Секретираният липокалин, свързан с неутрофилна желатиназа, показва по-силна способност да инхибира разширяването на кистата на ADPKD клетки в сравнение с несекретирана форма

Ключови думи: ADPKD;липокалин, свързан с неутрофилна желатиназа; 3D култура

НОВИ БИЛКИ ЗА

1. Въведение

Поликистозното бъбречно заболяване (PKD), едно от най-честите наследствени заболявания, се характеризира с развитието на пълни с течност кисти по множество сегменти на нефрона [1]. ADPKD е най-често срещаната форма на PKD, която е PKD с начало в зряла възраст, за която повечето пациенти не развиват симптоми, докато не навършат четиридесет години [2]. ADPKD е резултат от мутации в PKD1 (85%) или PKD2 (15%) гени, които кодират съответно полицистин-1 (PC1) и полицистин-2 (PC2) [3,4]. Дефектите в PC1 или PC2 са свързани с необичайно увеличаване на пролиферацията на бъбречните епителни клетки и допълнително причиняват образуване на кисти [5–7]. С напредването на ADPKD кистите се уголемяват и нарушават нормалната бъбречна архитектура, което в крайна сметка води до бъбречна недостатъчност. Въпреки това, механизмът, включен в ADPKD, е сложен и остава да бъде проучен. Функционалната загуба на PC1 и/или PC2 при ADPKD води до намалени вътреклетъчни концентрации на калций, облекчаване на чувствителната към калций аденилил циклаза (AC) и допълнително води до повишено ниво на вътреклетъчен цикличен аденозин монофосфат (cAMP) [8,9]. cAMP стимулира пролиферацията на епителните клетки и секрецията на течности, за да насърчи уголемяването на кистата чрез активиране на протеин киназа A (PKA) и пътя Ras/B-Raf/MEK/ERK надолу по веригата [10,11]. Доказано е, че дисфункцията на аутофагията възниква при ADPKD рибки зебра и мишки in vitro [12] и плъхове in vivo модели [13]. Автофагията е ключов механизъм, който поддържа хомеостазата на клетките и органите чрез разграждане и рециклиране на органели, дълготрайни протеини и хранителни вещества [14,15]. Възниква кръстосано говорене между mTOR пътя на автофагията и пътищата на апоптозата, което е нерегулирано при PKD [16]. Лечението с активатори на автофагия, като рапамицин и карбамазепин, може значително да намали образуването на кисти [12]. Преди това създадохме ADPKD миши модел, наречен Pkd1L3/L3 (в C57BL/6 генетичен фон) [17] чрез вмъкване на loxP сайт и loxP-фланкирана mc1-neo касета в интрони 30 и 34 на Pkd1 гена , съответно (L3 означава три loxP места в рамките на алела), за генериране на условната генна мутация. Pkd1L3/L3 мишки произвеждат ниски нива (20% от контролата) на PC1, което индуцира агресивен растеж на кисти и разширяване на бъбречния обем с увеличаване на възрастта [17]. В допълнение, ADPKD клетъчен модел (2L3 клетъчна линия) е създаден чрез SV40 вирусна трансдукция на първични бъбречни епителни клетки от Pkd1L3/L3 мишки за индуциране на обезсмъртени клетъчни линии [18].

Свързаният с неутрофил желатиназа липокалин (NGAL), 22-kD секретиран протеин, се счита за биомаркер за бъбречни увреждания, включително ПКД при възрастни [19] (но не и при деца [20]), хронично бъбречно заболяване [21 ] и остра бъбречна исхемия [22]. Механизмът на увеличаване на NGAL протеина в урината на пациента не е ясен, предполага се, че натрупаният NGAL в урината е свързан с децилиацията на бъбречните епителни клетки в резултат на нараняване [23]. Някои проучвания показват, че NGAL играе защитна роля срещу бъбречни увреждания, местоположението на исхемията [24] и потискане на прогресията на кистата [25], докато някои проучвания предполагат, че NGAL може да участва в прогресията на кистата [26] и развитието на тумор [27]. ]. NGAL рецептор (NGAL-R, Slc22a17) се експресира в множество епителни тъкани, включително бъбречни нефрони [28]. Свързването на NGAL и NGAL-R може да отдели вътреклетъчното желязо и допълнително да индуцира апоптоза [29], което е свързано със стратегия за изчерпване на желязото на вродената имунна система срещу бактериална инфекция [30].

Доказано е, че прилагането на екзогенен NGAL повишава апоптозата на Pkd1−/− клетките и допълнително намалява растежа на кистата in vitro [25]. В предишна работа ние генерирахме Pkd1L3/L3 × NGAL−/− мишки и Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg мишки чрез кръстосване на Pkd1L3/L3 мишки съответно с NGAL нокаут и трансгенни мишки [31]. Ние открихме, че свръхекспресията на NGAL в ADPKD миши модел (Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg мишки) намалява прогресията на кистата и удължава продължителността на живота на Pkd1L3/L3 мишки, придружено от промени в серия от молекулярни пътища, участващи в пролиферация, апоптоза и фиброза [31]. Въпреки това, основният механизъм на ефектите на NGAL за облекчаване на прогресията на ADPKD остава загадъчен.

В това проучване е създадена платформа за 3D клетъчна култура за тестване на прогресията на кистата на Pkd1L3/L3 бъбречни епителни клетки (2L3 клетки) с добавяне на рекомбинантен миши NGAL (mNGAL) протеин или свръхекспресия на трансгенен NGAL in vitro. Освен това бяха изследвани ефектите на психичното върху пролиферацията, апоптозата и свързаните с автофагията пътища. Освен това, механизмът на NGAL в 2L3 клетки беше изяснен чрез изследване на ефектите от свръхекспресия на секретиран NGAL (pN + LS) и несекретиран NGAL (pN - LS) в 2L3 клетки. Ефектът и възможният механизъм на NGAL протеин в ADPKD клетки са частично изследвани в това проучване.

2. Материали и методи

2.1. Клетъчни линии

Клетъчната линия Pkd1L3/L3 (2L3) е установена чрез SV40 вирусна трансдукция на първични бъбречни епителни клетки от 2L3 мишки, ADPKD миши модел, за индуциране на обезсмъртена клетъчна линия [17,18]. Първичните бъбречни клетки бяха заразени при техния втори пасаж чрез използване на комплект за обезсмъртяване на вируса Lenti SV40 (Capital Biosciences Inc., Gaithersburg, MD, USA). Клетките се инкубират в 5% CO2 при 37 °C и се третират с полибрен (8 µg/mL) за една нощ в плоча с шест ямки. На следващия ден вирусният супернатант се изхвърля и клетките се инкубират в свежа среда. След достигане на сливане, клетките се субкултивират в 10- cm съд с културална среда и се считат за клетки от пасаж едно (P1). SV40-трансформирани клонове бяха избрани и изолирани чрез използване на клониращи пръстени [17,18]. Клетъчната линия M-1 (Pkd1+/+), закупена от BCRC (Hsinchu, Тайван), се използва като клетъчна линия от див тип.

2.2. Клетъчна култура

Клетките се пропускат на всеки три дни. За да се тества IC50 на mNGAL в ADPKD клетки, 2L3 клетки се посяват в 24-плаки с ямки (6000 клетки/ямка) с 500 µL от описаната по-горе среда и се инкубират за 16 ч. След това клетките се третират с рекомбинантен mNGAL (0, 20, 40, 80, 160, 320 µg/mL) или рапамицин (1 µM, от Sigma, St. Louis, MO, USA) за още 0, 8, 24 или 48 h (n=4).

2.3. Оцветяване с лектин

За да се провери дали клетките M{{0}} и 2L3 са от бъбречни тубули с подобен произход, лектин оцветяване с Lotus tetragonolobus лектин (LTL, който е диференциран проксимален тубулен маркер, белязан с флуоресцеин) и аглутинин на Dolichos biflorus (DBA , който е диференциран маркер за събирателен канал, белязан с родамин). LTL и DBA бяха закупени от Vector Laboratories (Burlingame, Калифорния, САЩ). За наблюдение на клетки, клетките, култивирани върху покривното стъкло, се промиват с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) три пъти в продължение на 10 минути и след това се фиксират с 4% параформалдехид (PFA) в PBS в продължение на 30 минути. След пермеабилизация с 0.4% Triton X -100 в PBS (PBST) в продължение на 20 минути, клетките бяха блокирани с 10% конски серум в PBST в продължение на 1.5 часа. Клетките се оцветяват с LTL (20 µg/mL) и DBA (20 µg/mL) в продължение на 1 час при 37 ◦C. Ядрата се оцветяват с DAPI (1 ug/mL) в продължение на 5 минути. Пробите се промиват с PBST три пъти за 10 минути между стъпките.

2.4. ДНК лизат и генотипиране

За Pkd1 генно типизиране, PCR прав (50 -TGTGTTGTTCTTTGTGGCAGTCAG-30 ) и обратен (50 -ATTCTCAATGACTGACTTGGGCTC-30) праймери бяха използвани за амплифициране на геномни ДНК последователности. Пробите се нагряват при 94 °C за 5 min и след това се извършват 30 цикъла (94 °C за 1 min, 56 °C за 1 min, 72 °C за 1 min), последвани от 72 °C за 10 min и 25 °C C за 5 минути. След амплифициране чрез PCR, ДНК продуктите се смесват с 6 × зареждащо багрило и се анализират с помощта на 1% агарозен трис-борат-EDTA (TBE) гел.

2.5. Полимеразна верижна реакция с количествена обратна транскрипция в реално време (RT–qPCR)

Общата РНК от клетъчната линия се изолира с помощта на комплект за екстракция на MagQu gDNA (MagQu, New Taipei City, Taiwan), последвано от лечение с DNase I (Worthington, Lakewood, NJ, USA) и се съхранява в ddH2O при -80 ◦C. Качеството и концентрацията на РНК се определят с помощта на 1% TBE агарозен гел и спектрофотометър NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Матричната РНК се транскрибира обратно в сДНК, като се използва RevertAid First Strand cDNA синтезиращ комплект (Thermo Fisher Scientific) в присъствието на RNaseOUTTM RNase инхибитор (G-Biosciences, St. Louis, MO, USA). Всяка реакция се приготвя в общ обем от 20 µL, включително обща РНК (100 ng), олиго (dT)18 праймер (1 µL), 5X реакционен буфер (4 µL), RiboLock RNase инхибитор (20 U), dNTP смес ( 1 mM), RevertAid обратна транскриптаза (200 U) и вода без нуклеаза. За синтез на сДНК на първата верига, пробите се нагряват при 42 °C в продължение на 1 час и след това реакцията се прекратява чрез нагряване при 70 °C в продължение на 1 минута.

Количественото определяне на генната експресия се извършва с помощта на StepOne™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Norwalk, CT, USA). Всяка проба се приготвя в общ обем от 20 µL, включително ген-специфични предни (100 nM), обратни (100 nM) праймери (Таблица 1), cDNA шаблон (100 ng), ORATM SEE qPCR Green ROX H Mix (1× , high GmbH, Kraichtal, Германия) и PCR вода. Пробите се нагряват при 95 ◦C за 2 минути, последвани от 40 цикъла (95 ◦C за 5 s, 65 ◦C за 25 s) и след това анализ на кривата на топене (95 ◦C за 15 s, 60 ◦C за 1 min , 95 ◦C за 15 s), използвайки StepOne™ PCR система в реално време. Данните бяха анализирани със софтуера StepOne™ (v2.3). Генната експресия на Gapdh се използва за нормализиране.

2.6. Анализ на клетъчната жизнеспособност

Клетъчната жизнеспособност се определя с помощта на тиазолил син тетразолиев бромид (MTT анализ) (Sigma). МТТ разтвор (0.5 mg/mL) се добавя към всяка ямка и се инкубира при 37 ◦C в продължение на 2 часа. За да се разтворят лилавите формазанови кристали, към всяка ямка се добавя диметилсулфоксид (DMSO, Sigma) след отстраняване на средно и MTT решение. Оптичната плътност (OD) на всяка проба при 570 nm се измерва с помощта на ELISA четец (Thermo Fisher Scientific).

2.7. Анализ на клетъчна пролиферация

Анализът на бромодезоксиуридин (BrdU) клетъчна пролиферация (Millipore, Burlington, MA, USA) беше извършен за анализиране на пролиферацията на M-1 и 2L3 клетки. За да се сравни способността за пролиферация на M-1 и 2L3 клетки, клетките се култивират в 96-плаки с ямки (5 × 103 клетки/ямка) за 24 часа. BrdU се добавя към средата 2 часа преди края на инкубационния период. За да се изследва ефектът на mNGAL върху клетъчната пролиферация на 2L3, 2L3 клетки първо се култивират в 96-плаки с ямки (2 × 103 клетки/ямка) в продължение на 16 часа, последвано от третиране с mNGAL за още 8, 24 и 48 часа. BrdU се добавя към средата 2 часа преди края на инкубационния период на хранене. След това клетките се фиксират с фиксиращ разтвор (200 µL/ямка) при 37 ◦C за 30 минути, последвано от инкубиране с антитяло за откриване на BrdU (100 µL/ямка) при 37 ◦C за 1 час и пероксидаза-конюгирано козе анти-мише антитяло (100 µL/ямка) при 37 ◦C за 30 минути. Клетките се промиват три пъти с промивен буфер и се изсушават върху хартиени кърпи между описаните по-горе стъпки.

След инкубиране с TMB пероксидазен субстрат (100 µL/ямка) при 37 ◦C за 30 минути на тъмно, реакцията се спира със стоп разтвор (100 µL/ямка). Накрая, OD450 на всяка проба се измерва с помощта на ELISA четец (Thermo Fisher Scientific).

2.8. Тест за апоптоза

За анализ на апоптоза с помощта на поточна цитометрия, 2L3 клетки се посяват в 6-плаки с ямки (1,8 × 105 клетки/ямка) с 2 mL среда и се инкубират в продължение на 16 часа. След това клетките бяха третирани с mNGAL (0, 600, 1200 µg/mL) за още 0, 4 или 12 часа, събрани и оцветени с Анексин V-FITC и PI (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ ) за анализ чрез поточна цитометрия на 4 и 12 часа, съответно (n=3, за контрола и mNGAL). За установяване на компенсация и квадранти преди анализа бяха използвани неоцветени клетки, клетки, оцветени само с Анексин V-FITC, и клетки, оцветени само с PI.

2.9. Уестърн блот анализ

Клетките бяха събрани и лизирани с RIPA, допълнен с коктейл от протеазен инхибитор (1:100) и фосфатаза (1:100). След инкубиране в продължение на 30 минути при 4 ◦C, клетъчните лизати се центрофугират в продължение на 15 минути при 13 400 × g (Eppendorf 5415R, Хамбург, Германия) при 4 ◦C. Концентрациите на протеин се измерват с помощта на BCA анализ. Равни количества протеин (25 µg протеин с 1:2 зареждащо багрило/ямка) се разделят електрофоретично чрез SDS-PAGE (10%) и се прехвърлят за 1 час към PVDF мембрани. След това мембраните се блокират с 5% обезмаслено мляко в Tris-буфериран физиологичен разтвор с 0,1% Tween-20 (TBST) в продължение на 2 часа при стайна температура. След промиване с TBST три пъти в продължение на 10 минути, мембраните се инкубират с първични антитела (Таблица 2) за една нощ при 4 ◦C, последвано от 1-h инкубиране с HRP-конюгирани вторични антитела (Таблица 3).

2.10. Триизмерна клетъчна култура (3D култура)

3D културата се извършва с помощта на матрицата Matrigel (Corning, NY, USA) за оценка на образуването на кисти. Клетките 2L3 се посяват в 96-плаки с ямки (1000 клетки/ямка) върху предварително формован Matrigel (40% в среда). След като клетките бяха прикрепени към гела, към клетките беше добавен още Matrigel, за да се образува модел, подобен на сандвич (Фигура 6). Клетките се поддържат в 3D култура при 37 ◦C и 5% CO2. Клетките бяха третирани с форсколин (20 mM, Sigma) от Ден 1 до Ден 3, за да се индуцира образуването на кисти. След индуцирането на образуване на кисти с форсколин, клетките се третират с или без mNGAL (2 mg/mL) от дни 4 до 8 и средата се сменя всеки ден. Образуването на кисти се наблюдава под микроскоп всеки ден и диаметърът, площта и броят на кистата се измерват с ImageJ. Имуноцитохимията (ICC) беше извършена на ден 8 върху плаката или покривните стъкла. Наблюдението на кисти беше извършено чрез конфокална микроскопия (ZEISS, Oberkochen, Германия).

2.11. Имуноцитохимия (ICC)

За наблюдение на кисти, кисти, култивирани с Matrigel в ямки или върху покривни стъкла, се промиват три пъти с PBS за 10 min и след това се фиксират с 4% параформалдехид (PFA) в PBS за 30 min. След пермеабилизация с 0, 4% PBST за 20 минути, кистите бяха блокирани с 10% конски серум в PBST за 2 часа. Кистите се оцветяват с първични антитела срещу Е-кадхерин (1: 500; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) и актин (1: 1000; Millipore) за една нощ при 4 ◦ C и след това се оцветяват с флуоресцентно вторично антитяло (Таблица 3) на тъмно за 1 час при стайна температура. Ядрата се оцветяват с DAPI (1 ug/mL) в продължение на 5 минути. Пробите се промиват с PBST три пъти за 10 минути между стъпките.

2.12. Конфокална микроскопия

За да се потвърди, че сферичните конструкции, наблюдавани в 3D културата, са кисти, покривните стъкла от 3D културата бяха монтирани върху предметни стъкла с монтажна среда Fluoromount-G (SouthernBiotech, Бирмингам, Алабама, САЩ) и изобразени с помощта на конфокален микроскоп. Конфокалното изобразяване беше извършено с 63 × маслен имерсионен обектив. Различни оптични z-секции на 2L3 киста в 3D култура бяха получени с помощта на модула Z-stack в софтуера за микроскоп ZEISS ZEN (Oberkochen, Германия). Оптичните срезове на кисти бяха реконструирани в Z-stack или 3D видео с помощта на софтуера за микроскоп ZEISS ZEN.

2.13. Плазмидна конструкция и вирусна инфекция

Мишата NGAL последователност (534 bp) се вмъква във вектора pSecTag2B (Invitrogen, Carlsbad, СА, САЩ) в рамката и надолу по веригата на лидерна последователност на миша Igκ-верига за свръхекспресия на секретирания NGAL протеин. Обратно, лидерната последователност на миша Igκ верига в гореописания плазмид беше отстранена, за да се свръхекспресира несекретираният NGAL протеин. pSecTag2B-NGAL със или без лидерната последователност (pN + LS или pN - LS, съответно) е проектиран да изследва връзката между NGAL и NGAL рецептора. За да се гарантира правилното вмъкване на конструкции, NheI и NotI бяха използвани за смилане на pN + LS или pN - LS с NEBuffer 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) при 37 ◦C за 2 часа, последвано от анализ с помощта на 1% TBE гел.

За генериране на стабилни клонове, 2L3 клетки се инкубират в среда DMEM/F12 (300 µL/ямка), допълнена с 10% топлинно неактивен FBS, 1% P/S, полибрен (8 µg/mL) и лентивирус (200 µL) в 6-плака с ямки при 37 ◦C за 24 часа. След това супернатантата на вируса се изхвърля и клетките се промиват с PBS и се инкубират с прясна среда, съдържаща бластицидин (4 ug/mL) за селекция на заразени клетки. Селекционната среда се променя на всеки 3 дни. Инфектираните клетки бяха събрани една седмица след селекция на бластицидин за Western blotting и RT-QPCR, за да се анализира нивото на експресия на mNGAL.

2.14. Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA)

Количественото определяне на NGAL, секретирано от клетките, се извършва с помощта на миши липокалин{{0}} (Lcn2) твърдофазов сандвич ELISA комплект (Thermo Fisher Scientific). Супернатантната среда от клетки се събира, центрофугира се за отстраняване на клетъчните остатъци и се съхранява при -80 ◦C. За стандартната крива се приготвят 8 × серии разреждания на стандартен миши NGAL протеин (0, 0.024, 0.195, 1.563, 12.5, 100 ng/mL). Стандарти (100 µL/ямка) и проби (100 µL/ямка от 10 µg общ протеин от клетъчен лизат или неразреден супернатант) се добавят към 96-плаката с ямки и се инкубират при 37 ◦C за 2,5 часа. Всяка ямка се инкубира с биотин (100 µL/ямка) конюгат при 37 ◦C за 1 час и след това с разтвор на стрептавидин-HPR (100 µL/ямка) при 37 ◦C за 45 минути с леко разклащане. Разтворът се изхвърля и ямката се промива с

След инкубиране с ТМВ субстрат (100 µL/ямка) при 37 ◦C за 30 минути на тъмно, реакцията се спира чрез добавяне на стоп разтвор (50 µL/ямка). Накрая, OD450 на всяка проба се измерва с помощта на ELISA четец (Thermo Fisher Scientific).

2.15. Статистически анализ

Всички данни са показани като средно ± стандартно отклонение (SD). За множество средни сравнения, данните бяха анализирани с помощта на t-теста на Student и еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) с post hoc тестовете на Tukey в R studio. Разликите се считат за статистически значими, когато p стойност < 0.05.