Резюме
Предистория AKI е често срещано последствие от инфекция със SARS-CoV-2 и допринася за тежестта и смъртността от COVID-19. Тук тествахме хипотезата, чепромени в бъбрецитепредизвикана от свързаната с COVID-19 ОПП може да бъде открита в клетки, събрани от урина. Методи Извършихме едноклетъчно РНК секвениране (scRNAseq) върху клетки, възстановени от урината на осем хоспитализирани пациенти с COVID-19 с (n55) или без AKI (n53), както и четирима пациенти с не-COVID-19 AKI (n54) за оценка на разликите в клетъчния състав и генната експресия по време на AKI. Резултати Анализът на 30 076 клетки разкрива разнообразен набор от типове клетки, повечето от които сабъбрек, уротелиални и имунни клетки. Анализът на пътя на тубулни клетки от пациенти с AKI показа обогатяване на транскрипти, свързани с пътища, свързани с увреждане, в сравнение с тези без AKI. Експресията на ACE2 и TMPRSS2 е най-висока в уротелните клетки сред възстановените типове клетки. Трябва да се отбележи, че при един пациент открихме вирусна РНК на SARS-CoV-2 в уротелни клетки. Същите тези клетки бяха обогатени за транскрипти, свързани с антивирусни и противовъзпалителни пътища. Заключения Успешно извършихме scRNAseq върху уринарен седимент от хоспитализирани пациенти с COVID-19, за да изследваме неинвазивно клетъчни промени, свързани с AKI, и създадохме набор от данни, който включва както увредени, така и неувредени бъбречни клетки. Освен това предоставяме предварителни доказателства за директна инфекция на клетките на пикочния мехур от SARS-CoV-2. Седиментът на урината съдържа богата информация и е полезен източник за изучаване на патофизиологията и клетъчните промени, които се случват вбъбречни заболявания.
ОРГАНИЧНИ ЗДРАВОСЛОВНИ ХРАНИ ЗА ЗДРАВЕ НА БЪБРЕЦИТЕ
Въведение
Инфекцията с тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2) отключва патология в множество системи, включително бъбреците, и AKI се свързва със значителна заболеваемост и смъртност при коронавирусна болест 2019 (COVID-19) (1 –5). Множество проучвания показват високи нива на AKI сред хоспитализирани пациенти с COVID-19 (6), като някои съобщават, че до 50% от заразените лица развиват AKI (7–9). Първичният рецептор на SARS-CoV-2 ACE2 се експресира върху епителни клетки в цялата пикочна система, включително клетки на проксималните тубули и уротелни клетки (10–13), въпреки че не е ясно дали AKI при пациенти с COVID-19 се дължи на директна вирусна инфекция на проксималните тубули или е резултат от системния отговор на SARS-CoV-2 (14–22). По същия начин не е ясно дали SARS-CoV-2 може да причини вирусен цистит чрез директна инфекция на уротелни клетки, въпреки че тази възможност е предложена (23–26). Въпреки високото разпространение на свързаната с COVID-19 AKI, основните клетъчни промени, които се случват в условията на AKI, остават слабо разбрани.
Свързаната с COVID-19 AKI остава до голяма степен недостатъчно проучена, тъй като достъпът до бъбречна тъкан изисква биопсия или следсмъртен анализ (27). Скорошни проучвания са открили разнообразен набор от бъбречни, пикочни и имунни клетки в урината (28-30). По този начин урината може да предложи ценна представа за неинвазивното изследване на бъбречните промени по време на свързаната с COVID-19 ОПП. Тук извършихме секвениране на едноклетъчна РНК (RNA-Seq), за да характеризираме клетъчното разнообразие в урината на хоспитализирани пациенти с COVID-19 със и без AKI. Тествахме хипотезата, че промените в бъбреците при AKI, свързана с COVID-19, могат да бъдат открити в клетки, събрани от урина. Също така събрахме проби от пациенти без COVID-19 и с AKI (ОПН без COVID-19). Открихме няколко възпалителни имунни клетъчни популации и диференциално активирани пътища в свързаната с COVID-19 AKI, както и предварителни доказателстваза директна инфекция на уротелиални клетки от SARS-CoV-2.
Материали и методи
Участници и променливи Възрастни на възраст 18 и повече години бяха прегледани по време на приемане или преместване в болницата на Университета на Алабама в Бирмингам (UAB) между март и май 2021 г. Случаите на AKI бяха идентифицирани с помощта наБъбречно заболяванеПодобряване на дефиницията на глобалните резултати като повишаване на серумния креатинин (sCr) 0.3 mg/dl в рамките на 48 часа или .1,53 изходен креатинин. Контролите без промяна в креатинина бяха избрани въз основа на съвпадение на възрастта и пола, където е възможно, и обработени с всяка съответна проба от AKI. Базовият sCr беше определен с помощта на най-новата стойност на sCr 7–365 дни преди хоспитализацията. Допълнителни клинични данни относно демографията, медицинската история, клиничните характеристики и лабораторните стойности бяха извлечени от диаграмите на пациентите чрез екипа i2b2 на Центъра за клинични и транслационни науки на UAB. Включени са осем хоспитализирани пациенти с COVID-19, петима с AKI и трима без AKI. Това проучване и колекцията от образци бяха одобрени от Съвета за институционален преглед на UAB. Екипът на UAB Acute Nephrology Consult също събра проби от пациенти с ОПП, различна от COVID-19 (n54), за да сравни клетъчните промени с ОПП, свързана с COVID-19. Те са събрани съгласно различен протокол на институционален съвет за преглед, който позволява събирането на проби от остатъчна урина и следователно е анонимен.
Събиране и обработка на проби
Всички стъпки бяха извършени върху лед. Урината се събира или като изпразнен образец, или от уринарен катетър. Пробите незабавно бяха прехвърлени в лаборатория с ниво на биобезопасност 21 за обработка. Пробите от урина се прехвърлят в 50-ml конична епруветка и се центрофугират при 10003g за 10 минути при 4°C. Клетъчните пелети се промиват с леденостуден PBS, филтруват се през 40-mm филтър и се центрофугират отново. Живите клетки бяха пречистени с помощта на комплекта за премахване на остатъци MACS (Miltenyi Biotec), последван от комплекта за отстраняване на мъртви клетки EasySep Annexin V (StemCell). Накратко, клетките се ресуспендират в ледено студен PBS и се смесват с разтвор за отстраняване на остатъци. Студен PBS се нанася върху сместа и се центрофугира при 3003g за 10 минути при 4°С. Горните две фази се аспирират и след това останалите клетки се промиват с PBS. Клетките бяха ресуспендирани и смесени с Коктейл за отстраняване на мъртви клетки, Коктейл за селекция от биотин и след това RapidSpheres преди разделяне в EasySep магнит. Клетките се промиват и ресуспендират в 52 ml PBS (без калций или магнезий) 10,04% BSA (Fisher Scientific) за обработка на scRNAseq
scRNAseq
Пречистените клетки бяха прехвърлени в UAB Flow Cytometry и Single Cell Core и незабавно обработени с помощта на Chromium 39 Single-Cell RNA Sequencing Kit (103Genomics) според производителя's инструкции.Клетъчната суспензия се преброява, комбинирана с 103 Смес от хромови реагенти и се зарежда в микроетuidicустройство за разделяне на една клетка, в което лизис и обраттранскрипцията се извършва в микрокапки. Получената cDNAбеше в изобилиефиредактиран чрез PCR и впоследствие обработен до добив
библиотеки за секвениране с баркод. Секвенирането в сдвоен край беше извършено на платформата за секвениране Illumina NovaSeq6000 или NextSeq500 (Illumina). Четенията бяха обработенис помощта на 103 Едноклетъчен софтуер Genomics Cell RangerПакет версия 6.0 на UAB Cheaha High-PerformanceИзчислителен клъстер. BCLфифайлове бяха преобразувани във FASTQфифайлове с помощта на бързата функция CellRanger. CellRangerfast беше използван за подравняване на FASTQфикъм персонализиран геномсъстоящ се от hg38 човешки геном (GRCh38.p13) с
геномът на SARS-CoV-2 (NC_045512.2), вмъкнат като екзон (31). За анализа бяха създадени таблицата на гените, таблицата с баркодове и транскрипционните експресионни матриципосочени по-долу.
Анализи на данни
Анализите бяха извършени с помощта на пакети, създадени за средата за статистически анализ R (версия 4.06). Данните бяха основно анализирани в Seurat версия 3.2.3 (32,33) и нейнитесвързани зависимости. Данни от всеки пациентса импортирани с помощта на Read103 функция и след това структурпревърнат в обект Seurat с помощта на CreateSeuratObject. Законтрол на качеството, броят на клетките с уникални характеристики е над 2500или под 200 и клетки с митохондриални пропорции на.15% бяхафифилтриран. Данните бяха нормализирани с помощта на LogНормализиране и мащабиране, за да се подготви за линейно измерениенамаляване. Обекти от отделни пациенти бяха етикетиранис уникална групова идентичностфикатиони и след това се слива в aединичен обект с помощта на функцията за сливане Seurat. Пациент Самpless бяха интегрирани с функцията RunHarmony с помощта напакет Harmony R (34). Анализ на главните компонентибеше извършено и след това клетките бяха групирани въз основа надиференциална генна експресия, както е определено от SeuratФункцията FindAllMarkers е зададена на разделителна способност единица. Dimenсионалната редукция беше извършена с помощта на равномерен колекторапроксимация и проекция. Типовете клетки бяха идентичнифииздчрез сравняване на диференциално експресираните транскрипти завсеки клъстер с известни транскрипти, свързани със speciфиc типове клетки (29,35,36). Пакетът Escape R беше използван за изпълнениеАнализ на обогатяване на набор от гени (GSEA) (37). WebGestaltRбеше използван за генен онтологичен анализ за идентифициране на пътищаизползвайки Биологичния процес и Енциклопедията на Киото наБази данни за гени и геноми (38).
