Секретираният липокалин, свързан с неутрофилна желатиназа, показва по-силна способност да инхибира разширяването на кистата на ADPKD клетки в сравнение с несекретирана форма Ⅳ

4. Дискусия

В това проучване ние демонстрирахме, че добавянето и/или свръхекспресията на секретиран mNGALпротеин намалява клетъчната пролиферация на 2L3иинхибира растежа на кисти in vitro чрез регулиране на апоптозатаи автофагия ирегулиране на сигнални пътища, свързани с пролиферацията. За да се установи дали M-1 клетки, установени от подобни локуси на миши бъбречни тубули като 2L3 клетки, могат да се използват като контролни клетки от див тип за 2L3 клетки, оцветяване с лектин на M-1 и 2L3 клетки с LTL и беше извършен DBA (Фигура 1D). LTL и DBA бяха използвани за идентифициране съответно на диференцираните проксимални тубули и събирателни канали на миши бъбреци [45,46]. Констатациите показват, че клетките M-1 имат сходна морфология (Фигура 1C) и произход на бъбречните тубули (Фигура 1D) с 2L3 клетки; следователно клетъчната линия M-1 беше избрана като контрола от див тип за 2L3 клетки.

НОВИ БИЛКИ ЗАADPKD(ПОЛИКИСТОЗНА БЪБРЕЧНА БОЛЕСТ)

В повечето клинични случаи пациентите с ADPKD показват по-високи нива на NGAL в урината си от нормалните хора [19,47–49]. ADPKD миши модел, използван в това проучване, също има по-високи нива на експресия на NGAL и NGAL-R [31]. Резултатите както от RT–qPCR, така и от Western blot показват, че 2L3 клетките експресират по-високи нива на NGAL от клетъчната линия M-1 от див тип (Фигура 1F, H), докато не е идентифицирана значителна разлика в нивото на експресия на NGAL-R между двете клетъчни линии (Фигура 1G, H), което не е в съответствие с in vivo резултатите [31]. Тази разлика може да се дължи на сложното взаимодействие в тъканите на мишката, което не се среща в много по-простата клетъчна система.

Резултатите от Western blot показват, че директното приложение и/или генетичната свръхекспресия на mNGAL в 2L3 инхибира ERK пътя. Както е показано на фигури 4A и 8A, сигналът на p-ERK1 (44 kDa) е по-слаб от p-ERK2 (42 kDa), докато ERK1 (44 kDa) е по-интензивен от ERK2 (42 kDa), причинявайки значително увеличение на p-ERK2/ERK2 в сравнение с p-ERK1/ERK1 във всички експериментални групи. ERK1 и ERK2 са две изоформи на ERK, за които се предполага, че имат различни ефекти върху клетъчната пролиферация [50]. Установено е, че ERK1 индуцира клетъчно оцеляване и растеж; въпреки това ERK2 насърчава клетъчната диференциация и блокира клетъчния растеж [51]. В нашето проучване съотношението на p-ERK2/ERK2 беше значително по-високо от това на p-ERK1/ERK1 във всички групи, което показва, че клетките са склонни да се диференцират и намаляват растежа. Въпреки това, както добавянето, така и свръхекспресията на mNGAL драстично понижават съотношението на p-ERK1/ERK1 и p-ERK2/ERK2 в сравнение с контролната група и водят до значително по-ниско съотношение на p-ERK/ERK, което показва ефекта на mNGAL в инхибирането на клетъчната пролиферация.

За да се създаде 3D културна платформа за характеризиране и оценка на лечението на образуването на кисти в 2L3 клетки, бяха направени опити за няколко условия. Доказано е, че концентрацията на Matrigel за 3D култура влияе върху процента на структурните кисти и тубули, образувани in vitro [25,52,53]. В нашето проучване открихме, че 40% Matrigel е най-добрата формула за показване на формирането на оптимална цистообразна структура на 2L3 клетки. Имаше няколко условия, включително вградени модели и модели отгоре за 3D култури [54]. Избрахме метода отгоре (модел, подобен на сандвич) за по-добър и по-лесен начин за анализиране на кистите (Фигура 6). Въпреки това, нашият опит показа, че кистите на 2L3 клетки не са били достатъчно големи, когато са култивирани без никакъв индуктор в 3D култура до ден 14. Форсколинът обикновено се използва за индуциране на образуване на кисти чрез активиране на аденилил циклаза (AC) за увеличаване на цикличния аденозин монофосфат (cAMP) [11,55]. Ето защо в нашето проучване използвахме форсколин (20 µM), за да индуцираме образуване на кисти в 2L3 клетки преди психично лечение.

Нашето предишно проучване показа, че свръхекспресията на бъбречно-специфичен NGAL в 2L3 мишки може да забави прогресията на ADPKD чрез намаляване на размера на кистата, но не и на броя на кистата в 2L3 мишки [31]. В настоящото проучване добавянето на умствено инхибира значително разширяването на кистата на 2L3 клетки чрез потискане на диаметъра на кистата, площта и процента на големите кисти (Фигура 6F, G, I), докато няма значителна разлика в скоростта на нарастване на общия номер на кистата (Фигура 6Н). Резултатите от прогресията на 2L3 киста в 3D култура са в съответствие с in vivo резултатите. Лечението с mNGAL обаче инхибира растежа на кисти на 2L3 клетки в 3D култура, докато ние използвахме по-висока концентрация на mNGAL (2 mg/mL) (Фигура 6), отколкото в предишните 2D експерименти (600 µg/mL) за MTT анализ за изследване ефектът на mNGAL върху клетъчната жизнеспособност (Фигура 3). Спекулирахме, че рекомбинантният mNGAL, пречистен от Е. coli, няма посттранслационна модификация [56,57] и води до ниска биоактивност на рекомбинантния mNGAL. Свръхекспресията на NGAL в 2L3 клетки чрез трансфекция на pN + LS и pN - LS конструкции може да помогне за изясняване на този въпрос.

За да се определи дали по-висока концентрация на mNGAL (2 mg/mL), използвана в 3D култура за потискане на разширяването на кистите на 2L3 клетки (Фигура 6), е резултат от липсата на посттранслационна модификация на mNGAL и да се тества дали NGAL трябва да се секретира и да взаимодейства с NGAL-R за индуциране на апоптоза и допълнително инхибиране на прогресията на кистата, pN + LS и pN - LS конструкти бяха трансфектирани в 2L3 клетки за свръхекспресия на секретираните и несекретираните NGAL протеини (Фигура 7). Обединените трансфектирани клетки бяха събрани една седмица след селекцията на бластицидин и както pN + LS, така и pN - LS трансфекцията силно повишиха нивата на експресия на mRNA на Lcn2 (общо, включително ендогенен и екзогенен NGAL) и Lcn2-c-myc (екзогенен NGAL) в сравнение с контролната група (Фигура 7F, G) и няма значителна разлика в Lcn2 и Lcn2-c-myc между pN + LS и pN − LS групи (Фигура 7F, G). Експресията на Lcn{{20}}myc в pN + LS и pN − LS групи е приблизително 8500-кратно по-голяма от тази в 2L3 клетки (Фигура 7G); обаче, експресията на Lcn2 в pN + LS и pN − LS е приблизително 1.5-кратно по-голяма от тази в 2L3 клетки (Фигура 7F). На теория, Lcn2-myc не присъства в 2L3 клетки, което води до ниски нива на експресия (фон) чрез RT-QPCR. В резултат на това относителното съотношение на Lcn2-myc в клетките pN + LS и pN − LS беше значително по-високо (приблизително 8500 пъти) от това в контролната група 2L3, което води до голямата разлика между относителното съотношение на Lcn2 и Lcn2-myc. В допълнение, съотношението на експресия на Lcn2 в pN + LS и pN - LS клетки (pN + LS беше 0.91-кратно това на pN - LS) беше подобно на това на Lcn2-c-myc (pN + LS беше 1.01-кратно това на pN − LS) (Фигура 7F, G). Вътреклетъчната експресия на NGAL протеин в pN + LS и pN - LS клетки се повишава в сравнение с тази в контролната група (Фигура 7I) и няма значителна разлика между pN + LS и pN - LS групите. Резултатите от Western blot за обща експресия на NGAL протеин в pN + LS и pN - LS групите (pN + LS беше 0.92-кратно това на pN - LS) (Фигура 7I) бяха в съответствие с резултатите от RT-qPCR (pN + LS беше 0.91-кратно това на pN − LS) (Фигура 7F). Според тези резултати, нивата на NGAL (както общи, така и екзогенни) протеини в pN + LS и pN - LS клетки са сходни, което показва, че двете групи трябва да бъдат сравнени в по-нататъшни експерименти.

Ние прогнозирахме, че свръхекспресията на NGAL без сигнален пептид няма да увеличи секрецията на NGAL въпреки високото ниво на вътреклетъчна експресия на NGAL. Въпреки това, резултатите от ELISA при използване на супернатантата от културата показват, че както pN + LS, така и pN - LS клетки имат значително по-високи нива на секретиран NGAL от контролните клетки 2L3 (Фигура 7J), докато количеството NGAL, секретирано от pN - LS клетки беше значително по-нисък от този на pN + LS клетки (Фигура 7J). Тези резултати разкриват, че свръхекспресията на NGAL без сигнален пептид (pN - LS) наистина ограничава секрецията на NGAL, въпреки че в клетките са идентифицирани високи нива на вътреклетъчна NGAL иРНК и протеин (Фигура 7F, I). Резултатите от включването на BrdU показват значително по-висока пролиферация на pN - LS клетки, отколкото pN + LS клетки (Фигура 7K).

Вътреклетъчните и секреционните количества на NGAL са приблизително 16-пъти и 2.2-пъти по-високи съответно в pN + LS, отколкото в 2L3 клетки (Фигура 7I, J), което може да доведе до инхибиране на pN + LS в сравнение с 2L3 клетъчна пролиферация (Фигура 7K). Въпреки това, вътреклетъчните и секретирани количества NGAL в 2L3 клетки са приблизително 4-пъти и 5.3-пъти по-високи от тези в M-1 клетки, съответно (Фигура 1H, I), докато по-високи клетъчна пролиферация се наблюдава в 2L3, отколкото в M-1 клетки (Фигура 2C). Подозираме, че повишената експресия и секреция на NGAL, които играят защитна роля в 2L3 клетки, е недостатъчна за инхибиране на клетъчната пролиферация в резултат на Pkd1 нокаут, но повишената експресия и секреция на NGAL в pN + LS осигурява допълнителен NGAL за постигане на потискане на пролиферацията. В нашето предишно проучване Pkd1L3/L3 мишки имаха значително по-високи бъбречни нива на NGAL протеин и пролифериращ клетъчен ядрен антиген (PCNA), отколкото Pkd1+/+ мишки [31]. Независимо от това, бъбречното ниво на NGAL протеин в Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg мишки е приблизително 2-кратно от това в Pkd1L3/L3 × NGAL+/+ мишки и свръхекспресията на NGAL води до значително по-ниски нива на PCNA в Pkd1L3 /L3 × NGALTg/Tg, отколкото при Pkd1L3/L3 × NGAL+/+ мишки и допълнително инхибира растежа на кистата и удължава дните на оцеляване [31]. NGAL изглежда играе защитна роля при инхибирането на повишената пролиферация в ADPKD модели, докато ендогенната експресия на NGAL е недостатъчна и допълнителният екзогенен NGAL може да помогне.

Според резултатите от 3D култивиране (Фигура 10), както pN + LS, така и pN - LS групите инхибират растежа на кистата чрез намаляване на диаметъра (Фигура 10C), площта (Фигура 10D) и процента на големи кисти (диаметър > 100 µm) (Фигура 10F), но не и числата (Фигура 10E). Това откритие е в противоречие с нашето подозрение, че само pN + LS, но не и pN - LS инхибира разширяването на кистата, тъй като секрецията на mNGAL от 2L3 клетки е необходима за инхибиране на клетъчната пролиферация. Въпреки това, инхибирането на уголемяването на кистата от pN - LS е по-слабо от pN + LS (Фигура 10B–D), което разкрива, че свръхекспресията на секретиран mNGAL има по-добра способност да инхибира уголемяването на кистата на 2L3 клетки в 3D култура, отколкото това на несекретиран mNGAL . Въпреки че виждаме по-силно потискане на уголемяването на кистата в pN + LS групата в сравнение с pN - LS групата в 3D култура, трудно е да се види по-добрият ефект на pN + LS отколкото pN - LS в p-AKT/AKT (Фигура 8B ), p-CREB/CREB (Фигура 8C) и p62 (Фигура 9D). Доказано е, че свързването на NGAL и NGAL-R може да отдели вътреклетъчното желязо и допълнително да индуцира апоптоза [29], което е свързано със стратегия за изчерпване на желязото на вродената имунна система срещу бактериална инфекция [30]. Ние предложихме, че секретираният mNGAL индуцира апоптоза в 2L3 клетки чрез взаимодействие с NGAL-R, докато несекретираният mNGAL не може да взаимодейства с NGAL-R, за да индуцира апоптоза (Фигура 9A, B). Доказано е, че пътищата Ras/B-Raf/MEK/ERK [10,11] и AKT/mTOR [38] се регулират нагоре в ADPKD клетки, което води до повишена клетъчна пролиферация и уголемяване на кистата. Нашите резултати показват, че секретираният mNGAL инхибира пътищата на ERK (Фигура 8А) и AKT (Фигура 8В), а несекретираният mNGAL инактивира пътя на ERK (Фигура 8А). Това предполага, че умственото дезактивиране на ERK пътя може да не е необходимо чрез NGAL-R. Ще бъде извършен нокаут на NGAL-R в 2L3 клетки, за да се проучи въпросът

В допълнение, свръхекспресията на mNGAL в 2L3 клетки инхибира разширяването на клетъчната киста (Фигура 10) и възниква при относително по-ниска секреция на NGAL (2,27 ng/mL) (Фигура 7J) в сравнение с ефекта с висока концентрация на mNGAL (2 mg/ mL), приложени в предишни експерименти с 3D култура (Фигура 6). Този резултат може да се дължи на липсата на пост-транслационна модификация на mNGAL от Е. coli, която беше използвана в предишни експерименти, което изискваше висока доза mNGAL за инхибиране на разширяването на кистата (Фигура 6). За по-нататъшно изследване дали посттранслационната модификация на mNGAL е факторът, отговорен за изискването за повече рекомбинантен mNGAL от Е. coli, в по-нататъшни изследвания ще бъде използвана кондиционирана среда, включваща mNGAL, секретирана от клетъчна линия на мишка.

В настоящото изследване pN + LS и pN - LS клетки, използвани за RT-qPCR, Western blotting, ELISA, включване на BrdU и 3D култура, са получени от смесен поликлонален пул, който има различни нива на експресия на трансген в смесената популация. Идентифицирането на механизма на mNGAL в ADPKD 2L3 клетки чрез гореописаните методи, използвайки клонални клетки, трябва да помогне при намирането на стратегии за бъдещото клинично лечение на ADPKD.

5. Изводи

В това проучване ние изследвахме основния механизъм на намалена прогресия на кистата в присъствието на NGAL, използвайки обезсмъртена ADPKD клетъчна линия. Добавянето на рекомбинантен mNGAL инхибира клетъчната пролиферация в ADPKD клетки. Патологичният анализ показа, че mNGAL намалява пролиферацията и индуцира апоптоза и пътища на автофагия в ADPKD клетки. Освен това беше създадена платформа за 3D клетъчна култура за идентифициране на прогресията на кистата и показа, че добавянето на рекомбинантен mNGAL инхибира разширяването на кистата. Освен това, свръхекспресията на секретиран mNGAL (pN + LS) има по-силен ефект при инхибиране на разширяването на кистата на ADPKD клетки, отколкото тази на несекретиран mNGAL (pN - LS), въпреки че и двете форми намаляват диаметъра на кистата, площта и процента на кисти с голям размер, както и техните ефекти върху пролиферацията, апоптозата и автофагията. Ние заключаваме, че секретираният mNGAL има по-изразена и последователна способност да инхибира разширяването на кистата, отколкото тази на несекретирания mNGAL в ADPKD клетки. Нашата работа може да помогне да се идентифицират стратегии за бъдещото клинично лечение на ADPKD.

Допълнителни материали: Допълнителни видеоклипове към тази статия могат да бъдат намерени онлайн (1) Видео S1: Изграждане на киста в 3D култура: https://reurl.cc/Kjy8rq (достъп на достъпен на 26 ноември 2021 г.); (2) Видео S2: Z-stack секции на киста в 3D култура: https://reurl.cc/VXGY5y (достъп на достъпен на 26 ноември 2021 г.). Допълнителна графика: отрицателни контроли за Фигура 1D (без LTL и DBA оцветяване) може да се намери онлайн на https://reurl.cc/LpMmje (достъп на достъпен на 26 ноември 2021 г.). Авторски принос: Концептуализация, W.-YJ, HMH-L. и Y.-YC; обработка на данни, H.-YC; формален анализ, H.-YC; придобиване на финансиране, HMH-L. и Y.-YC; методология, H.-YC, W.-YJ, EW, C.-MH, HMH-L. и Y.-YC; администрация на проекта, H.-YC и HMH-L.; ресурси, W.-YJ, S.-TJ и Y.-YC; надзор, HMH-L.; визуализация, H.-YC; писмена оригинална чернова, H.-YC и HMH-L.; писане-преглед и редактиране, H.-YC и HMH-L. Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа. Финансиране: Това изследване е финансирано от безвъзмездни средства 107-2622-B-006-005-CC2 и 108-2622-B-006-002- CC2 от Министерството на науката и технологиите (MOST) и Централата на университетския напредък от Националния университет Cheng Kung, Тайнан, Тайван (Yuan-Yow Chiou). Изявление на институционалния съвет за преглед: Не е приложимо. Изявление за информирано съгласие: Не е приложимо. Изявление за наличност на данни: Данните, генерирани по време на проучването, са достъпни от съответния автор при поискване. Благодарности: Авторите са благодарни за съдействието на Основния център за молекулярни изображения на Националния тайвански нормален университет под егидата на MOST. Благодарим на National RNAi Core Facility в Academia Sinica в Тайван за предоставянето на вирусни частици, плазмиди и свързани услуги. Благодарим на Shu-Wen Lo за помощта с графичното редактиране. Конфликти на интереси: Авторите декларират липса на конфликт на интереси.

Референции

1. Бергман, К.; Guay-Woodford, LM; Харис, PC; Horie, S.; Питърс, DJ; Torres, VE Поликистозна бъбречна болест. Нац. Rev. Dis. Primers 2018, 4, 50. [CrossRef] [PubMed]

2. Grantham, JJ Клинична практика. Автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване. Н. англ. J. Med. 2008, 359, 1477–1485. [CrossRef] [PubMed]

3. Чапман, AB; Devuyst, O.; Eckardt, K.-U.; Gansevoort, RT; Харис, Т.; Horie, S.; Касиске, BL; Одланд, Д.; Pei, Y.; Perrone, RD; et al. Автозомно-доминантно поликистозно бъбречно заболяване (ADPKD): Резюме от конференция за спорове за бъбречно заболяване: Подобряване на глобалните резултати (KDIGO). Kidney Int. 2015, 88, 17–27. [CrossRef] [PubMed]

4. Грантъм, Джей Джей; Mulamalla, S.; Swenson-Fields, KI Защо бъбреците се провалят при автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване. Нац. Нефрол. 2011, 7, 556–566. [CrossRef] [PubMed]

5. Харис, PC; Torres, VE Генетични механизми и сигнални пътища при автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване. J. Clin. разследване. 2014, 124, 2315–2324. [CrossRef] [PubMed]

6. Ong, AC; Harris, PC Полицистин-центричен изглед на образуването на кисти и заболяването: Преглед на полицистините. Kidney Int. 2015, 88, 699–710. [CrossRef]

7. Weimbs, T. Сигнализиране на трети удар при образуване на бъбречна киста. J. Am. Soc. Нефрол. 2011, 22, 793–795. [CrossRef]

8. Ханаока, К.; Guggino, WB cAMP регулира клетъчната пролиферация и образуването на кисти в клетките на автозомно поликистозно бъбречно заболяване. J. Am. Soc. Нефрол. 2000, 11, 1179–1187. [CrossRef]

9. Starremans, P.; Ли, X.; Финърти, П.; Guo, L.; Такакура, А.; Neilson, E.; Zhou, J. Миши модел за поликистозна бъбречна болест чрез соматична делеция в рамката в 5' края на Pkd1. Kidney Int. 2008, 73, 1394–1405. [CrossRef]

10. Ямагучи, Т.; Нагао, С.; Уолъс, DP; Белиби, FA; Cowley, BD; Pelling, JC; Grantham, JJ Cyclic AMP активира B-Raf и ERK в кисти епителни клетки от автозомно-доминантни поликистозни бъбреци. Kidney Int. 2003, 63, 1983–1994. [CrossRef]

11. Ямагучи Джил, Т.; Pelling, JC; Рамасвами, NT; Eppler, JW; Уолъс, DP; Нагао, С.; Рим, Луизиана; Съливан, LP; Grantham, JJ cAMP стимулира in vitro пролиферацията на епителните клетки на бъбречната киста чрез активиране на извънклетъчния сигнал-регулиран киназен път. Kidney Int. 2000, 57, 1460–1471. [CrossRef] [PubMed]

12. Джу, П.; Sieben, CJ; Xu, X.; Харис, PC; Lin, X. Активаторите на автофагията потискат цистогенезата в модел на автозомно доминантно поликистозно бъбречно заболяване. тананикам Mol. Женет. 2016, 26, 158–172. [CrossRef] [PubMed]

13. Белиби, Ф.; Зафар, И.; Равичандран, К.; Segvic, AB; Джани, А.; Любанович, ДГ; Edelstein, CL Хипоксия-индуцируем фактор-1 (HIF-1) и аутофагия при поликистозна бъбречна болест (PKD). Am. J. Physiol.-Ren. Physiol. 2011, 300, F1235–F1243. [CrossRef] [PubMed]

14. Чун, Й.; Ким, Дж. Автофагия: Съществена програма за разграждане за клетъчна хомеостаза и живот. Клетки 2018, 7, 278. [CrossRef]

15. Рубинштейн, DC; Шпилка, Т.; Elazar, Z. Механизми на автофагозомната биогенеза. Curr. Biol. 2012, 22, R29–R34. [CrossRef]

16. Мухопадхяй, С.; Панда, ПК; Синха, Н.; Das, DN; Bhutia, SK Автофагия и апоптоза: Къде се срещат? Апоптоза 2014, 19, 555–566. [CrossRef]