR Т клетки. По този начин загубата на STEAP1 антиген при рак на простатата насърчава не само директната резистентност към терапията с STEAP1-BBζ CAR Т клетки, но може също така да ограничи адаптивния антитуморен имунитет на гостоприемника. Загуба на експресия на туморен целеви антиген и превръщане в по-имуносупресивно състояние с повишена инфилтрация на Tregs и по-висока експресия на имуносупресивни молекули също се наблюдава във фаза I проучване на EGFR-vIII CAR Т клетки при участници с рецидивиращ глиобластом76. Ще бъде необходима допълнителна работа, за да се разберат функционалните механизми, лежащи в основата на загубата на антиген на STEAP1 и по-общо как динамичните ефекти на адоптивната CAR T клетъчна терапия могат да допринесат за загуба на антиген и имуноредактиране чрез модулиране на туморно-имунно-стромални взаимодействия в солидни тумори.
Фиг. 7|Комбинирането на CBD-IL-12 със STEAP1-mBBζ CAR Т клетъчна терапия подобрява общата преживяемост и нивата на възпалителни цитокини. Схема на експеримента за предизвикване на тумор за RM9-hSTEAP1 разпространен модел в hSTEAP1-KI/+ мишки, изследващи комбинацията от CBD-IL-12 със STEAP{{1{{18} }}}mBBζ CAR Т клетъчна терапия. Cy циклофосфамид (за предварителна подготовка). Създаден с BioRender.com. b Сериен жив BLI на hSTEAP1-KI/ + мишки, присадени с RM9-hSTEAP1- fLuc метастази и третирани с единична интравенозна инжекция от 5 × 106 нетрансдуцирани мишки Т клетки или STEAP1-mBBζ CAR Т клетки на ден 0 със или без лечение с CBD-IL- 12 всяка седмица. Червеният X обозначава починали мишки. Показана е скалата на излъчване. (c) Графика, показваща количественото определяне на общия поток във времето от BLI на живо на всяка мишка в (b). d Криви на оцеляване на Kaplan–Meier на мишки в (b) със статистическа значимост, определена чрез log-rank (Mantel-Cox) тест (p=0.002). e Графики, показващи нивата на серумните цитокини на IFN- (вляво, p=0.002) и TNF- (вдясно, p < 0.0001) на базата на имуноанализа на ProcartaPlex от ретроорбитални кръвоизливи на hSTEAP1-KI/+ мишки ( n=4 мишки на група), носещи RM9-hSTEAP1-fLuc метастази преди (ден 0) и след лечение (ден 8) с нетрансдуцирани миши Т клетки или миши STEAP{{38} }mBBζ CAR Т клетки със или без CBD-IL-12 терапия. Лентата за грешки представлява средна стойност със SEM. За панел (e), p-стойностите са получени от двупосочен ANOVA с теста за множество сравнения на Sidak. Изходните данни се предоставят във файла с изходни данни.
Фиг. 8|Комбинирането на CBD-IL-12 със STEAP1-mBBζ CAR Т клетъчна терапия препрограмира туморната имунна микросреда и насърчава представянето на антиген и разпространението на епитоп. a Микрофотографии на STEAP1 (отгоре), B2m (в средата) и CD3 (отдолу) IHC оцветяване на RM9-hSTEAP1 белодробни тумори след лечение с миши нетрансдуцирани Т клетки или STEAP1-mBBζ CAR Т клетки с или без лечение с CBD-IL-12. Скалови ленти=50 µm. b Диаграма, показваща IHC количествено определяне на CD3 положителни клетки, инфилтриращи метастатичните белодробни тумори (n=4 тумори на група). Еднопосочен ANOVA p=0.{{80}}021. Лентата за грешки представлява средна стойност с SD. Графики, показващи честотите на (c) Ly6C− F4/{{20}} MHC-II+ (вляво, еднопосочен ANOVA p=0.00{ {98}}5) и Ly6C − F4/80+ iNOS2+ (дясно, еднопосочна ANOVA p=0.0017) макрофаги, (d) Ly6C+ F4/ {{36} } MHC-II+ (вляво, еднопосочен ANOVA p=0.0038) и Ly6C+ F4/80+ iNOS2+ (вдясно, еднопосочен ANOVA p=ns) макрофаги, (e) CD11b+ XCR1+ cDC1 (еднопосочен ANOVA p=0.0003), (f) F4/80+ SiglecF+ еозинофили (еднопосочен ANOVA p=0. 0008) и (g) Ly6G+ неутрофили (еднопосочна ANOVA p=0.0035), нормализирани към общия брой CD45+ клетки, както е определено чрез мултипараметрична поточна цитометрия след третиране с нетрансдуцирани Т клетки, STEAP{{67 }}mBBζ CAR Т клетки, нетрансдуцирани Т клетки и CBD-IL-12 и STEAP1- mBBζ CAR Т клетки и CBD-IL-12 при максимален отговор на лечението (надир) и рецидив на тумора (рецидив). h Стълбовидни диаграми, представящи клоналността на Симпсън като мярка за „равномерност“ на репертоара на TCR, анализиран чрез секвениране на TCRB върху клетки, инфилтриращи тумор, събрани от мишки в (а). n=4 тумори на група. P-стойности за нетрансдуцирани Т клетки + CBD-IL-12 в сравнение с нетрансдуцирани Т клетки и STEAP1-mBBζ CAR Т клетки са съответно 0,008 и 0,02; и STEAP1-mBBζ CAR Т клетки + CBD-IL-12 в сравнение с нетрансдуцирани и STEAP1-mBBζ CAR Т клетки са съответно 0,004 и 0,01. Лентата за грешки представлява средна стойност с SD. За панели (c–g) n=3 тумори на група, *p <0,05; **p <0,01, ***p <0,001, p-стойностите в панелите (b–h) са от еднопосочен ANOVA с теста за множество сравнения на Dunn. Изходните данни се предоставят във файла с изходни данни.
За да разширим антитуморния отговор, ние изследвахме системното приложение на CBD-IL-12 в комбинация със STEAP1-BBζ CAR Т клетъчна терапия в дисеминиран, сингенен RM9-hSTEAP1 туморен модел в hSTEAP 1-KI мишки за приближаване на имуносупресивния характер на mCRPC въз основа на предварително характеризиране на RM9 като слабо имуногенен модел57,77. Съвместното лечение с CBD-IL12 доведе до подобрения в общата преживяемост, производството на цитокини, представянето на туморен антиген и интратуморното Т клетъчно разнообразие в съответствие с разпространението на епитопа. Внимателното изследване на туморната имунна микросреда разкри, че добавянето на CBD-IL-12 към STEAP1-BBζ CAR Т клетъчна терапия индуцира туморна стромална реверсия и засилва активираните макрофаги и cDC1, като същевременно намалява свързаните с тумора неутрофили. Въпреки това, лечението не е постигнато в нашите проучвания и ние подчертаваме потенциални компенсаторни, адаптивни механизми на резистентност и прогресия на тумора, включително повишени честоти на имуносупресивни неутрофили и cDC2, които могат да стимулират индукцията на Treg. Важно е да се отбележи, че може да е необходимо допълнително оптимизиране на дозата и графика на приложение на CBD-IL-12, за да се максимизират антитуморните отговори. Тези резултати обаче подкрепят изследването на комбинаторни имунотерапевтични подходи като брониране на CAR Т клетки за експресия на рекомбинантни цитокини78 (напр. IL-2, IL-12, IL-15 или IL{{24 }}), едновременно лечение с имуномодулатори (напр. анти-PD-1/PD-L1 или анти-CTLA4) или тумор-насочена лъчетерапия за ремоделиране на туморната микросреда на рак на простатата и подобряване на CAR Т клетъчната ефекторна функция. Докато този ръкопис беше в процес на подготовка, проучване от група в Норвегия докладва за предклинично развитие на STEAP1 CAR Т клетъчна терапия с антитуморна активност в подкожен 22Rv1 модел при имунокомпрометирани мишки79. Докладваният STEAP1 CAR се различава от STEAP1-BBζ CAR, тъй като включва синтетичен scFv, наречен Oslo1, и CD8 шарнир и трансмембранен домейн. Друга отличителна черта е, че STEAP1-BBζ CAR Т клетките се приготвят като определен продукт с нормално съотношение на CD4/CD8 Т клетки, докато Oslo1 STEAP1 CAR Т клетките не са. Не са докладвани механизми на резистентност и проучвания за безопасност, свързани с Oslo1 STEAP1 CAR T клетъчна терапия. Въпреки това ще бъде интересно да се види как тези разлики в CAR инженерството и състава на клетъчните продукти могат да повлияят на антитуморната ефикасност, устойчивост и безопасност както на Oslo1 STEAP1 CAR T клетъчна терапия, така и на нашата STEAP1-BBζ CAR T клетъчна терапия програмите се превеждат в клиниката. Констатациите от нашите проучвания доведоха до партньорство с Програмата за експериментална терапия (NExT) на Националния институт по рака (NCI) за превеждане на STEAP1-BBζ CAR T клетъчна терапия в първо изпитване при хора при мъже с mCRPC. Сигналите за безопасност и ефикасност от това клинично изпитване в ранна фаза ще помогнат да се определи дали може също да има стойност в изследването на този терапевтичен подход за други видове рак, които силно експресират STEAP1.
Препратки
1. Siegel, RL, Miller, KD, Fuchs, HE & Jemal, A. Ракова статистика, 2022. CA: Cancer J. Clinicians 72, 7–33 (2022).
2. Armstrong, AJ et al. Петгодишна прогноза за преживяемост и резултати за безопасност с ензалутамид при мъже с метастатичен, резистентен на химиотерапия рак на простатата, устойчив на кастрация, от проучването PREVAIL. Евро. Урол. 78, 347–357 (2020).
3. Fizazi, K. et al. Абиратерон плюс преднизон при метастатичен, чувствителен към кастрация рак на простатата. Н. англ. J. Med. 377, 352–360 (2017).
4. Scher, HI et al. Повишена преживяемост с ензалутамид при рак на простатата след химиотерапия. Н. англ. J. Med. 367, 1187–1197 (2012).
5. Parker, C. et al. Алфа емитер радий-223 и преживяемост при метастатичен рак на простатата. Н. англ. J. Med. 369, 213–223 (2013).
6. Sartor, O. et al. Лутеций-177–PSMA-617 за метастатичен, устойчив на кастрация рак на простатата. Н. англ. J. Med. 385, 1091–1103 (2021).
7. Kantoff, PW et al. Sipuleucel-T имунотерапия за резистентен на кастрация рак на простатата. Н. англ. J. Med. 363, 411–422 (2010).
8. Jackson, HJ, Rafiq, S. & Brentjens, RJ Driving CAR T-cells forward. Нац. Rev. Clin. Oncol. 13, 370–383 (2016).
9. Weiner, GJ Изграждане на по-добра терапия, базирана на моноклонални антитела. Нац. Rev. Cancer 15, 361–370 (2015).
10. Chavez, JC, Bachmeier, C. & Kharfan-Dabaja, MA CAR T-клетъчна терапия за B-клетъчни лимфоми: резултати от клинични изпитвания на налични продукти. Therapeutic Adv. Hematol. 10, 2040620719841581 (2019).
11. Sterner, RC & Sterner, RM CAR-T клетъчна терапия: текущи ограничения и потенциални стратегии. Рак на кръвта J. 11, 69 (2021).
12. Slovin, SF et al. Фаза 1 проучване на P-PSMA-101 CAR-T клетки при пациенти с метастатичен резистентен на кастрация рак на простатата (mCRPC). J. Clin. Oncol. 40, 98–98 (2022).
13. Narayan, V. et al. PSMA-насочени TGF-нечувствителни бронирани CAR Т клетки при метастатичен резистентен на кастрация рак на простатата: изпитване фаза 1. Нац. Med. 28, 724–734 (2022).
14. Paschalis, A. et al. Простатно-специфична мембранна антигенна хетерогенност и дефекти на възстановяване на ДНК при рак на простатата. евро. Урол. 76, 469–478 (2019).
15. Chen, N., Li, X., Chintala, NK, Tano, ZE & Adusumilli, PS Шофиране на CARs по неравния път на антигенна хетерогенност в солидни тумори. Curr. мнение Immunol. 51, 103–110 (2018).
16. Morgan, RA et al. Доклад за случай на сериозно нежелано събитие след прилагане на Т клетки, трансдуцирани с химерен антигенен рецептор, разпознаващ ERBB2. Mol. Там. J. Am. Soc. Джийн Тер. 18, 843–851 (2010).
17. Lee, JK et al. Системното повърхностно профилиране идентифицира целевите антигени за имунно-базирана терапия при подтипове напреднал рак на простатата. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 115, E4473–e4482 (2018).
18. Hubert, RS et al. STEAP: простатно-специфичен клетъчно-повърхностен антиген, силно експресиран в човешки простатни тумори. Proc. Natl Acad. Sci. САЩ 96, 14523–14528 (1999).
19. Nolan-Stevaux, O. Резюме DDT02-03: AMG 509: Ново, хуманизирано, с удължен полуживот, биспецифично STEAP1 × CD3 Т клетки, набиращо XmAb® 2+1 антитяло. Cancer Res. 80, DDT02-03-DDT02-03 (2020).
20. Grunewald, TG et al. Високата експресия на STEAP1 е свързана с подобрени резултати при пациенти със сарком на Ewing. Ан. Oncol. Изкл. J. Eur. Soc. Med. Oncol. 23, 2185–2190 (2012).
21. Moreaux, J., Kassambara, A., Hose, D. & Klein, B. STEAP1 е свръхекспресиран при ракови заболявания: обещаваща терапевтична цел. Biochem. Biophys. Рез. Общ. 429, 148–155 (2012).
22. Oosterheert, W. & Gros, P. Криоелектронна микроскопска структура и потенциална ензимна функция на човешкия шест трансмембранен епителен антиген на простатата 1 (STEAP1). J. Biol. Chem. 295, 9502–9512 (2020).
23. Jiao, Z. et al. Шест-трансмембранният епителен антиген на експресията на простатата 1 насърчава метастазите на рак на яйчниците чрез подпомагане на прогресията на прехода от епител към мезенхим. Histochem. Cell Biol. 154, 215–230 (2020).
24. Gomes, IM, Arinto, P., Lopes, C., Santos, CR & Maia, CJ STEAP1 е свръхекспресиран при рак на простатата и лезии на интраепителна неоплазия на простатата и е положително свързан с оценката на Gleason. По урологична онкология: семинари и оригинални изследвания. об. 32, 53.e23–53.e29 (Elsevier, 2014).
25. Huo, S.-f. et al. STEAP1 улеснява метастазите и епително-мезенхимния преход на белодробен аденокарцином чрез сигналния път JAK2/STAT3. Biosci. Представление 40, BSR20193169 (2020).
26. Gomes, IM et al. Нокдаунът на STEAP1 инхибира клетъчния растеж и индуцира апоптоза в LNCaP ракови клетки на простатата, противодействайки на ефекта на андрогените. Med. Oncol. 35, 1–10 (2018).
27. Gomes, IM, Maia, CJ & Santos, CR STEAP протеини: от структура до приложения в терапията на рак. Mol. Cancer Res. MCR 10, 573–587 (2012).
28. Danila, DC et al. Фаза I проучване на DSTP3086S, конюгат антитяло-лекарство, насочен към шест-трансмембранен епителен антиген на простата 1, при метастатичен резистентен на кастрация рак на простатата. J. Clin. Oncol. Изкл. J. Am. Soc. Clin. Oncol. 37, 3518–3527 (2019).
29. Kelly, WK et al. Фаза I проучване на AMG 509, STEAP1 x CD3 Т-клетъчна рекрутираща XmAb 2+1 имунна терапия, при пациенти с метастатичен резистентен на кастрация рак на простатата (mCRPC). J. Clin. Oncol. 38, TPS5589–TPS5589 (2020).
30. Lin, T.-Y., Park, JA, Long, A., Guo, H.-F. & Cheung, N.-KV Ново мощно анти-STEAP1 биспецифично антитяло за пренасочване на Т клетки за имунотерапия на рак. J. Immunother. Рак 9, e003114 (2021).
31. Schober, SJ et al. MHC клас I-ограничени TCR-трансгенни CD4(+) Т клетки срещу STEAP1 посредничат за локален туморен контрол на сарком на Юинг in vivo. Клетки 9, 1581 (2020).
32. Roudier, MP и др. Фенотипна хетерогенност на краен стадий на карцином на простатата, метастатичен в костите. тананикам Патол. 34, 646–653 (2003).
33. Gomes, IM, Santos, CR, Socorro, S. & Maia, CJ Шест трансмембранен епителен антиген на простатата 1 се регулира надолу от половите хормони в простатните клетки. Простата 73, 605–613 (2013).
34. Sharp, A. et al. Вариантът на снаждане на андрогенен рецептор-7 се появява с резистентност към кастрация при рак на простатата. J. Clin. Инвестирам. 129, 192–208 (2019).
35. Bakht, MK и др. Невроендокринната диференциация на рака на простатата води до потискане на PSMA. Ендокр.-рел. Рак 26, 131–146 (2018).
36. Ihlaseh-Catalano, SM et al. Свръхекспресията на STEAP1 протеин е независим маркер за биохимичен рецидив при карцином на простатата. Хистопатология 63, 678–685 (2013).
37. Gomes, IM et al. Нокдаунът на STEAP1 инхибира клетъчния растеж и индуцира апоптоза в LNCaP ракови клетки на простатата, противодействайки на ефекта на андрогените. Med. Oncol. 35, 40 (2018).
38. Logan, AC et al. Фактори, влияещи върху титъра и инфекциозността на лентивирусните вектори. тананикам Джийн Тер. 15, 976–988 (2004).
39. Morgan, RA, Gray, D., Lomova, A. & Kohn, DB Генна терапия с хематопоетични стволови клетки: напредък и извлечени уроци. Клетъчни стволови клетки 21, 574–590 (2017).
40. Larson, SM et al. Предклинично развитие на генна модификация на хематопоетични стволови клетки с химерни антигенни рецептори за имунотерапия на рак. тананикам Ваксина Immunother. 13, 1094–1104 (2017).
41. Salter, AI et al. Фосфопротеомичният анализ на сигнализирането на химерния антигенен рецептор разкрива кинетични и количествени разлики, които засягат клетъчната функция. Sci. Сигнал. 11, eaat6753 (2018).
42. Majzner, RG и др. Настройка на изискването за плътност на антигена за CAR Т-клетъчна активност. Рак Discov. 10, 702–723 (2020).
43. Challita-Eid, PM и др. Моноклоналните антитела срещу шест трансмембранни епителни антигени на простатата-1 инхибират междуклетъчната комуникация in vitro и растежа на човешки туморни ксенотрансплантати in vivo. Cancer Res. 67, 5798–5805 (2007).
44. Hudecek, M. et al. Несигнализиращият извънклетъчен спейсър домен на химерни антигенни рецептори е решаващ за in vivo антитуморна активност. Рак Имунол. Рез. 3, 125–135 (2015).
45. Gomes, IM, Santos, CR & Maia, CJ Експресия на STEAP1 и STEAP1B в клетъчни линии на простатата и предполагаемата регулация на STEAP1 чрез пост-транскрипционни и пост-транслационни механизми. Гени Рак 5, 142–151 (2014).
46. Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A. & Elofsson, A. TOPCONS: консенсусно предсказване на топологията на мембранния протеин. Nucleic Acids Res. 37, W465–W468 (2009).
47. Krogh, A., Larsson, B., Von Heijne, G. & Sonnhammer, EL Предсказване на трансмембранна протеинова топология със скрит модел на Марков: приложение към пълни геноми. J. Mol. Biol. 305, 567–580 (2001).
48. Long, AH et al. 4-1ВВ костимулацията подобрява изтощението на Т клетките, предизвикано от тонично сигнализиране на химерни антигенни рецептори. Нац. Med. 21, 581–590 (2015).
49. Berger, C. et al. Адоптивният трансфер на ефекторни CD8+ Т клетки, получени от централни клетки на паметта, установява постоянна Т клетъчна памет при примати. J. Clin. разследване. 118, 294–305 (2008).
50. Gattinoni, L. et al. Подмножество от Т клетки на човешката памет със свойства, подобни на стволови клетки. Нац. Med. 17, 1290–1297 (2011).
51. Xu, Y. и др. Тясно свързаните стволови клетки с Т-памет корелират с in vivo експанзията на CAR. CD19-Т клетките се запазват от IL-7 и IL-15. Кръв 123, 3750–3759 (2014).
52. Cieri, N. et al. IL-7 и IL-15 инструктират генерирането на стволови Т клетки на човешката памет от наивни прекурсори. Кръв 121, 573–584 (2013).
53. Hansel, DE et al. Споделена генна мутация на TP53 в морфологично и фенотипно различен паралелен първичен дребноклетъчен невроендокринен карцином и аденокарцином на простатата. Простата 69, 603–609 (2009).
54. Cuzick, J. et al. Прогностична стойност на РНК експресионен подпис, получен от гени за пролиферация на клетъчния цикъл при пациенти с рак на простатата: ретроспективно проучване. Lancet Oncol. 12, 245–255 (2011).
55. Chen, ME, Lin, SH, Chung, LW & Sikes, RA Изолиране и характеризиране на PAGE-1 и GAGE-7. Нови гени, експресирани в модела на прогресия на рак на простатата LNCaP, които споделят хомология с антигени, свързани с меланома. J. Biol. Chem. 273, 17618–17625 (1998).
56. Baley, PA, Yoshida, K., Qian, W., Sehgal, I. & Thompson, TC Прогресия към андрогенна нечувствителност в нов in vitro миши модел за рак на простатата. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 52, 403–413 (1995).
57. Murad, JP et al. Предварителното кондициониране модифицира TME, за да подобри ефикасността на CAR Т клетките на солиден тумор и ендогенния защитен имунитет. Mol. Там. J. Am. Soc. Джийн Тер. 29, 2335–2349 (2021).
58. Brunda, MJ и др. Антитуморна и антиметастатична активност на интерлевкин 12 срещу миши тумори. J. Exp. Med. 178, 1223–1230 (1993).
